提高疫苗诱导的细胞毒性T细胞反应的治疗性疫苗

摘要

本发明涉及一种用于慢性病毒感染、癌症的预防和治疗的疫苗，尤其是一种提高疫苗诱导的细胞毒性T细胞反应的治疗性疫苗。所述治疗性疫苗的化学组分中含有白介素10（IL10）抑制剂和干扰素γ（IFNγ）。本发明由于联合使用了IL10抑制剂和IFNγ，显著提高细胞毒性T细胞反应，进而可以提高疫苗治疗效率。本发明可免疫正常人群，其优点是在产生保护性抗体的同时，可以比常规疫苗诱导产生更强的细胞毒性T细胞反应，可以更好预防病毒感染或癌症发生；本发明免疫已经慢性感染病毒或癌症病人，可以诱导产生比常规疫苗更多的细胞毒性T细胞，细胞毒性T细胞对清除面型病毒感染细胞和癌细胞起重要作用，因此可以提高治疗型疫苗效率。

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种用于慢性病毒感染、癌症的预防和治疗的疫苗，尤其是一种提高疫苗诱导的细胞毒性T细胞反应的治疗性疫苗。

背景技术

慢性感染某些病毒可以引起癌症。感染人乳头瘤病毒可以引起宫颈癌，而乙型肝炎感染与肝癌的发生有关。虽然预防慢性病毒感染的疫苗，如乙型肝炎病毒（HBV）疫苗，人乳头瘤病毒疫苗（HPV）已经在临床应用，但是针对已经感染慢性病毒病人的治疗性疫苗研究，仍然处于起步阶段，疫苗诱导的细胞毒性T细胞不足以杀死病毒感染细胞或癌细胞。

慢性病毒感染可以抑制固有和特异性免疫反应，而影响治疗性疫苗的效率。例如：病毒特异性调节T细胞可影响疫苗特异性细胞毒性T细胞（CTL）的产生和治疗效果。HPV 核壳蛋白L1诱导产生分泌白介素10的L1特异性调节T细胞。HPV早期蛋白E7，E6 特异性调节T细胞存在于病人体内。病毒蛋白如HPV 16 E5 蛋白可以减少MHC I分子在感染细胞膜上的表达；HPV16 E7 蛋白影响干扰素的激活，HPV16 感染部位白介素10（IL10），转移生长因子β（TGFβ）水平升高，这些因素均可降低CTL对病毒感染细胞的杀伤作用。因此，有效的HPV治疗性疫苗依赖于以下3个因素: 1、在HPV感染者体内诱导产生高质，足够的CTL细胞和其它效应T细胞；2、吸引CTL细胞到病毒感染部位；3、CTL细胞克服病毒感染部位的免疫抑制因素，杀伤病毒感染细胞。

    病毒抗原暴露的小鼠抑制治疗性疫苗CTL反应：患者感染病毒后，常常产生对病毒抗原的无效的体液或/和细胞免疫反应。慢性乳头瘤病毒感染病人产生针对早期蛋白E6，E7和晚期蛋白L1的细胞和体液免疫反应。而乳头瘤病毒治疗性疫苗常常使用E7，E6和L1基因或基因产物治疗慢性乳头瘤病毒感染者。因此，非常有必要研究慢性病毒感染个体中对病毒抗原已有的免疫性对治疗性疫苗的影响。PV L1核壳蛋白（L1VLPs）致敏（primed)的小鼠，在接种携带HPV16E7 CTL，人免疫缺陷病毒（HIV）CTL 决定簇的PV嵌和型L1的蛋白（L1E7，L1P18）治疗性疫苗后，与未致敏小鼠相比，其E7，HIV P18特异性的CTL细胞分泌IFNγ受到抑制（参见图1，图中表明，HPV病毒蛋白致敏的个体对治疗性疫苗的反应与幼稚（naive）个体不同）。 

阻断IL10可以增强治疗性疫苗的CTL反应。如果PV L1蛋白致敏（primed) 的小鼠是IL10缺陷鼠，在接种携带HPV16E7 CTL 决定簇的PV嵌和型L1的蛋白治疗性疫苗后，与未致敏小鼠相比，其E7特异性的CTL细胞产生IFNγ则不受到抑制。如果在免疫致敏小鼠时同时阻断IL10，E7 特异性CTL也不受到抑制（参见图2A）。

