无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49的应用

摘要

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49的应用。本发明的分子量为2657.18 Da，等电点为10.26，其全序列一级结构为ATAWDFGPHGLLPIRPIRIRPLCG的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90作为药物在治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡、减少疤痕产生、加快疤痕修复方面的应用。本发明的分子量为1210.43 Da，等电点为8.29，全序列一级结构为APFRMGICTTN的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49作为药物在治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡、减少疤痕产生、加快疤痕修复方面的应用。本发明的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49能促进皮肤的修复，同时能减少皮肤修复过程中表皮的增生厚度，能够用于制备治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡、减少疤痕产生、加快疤痕修复的药物。

说明书

技术领域：

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及无指盘臭蛙促 皮肤修复多肽AH90和CW49在促进皮肤修复、减少疤痕以及治疗相关皮 肤性疾病中的应用。

背景技术：

皮肤作为机体天然的保护屏障，有机械阻挡病原体的作用。一旦皮肤 的天然屏障作用被损坏，机体就会立即自动开启生理开关进行皮肤的 损伤修复。人体皮肤损伤后的愈合，同时存在上述的组织补充和疤痕 愈合两个过程。上皮细胞由正常皮肤边缘向心性爬行生长，或由皮肤 附属器汗腺、毛囊的上皮向外扩展生长，最后完成创面上皮覆盖。真 皮组织对损伤的反应，是形成肉芽组织，肉芽组织实际上是一种炎症 组织，从细胞学角度来看，肉芽组织包括：新生的毛细血管内皮细胞 ，由局部原始的中胚层细胞分化来的纤维母细胞及其合成物，如胶原 纤维、粘多糖等。疤痕是由肉芽组织发育形成，生长到一定阶段后自 行停止并逐渐吸收消退。一般的创面愈合后半年至一年内瘢痕仍在增 生，其后逐渐吸收平复。但此过程可延续几年、十几年尚不能完成。

无指盘臭蛙为蛙科蛙属的两栖动物，是中国的特有物种。分布于四川 、贵州、云南等地，常生活于中小山溪内植物茂盛以及阴暗潮湿处。 其生存的海拔范围为720至3200米。无指盘臭蛙适应其自生存的自然环 境以及避免受伤等机体损伤，在长期的进化过程中，无指盘臭蛙的皮 肤发展成为具有多种功能的器官，如：分泌大量抗菌肽抵御微生物侵 袭；分泌神经毒素对抗各类天敌；分泌生长因子促进伤口愈合等。

本发明研究的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对皮肤修复功能 ，目前为止尚未有这两种多肽能修复皮肤的公开报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49在制备 治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡、减少疤痕产生、加快疤痕修复药物 中的应用。

本发明的所用的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49采用常规的化 学合成的方法获得；其中：

1. 无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90的分子量为2657.18 Da，等电点 为10.26，其全序列一级结构为ATAWDFGPHGLLPIRPIRIRPLCG。

2、无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49的分子量为1210.43 Da，等电点 为8.29，全序列一级结构为APFRMGICTTN。

本发明的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49在制备治疗体表创伤 、烧伤、皮肤溃疡、减少疤痕产生、加快疤痕修复药物中的应用。

本发明的内容在小鼠的动物模型上试验，其试验方案为常规方法，具 体如下：

I.无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对伤口的愈合作用      

小鼠用2%戊巴比妥钠麻醉后,背部两侧皮肤用剃毛器除毛,酒精消毒后 ,在其后背开两个直径7mm的创口，样品溶解于PBS中（AH的浓度0.05m g/ml，CW浓度为1mg/ml）,每天给药两次，每次30ul。样品加在右侧创 面，左侧创面加相应体积的PBS作阴性对照。每隔两天用相机拍下创面 变化，即DAY0，DAY2，DAY4，DAY6，DAY8直到加药创面完全脱痂愈合 为止。拍照时用量尺比照创口作标尺。最后用作图软件计算创面大小 变化，采用histological score的评分系统评分。

