一种超高活力羊细管精液冷冻方法

摘要

本发明涉及羊精液冷冻方法，具体为一种超高活力羊细管精液冷冻方法。本发明解决了现有羊冷冻精液解冻后活率和活力低且冷冻效果不稳定的问题。一种超高活力羊细管精液冷冻方法包括如下步骤：吸取羊新鲜精液注入装有清洗液的第一离心管底部，在CO

说明书

技术领域

本发明涉及羊精液的冷冻方法，具体为一种超高活力羊细管精液冷冻方法。

背景技术

羊冷冻精液的研究国外起始于20世纪30年代，我国起始于1978年，但到目前为止仍未形成成熟稳定的程序化冷冻技术。羊的精子和鸡、牛精子相比更加脆弱，在冷冻、解冻过程极易形成损伤，从而失去受精能力；虽然用于冷冻的精液要求冷冻前活率达到0.8以上，但因不同公羊个体差异所产生的精子活力不同，精子冷冻效果很不稳定。同时，现有羊冷冻精液解冻后活率低于0.35且存在很多“衰老”精子和弱死精子，有效精子少，活力低，质量差。羊冷冻精液在我国辽宁、贵州有少量生产，2008年山西省岢岚县引进部分羊冷冻精液，人工授精后妊娠率不足30%，无法进行批量生产。

发明内容

本发明为了解决现有羊冷冻精液活率和活力低且冷冻效果不稳定的问题，提供了一种超高活力羊细管精液冷冻方法。

本发明是采用如下技术方案实现的：一种超高活力羊细管精液冷冻方法包括如下步骤：

（1）羊精子冷冻前高活力筛选：

 哺乳动物的精液中含有处于不同成熟阶段的精子，这是自然交配过程中克服不同时间排卵对受精造成影响的一种适应；精液中除高活力的健康精子外，还有成熟过度的“衰老”精子和弱死精子，这样不经筛选的精子会对体外受精造成不良影响。另外鲜精的精液中还会含有一些副性腺分泌的用于交配时阴道润滑和稀释阴道酸度等物质以及一些代谢产物，这些非必需物质和有害物质都要去除。精子清洗就是精子筛选与有害物质去除的过程，即把清洗液加入鲜精中，经过精子上游、离心等方法除去精清、死精、弱精，以获得高密度、高质量和高活力的精子。首先配制清洗液：在100000份双蒸水中加入氯化钾（KCl ）21.0 份，氯化钠（NaCl）653.0份，一水磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O）6.2份，碳酸氢钠（NaHCO₃）209.0份，乳酸钠（C₃H₅NaO₃）11.0 份，六水氯化镁（MgCl₂·6H₂O）9.0份，Hepes缓冲盐122.0份，丙酸钠（C₃H₅NaO₂）10.5份，葡萄糖（C₆H₁₂O₆）255.0 份，牛血清白蛋白600份混合均匀即得清洗液；此时清洗液pH=6.8-7.3，渗透压295-310 mosm；接着将清洗液装入第一支无菌离心管在CO₂培养箱中预平衡2h；

 从CO₂培养箱中取出第一支无菌离心管，用吸管从集精杯吸出羊精液注入第一支无菌离心管底部，将第一支无菌离心管45°倾斜置于管架上放入CO₂培养箱中静置30-60min，此时死弱精子停留在第一支无菌离心管的下部，而活力强的精子游上来进入第一支无菌离心管的上清液中；

 从CO₂培养箱中取出第一支无菌离心管，吸取第一支无菌离心管的上清液注入第二支无菌离心管中，2000-2500r/min离心5-8 min，弃掉上清液，此时第二支无菌离心管底部的液滴中富含密集的高活力精子，从而得到高活力精液。

（2）把上述筛选得到的高活力精液加入冷冻稀释液中旋转摇匀，灌装保存均采用如下现有方法：用细管灌装机灌装到0.25 ml精液细管中，并保证每支精液细管中精子的数量不少于1×10⁸个；然后将灌装好的羊精液细管放置在4℃冷柜中低温平衡2-4h，用程序冷冻仪进行细管精液冷冻，冷冻完成后将精液细管移入液氮罐中保存。所述冷冻稀释液为本领域技术人员所熟知的。

（3）输精前解冻采用如下现有方法：从液氮罐内取出羊精液细管迅速放入盛有40-45℃温水的容器中，顺时针或逆时针方向摇动细管5-8s，待细管内精液溶化成透明状时取出，用干燥的灭菌纱布擦干羊精液细管外壁，取1滴在显微镜下检查活力合格后，即可用于输精。

进一步说明，冷冻稀释液是由如下步骤制备而成的：I 、取Tris 2.7 g，葡萄糖1.0 g，果糖1.0 g，柠檬酸钠2.6 g，新鲜卵黄20 ml，棉子糖0.51 g，加蒸馏水至100 ml，得到I液；II、 取I液93ml，加入甘油7 ml、青霉素10万IU、链霉素10万IU，混合均匀后得到冷冻稀释液；从而更好地起到冷冻保护和抗菌作用。