使用另外一抗原系统卵蛋白/脂多糖（OVA/LPS），重复了上述结果（参见图2B）。IL10与LCMV（lymphocytic choriomeningitis），西尼罗河病毒（West Nile Virus）病毒感染的清除密切相关。DNA疫苗免疫时阻断IL10，可以提高疫苗诱导的T细胞反应，清除小鼠LCMV病毒感染。

综上所述，IL10 与慢性病毒感染密切相关，治疗性疫苗如果在免疫时阻断IL10，可以提高疫苗诱导的T细胞反应，清除慢性病毒感染，阻断宫颈癌的发生。

抗原特异性的，分泌IL10、IFNγ的CD4+ T细胞可能抑制致敏小鼠对治疗性疫苗的CTL反应。如果用特异性抗体将PV核壳蛋白致敏的小鼠体内的CD4+T细胞删除，让新生CD4+T细胞在体内重新出现后免疫小鼠，治疗性疫苗诱导的CTL分泌IFNγ反应则不受抑制；体外实验显示，PV核壳蛋白致敏的CD4+T细胞在受到抗原刺激后，分泌大量IL10，这些细胞表达膜GITR（Glucocorticoid induced TNF receptor related protein）（参见图3A）。OVA/LPS致敏的小鼠CD4也分泌IL10，表达GITR（参见图3B）。

上述结果表明，致敏小鼠对治疗性疫苗的CTL反应的IL10由抗原特异性的CD4+GITR+T 细胞分泌。这些细胞同时还分泌 IFNγ。致敏小鼠如果是IFNγ受体缺陷小鼠，对治疗性疫苗的CTL反应也不受抑制。体外实验显示，IFNγ促进抗原特异性CD4+GITR+T细胞分泌IL10。

发明内容

本发明旨在解决慢性病毒感染者对现有预防慢性病毒感染疫苗存在抑制固有和特异性免疫反应，影响治疗性疫苗效率的问题，而提供一种可以提高细胞毒性T细胞数量，最终提高疫苗治疗效率的提高疫苗诱导的细胞毒性T细胞反应的治疗性疫苗。

本发明解决所述问题采用的技术方案是：

一种提高疫苗诱导的细胞毒性T细胞反应的治疗性疫苗，其化学组分中含有白介素10（IL10）抑制剂和干扰素γ（IFNγ）。

更进一步：

所述IL10抑制剂含量可以是1pg-10g。

所述IFNγ含量是可以1pg-10g。

所述IL10抑制剂是可以抑制IL10功能的抗体、siRNA或特异性多肽、RNA 或 DNA。

所述IFNγ可以是蛋白、RNA或DNA。

所述治疗性疫苗的化学组分中可以含有抗原或/和佐剂。

所述抗原可以是蛋白质、病毒样颗粒、多肽、DNA 或 RNA。

所述佐剂是任何可以提高特异或非特异免疫反应的试剂。

与现有技术相比，本发明所述治疗性疫苗在免疫时，由于联合使用了IL10抑制剂和IFNγ，显著提高细胞毒性T细胞反应，进而可以提高疫苗治疗效率。本发明可免疫正常人群，用于预防慢性病毒感染和癌症。其优点是在产生保护性抗体的同时，可以比常规疫苗诱导产生更强的细胞毒性T细胞反应，可以更好预防病毒感染或癌症发生。本发明免疫已经慢性感染病毒或癌症病人，可以诱导产生比常规疫苗更多的细胞毒性T细胞，细胞毒性T细胞对清除面型病毒感染细胞和癌细胞起重要作用，因此可以提高治疗型疫苗效率。