II．无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对真皮、表皮的增生作用 。

A:石蜡切片

1．取材 

将小鼠处死后剪取创面皮肤组织

2．固定 

将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定 液中

3. 洗涤 

材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。 

4. 脱水 

材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、 100% 各2次，每次20min。

5．透明 

纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明 为止）。

6．透蜡 

放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ 透蜡 各50-60分钟。

7. 包埋 

用镊子夹取石蜡模子（金属质地）在酒精灯上稍加热，放在平的 桌 面上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。再将镊子在 酒精灯上 稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。再 放上包埋盒，轻轻倒入 熔蜡。

8. 切片 

①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。 

②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。 

③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。 

④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左 右。 

⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10微米。 

⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡 带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min 。 

⑦切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以 免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下 ，较皱的一面朝上。 

⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或 显微镜下观察切片是否良好。 

⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把 切片机擦拭干净保存。 

9. 展片、贴片 

打开水浴锅，使水温维持在40-45℃，另准备30%乙醇溶液。 

① 切片时，将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。 

② 用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在乙醇溶液的水面上， 使切片展开。 

③小镊子轻轻地将连在一起的切片分开，用一个载玻片将切片完整， 已展开的切片捞至温水中，使之充分展开。 

④ 另取洁净的载玻片，捞起展开的切片，使其位于切片1/3处，另一 端（磨边，粗糙的一端）磨面上标记或贴上标签，放于切片架上。 

10. 脱蜡复水 

将水浴锅温度调至60℃，待水温控制在60℃时，将切片连同切片架放 入一干燥的染色缸内，放入水浴锅中，盖上盖子（可密封），30min至 蜡熔化。之后，石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5min，然后放入100% 、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各3-5min，再放入蒸馏水中3m in。 

B:HE 染色 

1.切片放入苏木精中染色约10-30min。 染色时间应根据染色剂的成 熟程度及室温高低，适当缩短或延长。冬季室温低时放入恒温箱中染 色。

2.水洗 

用自来水流水冲洗15min。使切片颜色变蓝（或放入碱性水中），但要 注意流水不能过大，以防切片脱落。 

3．分化 

将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色，2秒至数十秒钟，见切片变红，颜色 较浅。 

4．漂洗 

切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。 

5．脱水Ⅰ 

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min。 

6、复染  用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min。 

7．脱水Ⅱ 将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙 醇中3-5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。 

8．透明 

切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。

9．封藏：中性树胶封存 

C:表皮厚度计算。

将染色后的切片拍照，最后用软件ImageJ计算表皮厚度，采用histol ogical score的 评分系统评分。

本发明的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49能促进皮肤的修复， 同时能减少皮肤修复过程中表皮的增生厚度，能够用于制备治疗体表 创伤、烧伤、皮肤溃疡的药物。

附图说明：

图1-A、图1-B、图1-C、图1-D、图1-E分别显示0天、2天、4天、6天、 8天无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90对小鼠皮肤损伤模型的对照及治疗 作用。

图2-A、图2-B、图2-C、图2-D、图2-E分别显示0天、2天、4天、6天、 8天无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49对小鼠皮肤损伤模型的对照及治疗 作用。

图3-A、图3-B、图3-C、图3-D、图3-E、图3-F分别为无指盘臭蛙促皮 肤修复多肽AH90对小鼠皮肤的对照及治疗作用切片图。

图4-A、图4-B、图4-C 、图4-D、图4-E、图4-F分别为无指盘臭蛙促 皮肤修复多肽CW49对小鼠皮肤的对照及治疗作用作用切片图。

图5-A、图5-B分别为无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对皮肤愈 合的评分。

图6-A、图6-B分别为无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对表皮增 殖作用。

图7-A、图7-B分别为无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对表皮增 殖评分。

具体实施方式：

本发明的所用的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49采用常规的化 学合成的方法获得；其中：

1. 无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90的分子量为2657.18 Da，等电点 为10.26，其全序列一级结构为ATAWDFGPHGLLPIRPIRIRPLCG。

2、无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49的分子量为1210.43 Da，等电点 为8.29，全序列一级结构为APFRMGICTTN。

本发明的无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49在制备治疗体表创伤 、烧伤、皮肤溃疡药物中的应用。

