彻底降解面粉中谷蛋白的微生物方法

摘要

本发明涉及用选定乳酸菌和真菌酶彻底降解面包小麦粉和硬粒小麦粉、大麦粉、黑麦粉和燕麦粉中的谷蛋白。尤其是，本发明涉及用选定乳酸菌和真菌酶彻底降解谷物粉中的谷蛋白(残余谷蛋白浓度低于20ppm)，脱毒后的谷物粉可用于按照标准生物方法生产各种无谷蛋白食品。

说明书

本发明涉及彻底降解面粉中谷蛋白(gluten谷蛋白)的微生物技术。具体地说， 本发明方法选用发酵类烘焙产品生产常用的乳酸菌和真菌蛋白酶在液体发酵条件下 实现的谷蛋白的彻底降解(残余谷蛋白浓度低于20ppm)。发酵过程产生的谷物粉可 作为原料用于生产无谷蛋白食物，供乳糜泻患者食用。生产无谷蛋白食物的现有方法 采用天然无谷蛋白或经提取而无谷蛋白的原料，与之相比，本发明提出的生物技术方 法具有诸多经济、社会、营养和感官上的优点。

流行病谷蛋白不耐或乳糜泻越来越多发。最近一次在欧洲和美国人中进行的普查 报道的发病率是1/100受影响个体(Rewers，2005.乳糜泻的流行病学；乳糜泻的 流行性、发病率和发展。胃肠病学(Gastroenterology)，128：47-51)。据目前 所知，专门针对这一饮食不耐的有效疗法是终身严格遵守完全无谷蛋白饮食(Hamer， 2005.乳糜泻：背景及其生物化学内容。生物技术发展(Biotechnol Advanc)， 23：401-408)。例如，已知可用乳酸菌由无谷蛋白面粉制作烘焙产品(More等，谷 物化学(Cereal Chemistry)，美国谷物化学家协会(American Association of  Cereal Chemists)。Minneapolis，US，vol.84，no.4，1-1-2007，pp. 357-364和Moore等，欧洲食物研究与技术(European Food Research和 Technology)，vol.226，6-6-2007，pp.1309-1316)。然而，无谷蛋白饮 食也有明显的缺点。它很昂贵，与谷物产品相比，无谷蛋白产品的感官性品质较差， 且不易保存，这种饮食很难严格遵守，需要营养师的长期监管，还包括因食物中彻底 不含谷物造成的营养失衡(例如纤维素、矿物质和维生素)(Grehn等，2001.接受 10年无谷蛋白饮食治疗的瑞典成年乳糜泻患者的饮食习惯。Scand J Nutr 45： 178-182；Mariani等，1998.无谷蛋白饮食：未成年乳糜泻患者的营养风险， 儿科胃肠道营养学杂志(J Pediart Gastroenterol Nut)27：519-523； Thompson等，2005.无谷蛋白饮食研究：美国乳糜泻患者是否摄入量推荐量的纤 维素、铁、钙和谷类？人类营养与饮食杂志(J.Human.Nutr.Diet.)18：163-169) 。并且，某些病例(例如“顽固性乳糜泻”)中，即使完全奉行无谷蛋白饮食也无法 完全恢复肠道功能(Sollid和Khosla，2004.乳糜泻的未来治疗方法之选。胃肠 道和肝脏科(Gastroenterol.Hepatol.)2：140-147)。在无谷蛋白饮食的替代 疗法中，许多研究利用了目前关于毒性表位序列的已知信息，并且考虑到了采用微生 物酶例如脯氨酰内肽酶(PEPs)水解这些多肽。微生物酶已被提议作为饮食补充 (Shan等，2004.三种细菌脯氨酰内肽酶的比较生物化学分析：乳糜泻处方。生物 化学杂志(Biochem.J.)383：311-318)，和/或者用于谷蛋白的体外(in vitro) 脱毒(Chen等，2003.瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)PePO2的鉴 定与表征，一种具有后脯氨酸特异性的内肽酶。应用环境学会微生物学(Appl. Environ.Microbiol.)69：1276-1282；Stepniak等，2005。采用新脯氨酰 内肽酶的高效谷蛋白降解：乳糜泻的处方。美国生理学胃肠道学和肝脏生理学杂志(Am. J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.)291：G621-G629)。