附图说明

图1是L1VLPs敏的小鼠抑制嵌合型L1VLPs的CTL应答示意图。

图中：A：L1P18 VLPs；B：L1E7VLPs。

图2是治疗性疫苗和并中和IL10免疫抗原致敏小鼠，提高疫苗诱导的CTL应答示意图。

图中：A：乳头瘤病毒核壳蛋白抗原系统；B：OVA/LPS抗原系统。

图3是抗原特异性CD4+GITR+T细胞分泌IL10示意图。

图中：A：乳头瘤病毒核壳蛋白抗原系统；B；OVA/LPS抗原系统。

图4是本发明提高CTL反应示意图。

图5 是本发明GO吸附的抗IL10受体抗体，IFNγ提高OVA/LPS刺激的免疫反应示意图。

具体实施方式

以下结合实施例进一步阐述本发明，目的仅在于更好地理解本发明内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围。

实施例1. 抗IL10受体抗体(IL10抑制剂)2μg，与不同剂量的IFNγ（0.001ng, 0.01,0.1,1ng)溶于PBS缓冲液中，联和使用，可以比单独使用抗IL10受体抗体，IFNγ加20ng脂多糖（LPS）（佐剂）诱导的2x10⁵小鼠脾脏树突状细胞产生的IL12的分泌显著增加（参图4A），表明这一方法有利于提高细胞毒性T细胞反应，提示对肿瘤，慢性病毒感染者有较好的治疗作用。

实施例2. 使用50μg OVA/15μg LPS腹腔致敏小鼠，7天后使用溶于PBS缓冲液中50μg OVA/15μg LPS/500μg抗IL10受体抗体/5μg IFNγ/ （抗原/佐剂/IL10抑制剂/IFNγ）腹腔免疫小鼠，6天后使用ELISPOT方法检测OVA特异性的细胞毒性T细胞反应，结果显示，免疫时联合使用抗IL10受体抗体和IFNγ，比单独免疫时使用500μg抗IL10受体抗体(IL10抑制剂)，显著提高细胞毒性T细胞反应（参见图4B），对肿瘤，慢性病毒感染者有较好治疗作用。

实施例3. 使用纳米材料 Graphene Oxide吸附抗IL10受体抗体 和IFNγ。PBS溶液中GO/anti-IL10受体抗体/IFNγ（GO30μg, anti-IL10受体抗体 15μg,IFNγ10ng）明显促进20ng LPS诱导的脾树突状细胞表面CD86表达，树突状细胞CD86表达增高，有助于其诱导细胞毒性T细胞的产生。提示对肿瘤，慢性病毒感染者有较好的治疗作用。

实施例4. 使用纳米材料 Graphene Oxide吸附抗IL10受体抗体和IFNγ。PBS溶液中的GO/anti-IL10受体抗体/IFNγ（GO30μg，anti-IL10受体抗体 15μg，IFNγ 10ng）明显促进LPS诱导的脾细胞分泌IL12（参见图5A）。用溶于PBS中的50ug OVA/15ug LPS联合GO/anti-IL10受体抗体/IFNγ（抗原/佐剂/IL10抑制剂/IFNγ）皮下免疫OVA/LPS致敏的小鼠，7天后取引流淋巴结，制成单个细胞后用100ug/ml OVA刺激，18小时取上清做IFNγELISA。结果显示，GO吸附抗IL10受体抗体、IFNγ后，OVA特异性IFNγ分泌明显提高。提示对肿瘤，慢性病毒感染者有较好的治疗作用。

实施例5. 抗IL10受体抗体 500μg, 5μg IFNγ，50μg病毒抗原乳头瘤病毒样颗粒溶于PBS缓冲液联和使用（IL10抑制剂/ IFNγ/病毒样颗粒），可以比50μg病毒抗原乳头瘤病毒样颗粒单独使用诱导更多细胞毒性T细胞反应。对慢性乳头瘤病毒感染，宫颈癌有较好的治疗作用。

实施例6. 抗IL10受体抗体 500μg，5μg IFNγ，10μg含肿瘤抗原HPV16 E7质粒DNA溶于PBS缓冲液联和使用（IL10抑制剂/ IFNγ/质粒），可以比10μg含肿瘤抗原HPV16 E7质粒DNA单独使用，诱导更强的细胞毒性T细胞反应，对慢性乳头瘤病毒感染，宫颈癌有较好的治疗作用。