本发明的内容在小鼠的动物模型上试验，其试验方案为常规方法，具 体步骤同发明 内容部分的描述。

实施例1 ：

无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90对小鼠皮肤损伤模型的修复作用。

取0.05mg/ml无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90进行试验，结果为：能迅 速促进皮肤的修复功能（图1-A、图1-B、图1-C、图1-D、图1-E），第 二天的修复效果比较明显，第四天结痂，第六天基本上完全恢复，并 且和对照小鼠的皮肤修复有明显的差异。

实施例2：

无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49对小鼠皮肤损伤模型的修复作用。

取1mg/ml无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49进行试验，结果为：能迅速 促进皮肤的修复功能（图1-A、图1-B、图1-C、图1-D、图1-E），第二 天的修复效果比较明显，第四天结痂，第八天基本上完全恢复，并且 和对照小鼠的皮肤修复有明显的差异。

实施例3：

无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90对小鼠皮肤修复作用切片图。

小鼠皮肤在恢复的过程中，将每天恢复效果做成切片，观察皮肤表皮 生长情况。图3-A、图3-B、图3-C、图3-D、图3-E、图3-F显示加入AH 90治疗后的第三天肉芽组织形成，第五天表皮组织基本上完全恢复， 第九天治疗组的表皮组织厚度与对照组相比明显减少。

实施例4：

无指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49对小鼠皮肤修复作用切片图。

切片结果表明（图4-A、图4-B、图4-C、图4-D、图4-E、图4-F），无 指盘臭蛙促皮肤修复多肽CW49治疗后第三天形成较厚的增生表皮组织 ，第五天增生的表皮组织厚度减少，第九天表皮厚度恢复正常且有腺 体产生。

实施例5：

无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对肉芽组织愈合的评分。

小鼠皮肤的创伤后涂抹无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49，对每 天小鼠伤口的愈合情况拍照，采用histological score的评分系统对 肉芽组织愈合进行评分。结果表明（图5-A、图5-B），使用无指盘臭 蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49后，肉芽组织愈合的程度和对照有明显 统计学差异（*P<0.01）。

实施例6：

无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对表皮增殖作用。

如图6-A、图6-B所示，小鼠皮肤损伤恢复的过程中表皮的厚度明显增 加，涂抹无 指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49后表皮的厚度增加明显小于对照 组并且和对照组有明显统计学差异（*P<0.01），AH90和CW49具有预防 疤痕产生的作用。

实施例7：

无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49对真皮和表皮增殖评分。

将小鼠皮肤恢复的部位做成切片，然后拍照观察表皮的增殖厚度，采 用histological score的评分系统对皮肤修复进行评分。结果表明（ 图7-A、图7-B），使用指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49表皮和真 皮评分和对照组有显著性的差异。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国科学院昆明动物研究所

 

<120>  无指盘臭蛙促皮肤修复多肽AH90和CW49的应用

 

<130>  1

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  216

<212>  DNA

<213>  Rana grahami

 

<400> 2

AH90

atgttcacct tgaagaaatt cctgttgctc cttttctttc ttgggatcgt ctcctcatct     60

 

ccctgtctta gaaagagaga tgccgatgaa gaaggaaatg aagaaaatgg aggggaagct    120

 

aaaatggaag acataaaaag agcaacagcc tgggacttcg gaccacacgg gctgctacca    180

 

atacgcccta ttcggataag accactttgt ggataa                              216

 

CW49

atgttcacct tgaagaaacc cctgttactc cttttctttc ttggaaccat ctccttatct     60

 

ctctgtgagg aagagaggga tgcagatgaa gaaagaagag atgatgaagt ggaagaaaca    120

 

aaaagagcgc cgtttcgtat gggtatatgt accacaaact ga                       162

 

 

 

<210>  2

<211>  24

<212>  PRT

<213>  Rana grahami

 

<400>  2

 

Ala Thr Ala Trp Asp Phe Gly Pro His Gly Leu Leu Pro Ile Arg Pro

1               5                   10                  15     

 

 

Ile Arg Ile Arg Pro Leu Cys Gly

            20                 

 

CW49

 

Ala Pro Phe Arg Met Gly Ile Cys Thr Thr Asn

1               5                   10