专利申请WO2008/010252和Cagno等.(食物保护杂志(Journal of Food  Protection)，vol.71，no.7，2008，pp.1491-1495)记载的方法用无谷蛋 白面粉制作烘焙产品并试图改善无谷蛋白原料制得产品的营养、感官和保存性品质。

在近几十年中，发酵烘焙产品的生物技术也发生了相当的改变，对整个原谷蛋白 类饮食群体的营养习惯产生了影响。现在，发酵烘焙产品的生产技术极其迅速(例如， 采用化学发酵剂或采用烘焙酵母(baker′s yeast))，完全取代了采用野生乳酸菌 和天然材料来源并用作酵头(“sourdough”)的酵母进行的缓慢发酵过程。采用目 前的方法，谷物组分(例如蛋白质)在食物加工过程中不受任何水解作用，保留了天然 原料的特征(Gobbetti，1998.酸酵头中的微生物群：乳酸菌与酵母之间的相互作 用。食品科学与技术趋势(Trends Food Sci.Technol.)9：267-274)。基于 这些考虑并利用了选定乳酸菌的混合物所具有的酶性潜能，许多研究(Di Cagno等， 2002.利用酸酵头乳酸菌的蛋白水解：对人谷物不耐相关麦粉蛋白和麦醇溶蛋白肽 的作用。应用环境与微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)68：623-633；Di  Cagno等，2004。乳糜泻患者能够耐受用无毒麦粉并用选定乳杆菌起酵制作的老酵 面包。应用环境与微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)70：1088-1096；Di Cagno等，2005。用硬粒小麦面及精制麦麸制作的意大利面是可用于降低谷蛋白不 耐的手段之一。农业与食品化学杂志(J.Agr.Food Chem.)53：4393-4402；De  Angelis等，2005.VSL#3益生菌制剂能够水解造成乳糜泻的麦醇溶蛋白多肽。 生物化学和生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta.)1762：80-93)显示： 采用传统生物技术，基于选定乳酸菌和长时间发酵，可以将初始谷蛋白浓度显著降低 。

已为WHO(世界卫生组织)和FAO(食品与农业组织)采纳的国际食品标准 (Codex Alimentarius)对“无谷蛋白产品”和“无谷蛋白制造的产品”进行了区 分，前者为所含成分的谷蛋白浓度低于20ppm，后者为残余谷蛋白浓度低于200ppm 。然而，多项研究(这些研究导致了“醇溶谷蛋白工作组(Prolamins Working Group) ”相关指导意见的颁布)提出：任何情况下都需要维持谷蛋白的阈值低于20ppm (Stern等，2001.乳糜泻中谷蛋白的临床影响的研究。欧洲胃肠道肝脏科杂志(Eur. J.Gastroenterol.Hepatol.)13：741-747)。最近的一项研究(Rizzello 等，2007.在食物加工过程中用乳杆菌和真菌蛋白酶高效降解谷蛋白：乳糜泻的新 希望。应用环境与微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)73：4499-4507)考 虑在半液体揉合条件下采用由10种选定乳酸菌构成的复杂混合物、真菌蛋白酶和长 时间发酵(48小时，37℃)。据电泳、色谱和免疫学分析，麦粉中的谷蛋白被降解到 了低于20ppm阈值的浓度。

此外，专利申请WO2006/097415记载了一种降解谷蛋白的方法，与上述研究 相似，该方法采用由至少6种乳酸菌和/或双歧杆菌构成的复杂混合物和长时间发酵 (24-31小时)。然而，该方法不适用于将谷蛋白彻底降解，因此不能用于乳糜泻患 者。事实上，WO2006/097415的图1B显示：微生物水解后，仍有未降解麦醇溶蛋 白斑点清晰可见，表2也证实了这一点，由此可见，虽然部分麦醇溶蛋白被部分水解， 另一些则对水解不敏感。

根据文献和现有数据，有些问题对于由脱毒谷物粉制作无谷蛋白食品而言似乎尤 其需要重视：(i)简化用于降解过程的选定乳酸菌的组成；(ii)极大缩短发酵时间 以适应产业化应用所需；(iii)验证乳酸菌和真菌酶有效作用于不同种类硬粒小麦 (durum wheat)粉和面包小麦粉以及大麦粉、黑麦粉和燕麦粉的能力；(iv)提供 水解谷蛋白的生物技术方法，从而使得脱毒谷物粉能够用于生产可用的无谷蛋白产品 ；和(v)通过体内(in vivo)和长期医学实验来验证乳糜泻患者在长期食用由脱毒 小麦粉制成的无谷蛋白产品后的绝对耐受性。