将本发明得到的羊冷冻精液与现有的羊冷冻精液进行顶体完整率、质膜完整率、生存指数、过氧化氢酶（CAT）活性、脂质过氧化反应丙二醛（MDA）含量的指标测试，结果如下表1所示：

表1  羊冷冻精液相关指标测试结果

 MDA(nmol/ml)CAT(U/ml)顶体完整率 (%)质膜完整率(%)生存指数现有羊冷冻精液37.09±6.58 b1.87±0.24b39.75±1.58b19.97±1.36b1.17±0.10b本发明羊冷冻精液10.10±1.91 a 4.16±0.38a50.15±0.90a51.76±1.92a1.39±0.04a

从上表1可以看出：本发明得到的羊冷冻精液中精子的顶体完整率、质膜完整率、生存指数和过氧化氢酶（CAT）活性显著高于现有羊冷冻精液（P＜0.01），脂质过氧化反应丙二醛（MDA）含量显著低于现有羊冷冻精液（P＜0.01）；说明本发明经过活力筛选后得到的羊冷冻精液中精子具有更好的抗冻、抗氧化效果，具有更强的生存能力和受精能力。

2011年9月-12月在山西省右玉县宏宇牧业有限责任公司优种肉羊良种繁育基地进行人工授精试验，分别选取品种、年龄、体重相同的繁殖母羊260只，试验组和对照组各130只，试验组用本发明得到的羊冷冻精液而对照组用现有的羊冷冻精液，解冻方法和输精剂量均相同，三个情期不返情认定妊娠。实验结果表明，试验组妊娠率达51.5%，而对照组妊娠率为36.9%，结果差异极显著。

用本发明所述方法进行冷冻前羊精子高活力筛选后，去除了“衰老”精子、弱死精子和精液中非必需物质及有害物质从而获得高活力精子，羊细管冷冻精液冷冻前的活率为0.8以上，解冻后活率为0.45-0.60，完全满足羊冷冻精液人工授精的要求，大幅度提高了解冻后精子的活率与活力并保证了精子解冻后活率与活力的稳定性；提高了羊冷冻精液人工授精的妊娠率，大大提高了冷冻精液的质量；同时用于羊精子活力筛选的清洗液既保证了精子代谢的必需营养物质，又优化了pH值和渗透压，减小了筛选过程对精子造成的损伤；解决了现有羊冷冻精液解冻后活率和活力低，且冷冻效果不稳定的问题，可广泛适用于羊批量生产中。

具体实施方式

一种超高活力羊细管精液冷冻方法，包括如下步骤：

（1）羊精子冷冻前高活力筛选：

 首先配制清洗液：在100000份双蒸水中加入氯化钾（KCl ）21.0 份，氯化钠（NaCl）653.0份，一水磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O）6.2份，碳酸氢钠（NaHCO₃）209.0份，乳酸钠（C₃H₅NaO₃）11.0 份，六水氯化镁（MgCl₂·6H₂O）9.0份，Hepes缓冲盐122.0份，丙酸钠（C₃H₅NaO₂）10.5份，葡萄糖（C₆H₁₂O₆）255.0 份，牛血清白蛋白600份混合均匀后得到清洗液；将清洗液装入第一支无菌离心管在CO₂培养箱中预平衡2h；

 从CO₂培养箱中取出第一支无菌离心管，用吸管从集精杯吸出羊精液注入第一支无菌离心管底部，将第一支无菌离心管45°倾斜置于管架上，放入CO₂培养箱中静置30-60min（30 min、45 min、60 min），此时死弱精子停留在第一支无菌离心管的下部，而活力强的精子游上来进入第一支无菌离心管的上清液中；

 从CO₂培养箱中取出第一支无菌离心管，用吸管吸取第一支无菌离心管的上清液注入第二支无菌离心管中，2000-2500 r/min（2000 r/min 、2250 r/min 、2500 r/min）离心5-8min（5 min、7 min、8min），弃掉上清液，此时第二支无菌离心管底部的液滴中富含密集的高活力精子，从而得到高活力精液；

（2） 按如下步骤制备冷冻稀释液：I、取Tris 2.7 g，葡萄糖1.0 g，果糖1.0 g，柠檬酸钠2.6 g，新鲜卵黄20 ml，棉子糖0.51 g，加蒸馏水至100 ml，得到I液；II、取I液93 ml，加入甘油7 ml、青霉素10万IU、链霉素10万IU，混合均匀后得到冷冻稀释液；将上述高活力精液加入冷冻稀释液中混合均匀后用细管灌装机灌装到0.25ml细管中进行冷冻保存；

（3）输精前解冻。