鉴于以上所述，显然需要合适的原料和方法用于由脱毒谷物粉制作无谷蛋白烘焙 产品，一方面消除现有文献和数据中经济、社会、营养和感官评价等方面的缺点，另 一方面消除现有无谷蛋白商品的缺点。

本发明的作者发现：只用两种乳酸菌，与真菌蛋白酶组合，降解谷蛋白所需的发 酵时间显著缩短。并且，本发明证明了乳酸菌和真菌蛋白酶彻底降解不同种类硬粒小 麦和面包小麦、大麦、黑麦和燕麦面粉来源谷蛋白的能力；提供了一种用脱毒小麦粉 制作各种发酵烘焙产品的生物技术方法；并且验证了乳糜泻患者对产品的绝对耐受 性，由此以一种全新的方式使得小麦粉能够用作制作无谷蛋白发酵烘焙产品的原料。

本发明的乳酸菌属于乳杆菌属(Lactobacillus)，分离自制作南意大利面包所 用的“酵头”。旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)DPPMA12(保 藏号：DSMZ N.DSM22063，保藏日：2008年11月28日)和胚芽乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)DPPMA125(保藏号：DSMZ N.DSM22064，保 藏日：2008年11月28日)。

本发明对一种生产无谷蛋白发酵烘焙产品(残余谷蛋白含量低于20ppm)的生物 技术方法进行了标准化和优化，该方案涉及用选定的乳酸菌和真菌蛋白酶对 20-50％(重量)的谷物粉水悬浮液进行极快速的发酵(12-20小时，30-37℃)，然 后，按照根据所需特性确定的百分比，将它们作为用烘焙酵母进行的短期(约1-3小 时)发酵的成分之一。

以下概述的是一种由脱毒无谷蛋白小麦粉生产发酵烘焙产品的生物技术方法。

按照配方之一，给乳糜泻患者每日食用含10g当量初始谷蛋白的烘焙产品，连 续60天。免疫化学和组织学试验证明对脱毒无谷蛋白面粉的制品完全耐受。

根据用电泳、色谱和免疫学技术进行的补充分析，本发明用选定乳酸菌—从未用 于此前的研究—与真菌蛋白酶进行的发酵能够：(i)实现彻底的谷蛋白脱毒(残余谷 蛋白含量低于20ppm)；(ii)生产出由低分子量肽和特别是，氨基酸(约15.000 mg/kg，而小麦粉中＜1000mg/kg)的混合物构成的水解面粉，由此，相对传统无 谷蛋白产品而言提高了面粉的营养水平；(iii)与文献报道的数据相比显著缩短加工 时间，由此使得所述加工过程适合于产业规模即大规模发酵；(iv)用不同浓度 (20-50％)的脱毒小麦粉生产不同配方的无谷蛋白烘焙产品；和(v)根据在此首次公 开的医学数据，实现了乳糜泻患者长期食用后对制品的完全耐受。

本发明方法制得的产品具有更好的感官品种、流变学特征和化学特征，是现有产 品(用天然无谷蛋白面粉制得的无谷蛋白产品)所无法提供的。事实上，本发明产品保 留了含谷蛋白面粉的营养品质，因此，相比用无谷蛋白面粉制得的产品具有更高的营 养品质。

并且，由于采用了创造性乳酸菌进行的谷蛋白降解，本发明产品完全无谷蛋白， 或者相对于用已知乳酸菌(WO2006/097415，WO 2008/010252)获得的产品相比 是完全无谷蛋白的。在本发明乳酸菌所用的相同条件下使用WO 2008/010252所述 的乳酸菌，发现其不适合用于谷蛋白降解，实测残余谷蛋白含量约6000-10000ppm (图5)。所以，所述乳酸菌只能用于去除微量谷蛋白杂志，但不具备本发明中乳酸菌 的性能。

至于Rizzello等的文章(应用环境与微生物学(Appl.Environ. Microbiol.)73：4499-4507，2007)，可以用非常短的时间(18小时，相比48 小时)实现彻底的谷蛋白降解首次提示：显著的技术优势使得转化过程堪比烘焙产品 的最常用最普遍的方法。太长(48小时)的发酵过程，不仅提高技术成本，而且会造 成卫生风险。并且，更快的谷蛋白降解将不可避免地产生具有不同游离氨基酸组成的 原料(谷蛋白被彻底降解的面粉)，由此适合生产不同感官性品质的无谷蛋白产品，如 同势必具有不同酶动力学特征的长时间发酵。

因此，本发明内容之一是包含旧金山乳杆菌DSM22063和胚芽乳杆菌DSM  22064或由它们组成的混合物。所述混合物还可以包含真菌蛋白水解酶，例如米曲霉 (Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)的蛋白酶或它们的混 合物。

本发明还包括上述混合物用于彻底降解面包小麦(bread wheat)和硬粒小麦 粉，以及大麦粉、黑麦粉和燕麦粉中的谷蛋白。

本发明还涉及一种制作谷蛋白彻底降解的、适用于生产发酵无谷蛋白产品的液体 面团(liquid dough)的方法，包括以下步骤：

a)培养扩增旧金山乳杆菌DSM22063和胚芽乳杆菌DSM 22064；

b)将面粉与水混合，面粉的浓度为20-50％，以30％为佳，水的浓度为50-80％ 以70％为佳，水中含有步骤a)所述两种乳酸菌的混合物，细胞密度约10⁸cfu/g；

c)加入一种或多种真菌蛋白酶，各自度为200-500ppm，以400ppm为佳；

d)30-37℃发酵8-20小时，以12小时为佳。

所述方法还可以包括步骤e)：对步骤d)所得液体面团进行干燥。适合所述方法 的面粉包括面包小麦粉和硬粒小麦粉，以及大麦粉、黑麦粉、燕麦粉，或是它们的混 合物，优选面包小麦粉和硬粒小麦粉。

真菌蛋白水解酶可选自：米曲霉蛋白酶、黑曲霉蛋白酶或它们的混合物。

所以，本发明还涉及一种液体面团或干面团，其中的谷蛋白经上述方法彻底降解 。

本发明还包括一种包含或由以下物质构成的混合物：上述面团和一种或多种天然 无谷蛋白面粉，后者例如：天然玉米粉、白玉米粉、稻米粉、藜谷粉、苔麩(teff) 粉或籽粒苋(amaranth)粉和乔麦粉。具体地说，上述面粉可按以下百分比使用：天 然玉米5-15％，以10％为佳，白玉米5-15％，以10％为佳，稻米、藜谷、苔麩或籽 粒苋10-30％，以20％为佳，乔麦粉1-10％，以5％为佳，所述本发明为重量百分比， 以面粉组合物的总重为基数。基于脱毒小麦粉的无谷蛋白烘焙产品配方中可加入的其 它成分还包括，例如糖、黄油、鸡蛋和动物液体油脂(animal liquid cream).

本发明还包括一种用上述方法的所述谷蛋白脱毒面粉制作发酵烘焙产品的方法， 其包括或由以下步骤构成：

a)如同前述方法中所述将天然无谷蛋白面粉10-40％(以30％为佳)、烘焙酵母 1-2％、盐0.1-1.0％和造型剂(structuring agents)0.5-1％的混合物加入谷蛋 白脱毒液体面团后揉合；

b)30℃任其发酵约1-3小时，以1.5为佳；

c)220℃烘烤50分钟。在干燥后的谷蛋白脱毒面团中，组分与水的百分比之 比约为1.2∶0.8。

天然无谷蛋白面粉可选自天然玉米粉、白玉米粉、稻米粉、藜谷粉、苔麩粉、籽 粒苋粉、乔麦粉或它们的混合物。另一方面，谷蛋白脱毒面粉可选自：面包小麦粉和 硬粒小麦粉以及大麦粉、黑麦粉、燕麦粉，或他们的混合物，优选面包小麦粉或硬粒 小麦粉.

所以，本发明还包括用上述方法制得的发酵烘焙产品。

本方面内容之一是一种制作发酵烘焙产品的方法，包括或由以下步骤构成：

a)按照前文所述方法直接将天然玉米、稻米粉、鸡蛋、糖、黄油和烘焙酵母加 入谷蛋白脱毒面团后揉合；

b)30℃任其发酵1.5小时；

c)发好的面团250℃烘烤50分钟。

具体例之一，步骤a)中各成分的百分比为：天然玉米10％，稻米粉10％，鸡蛋 5％，糖3％，黄油1％和烘焙酵母1.5％。

所以，按照上述方法制得的发酵烘焙产品是本发明内容之一。

本发明的内容还包括本发明产品的用途，所述产品为面团，面团与无谷蛋白面粉 的混合物，发酵烘焙产品，能够弥补无谷蛋白饮食营养失衡的发酵烘焙产品。

最后，旧金山乳杆菌DSM22063和胚芽乳杆菌DSM 22064也是本方面内容之 一。

以下将根据优选实施方式并参照附图非限定性地进一步阐述本发明。

图1显示旧金山乳杆菌DPPMA12(DSM22063)和胚芽乳杆菌DPPMA125 (DSM22064)对Leu-p-NA、Leu-Leu、Leu-Leu-Leu和Pro-p-NA、 Val-For-Gly和Gly-For-Wing这些合成底物的N型氨肽酶(PepN)，二肽酶 (PepV)和三肽酶(PepT)活性(a)，以及脯氨酸亚氨基肽酶(PepI)、脯肽酶(PepQ)、 脯氨酰肽酶(PepR)、二肽基肽酶(PepX)活性(b)。以下Rizzello等的研究 (Rizzello等，2007，应用环境与微生物学(Appl.Environ.Microbiol.) 73：4499-4507)中所用乳酸菌用作对照：消化乳杆菌(Lactobacillus  alimentarius)15M，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)14G，旧金山乳杆菌 (L.sanfranciscensis)7A，希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)51B 和旧金山乳杆菌LS3，LS10，LS19，LS23，LS38和LS47。酶活用活性单位(U) 表示，一个活性单位即释放1μmol/分钟对-硝基苯胺所需的酶量，或者，如果底物 不是对-硝基苯胺，则表示释放1μmol/分钟氨基酸所需的酶量。

图2显示用选定乳酸菌和真菌蛋白酶处理前和处理后各种硬粒小麦(Svevo和 Duilio)的二维电泳图谱。

图3显示小麦粉经选定乳酸菌和真菌蛋白酶水解前后的蛋白组成。

图4显示WO2008/010252所用乳酸菌(旧金山乳杆菌LS40，LS13，LS44， LS35，LS14，LS11，LS18，LS4，LS15和LS41)和本发明所用乳酸菌[旧金山 乳杆菌DPPMA12(DSM22063)和胚芽乳杆菌DPPMA125(DSM22064)]的氨肽酶 (A)、脯氨酸亚氨基肽酶(B)和脯氨酰基-二肽基氨肽酶(C)活性。缩写15M、14G、 7A、51B、LS3、LS10、LS19、LS23、LS38和LS47表示Rizzello等的论文(2007 年公开)所用的生物型。

图5显示用旧金山乳杆菌LS40、LS13、LS44、LS35、LS14、LS11、LS18、 LS4、LS15和LS41(WO2008/010252)和用旧金山乳杆菌DPPMA12(DSM22063) 和胚芽乳杆菌DPPMA125(DSM22064)于37℃发酵12小时的面团中残余谷蛋白的 浓度(ppm)。

图6显示用WO2008/010252所述不同乳酸菌组合发酵的面团(面团1、2、3、 4和5)和用本发明中两种乳酸菌(DDPPMA12和DPPMA125)发酵的小麦粉面团中游 离氨基酸的总浓度(mg/kg)。

图7显示对按WO2008/010252所制得面包(1，2，4和5)和利用本发明脱毒 小麦粉制得面包(DPPMA12和DPPMA125)的感官分析数据的主要成分分析(PCA)结 果。

实施例1：选定乳酸菌的肽酶活性

将部门保护培养物保藏中心(Dipartimento di Protezione delle  Culture Collection)和巴里大学，应用微生物系(Microbiologia Applicata  dell′Universitàdegli Studi di Bari)的旧金山乳杆菌DPPMA12和胚芽 乳杆菌DPPMA125在改进MRS(mMRS)(在一般成分之外还含5％麦芽糖和10％酵母 水，最终pH 5.6)中于30℃培养扩增24小时，该两菌株最初分离自“酵头”。将 以下Rizzello等论文(Rizzello等，2007.应用环境与微生物学(Appl. Environ.Microbiol.)73：4499-4507)中所用的乳酸菌用作肽酶活性对照： 消化乳杆菌15M，短乳杆菌14G，旧金山乳杆菌7A，希氏乳杆菌51B和旧金山乳杆 菌LS3、LS10、LS19、LS23、LS38和LS47。

细胞培养24小时，离心收集(10000rpm，4℃)，用磷酸缓冲液(50mM，pH  7.0)洗涤两次，然后仍以相同缓冲液重悬，悬液光密度为2.5(A₆₂₀nm)，相对于 10⁸cfu/ml，将此悬液用于酶活分析。分别用Leu-p-NA和Pro-p-NA合成底物检 测N型氨肽酶和脯氨酸(PepN)和亚氨基肽酶(PepI)活性。反应混合物由以下成分构 成：溶有50mM含合成底物(终浓度2mM)的K-磷酸缓冲液(pH 7,0)0.9ml和100μl 细胞悬液。酶活用活性单位(U)表示，一单位相对于释放1μmol/分钟对-硝基苯胺所 需的酶量(Gobbetti等，1996.旧金山乳杆菌CB1的蛋白水解系统：蛋白酶、二肽 酶和氨肽酶的纯化与鉴定。应用环境与微生物学(Appl.Environ. Microbiol.)62：3220-3226)。按照Cagno等所述的方法(Di Cagno等，2004. 乳糜泻患者能够耐受以小麦粉和脱毒面粉为原料并以选定乳杆菌起酵制作的酸酵头 发酵面包。应用环境与微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)70： 1088-1096)，分别以Val-Pro、Pro-Gly和Gly-Pro-Ala为底物检测脯肽酶 (PepQ)、脯氨酰肽酶(PepR)和二肽基肽酶(PepX)。按照Cd-水合茚三酮法 (Gobbetti等，1999.用正交反应表面法(quadratic response surface  methodology)研究温度、pH、NaCl和aw对乳酪相关乳酸菌的影响。酶与微生物 技术(Enzyme Microbial Technol)25：795-809)，分别用Leu-Leu和 Leu-Leu-Leu检测二肽酶(PepV)和三肽酶。一个活性单位(U)定义为释放1μmol/ 分钟氨基酸所需的酶量。

为了进行比较，还对WO2008/010252中所述的乳酸菌(旧金山乳杆菌LS40、 LS13、LS44、LS35、LS14、LS11、LS18、LS4、LS15和LS41)重复以上实验。

实施例2：小麦粉中蛋白质的提取与电泳分析

按照Weiss等所述的方法(Weiss等，1993，不同栽培品种小麦粒中与烘焙师 哮喘相关的过敏原的电泳鉴定。电泳(Electrophoresis)14：805-816)从小麦 粉中提取蛋白质。用固相-聚丙烯酰胺(immobiline-polyacrilamide)法(De  Angelis等，2005.生物活性与生理学学报(Biochim.Biophys.Acta.) 1762：80-93)对约30μg提取的蛋白质进行二维电泳分析。每一独立的发酵制作4 块凝胶进行分析，按照Bini等所述的方法(Bini等，1997.人乳腺癌和正常组织 中蛋白质的表达。电泳(Electrophoresis.)18：2831-2841)对数据进行标定。

实施例3：免疫学和质谱MALDI-TOF分析

用R5抗体和夹心竞争ELISA进行免疫学分析(Transia滴定板，Diffchamb) (Valdez等，2003.用夹心酶联免疫试验检测食品中少量谷蛋白的新方法。欧洲胃 肠道和肝脏科杂志(Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.)15：465-474)。按 照Hernando等(Hernando等，2003.for检测玉米或稻米类食品基质中麦醇溶 蛋白的新方法-对于提取自玉米或稻米的麦醇溶蛋白-酸处理法提取的醇溶蛋白-有 辅助的激光解吸/离子化飞行时间质谱解析。质谱杂志(J.Mass Spectrom.) 38：862-871)所述的方法，用Voyager-De Pro-工作站(PB公司(PerSeptive  Biosystems)，英国)进行MALDI-TOF光谱分析。

用Bradford法(Bradford，1976.一种利用蛋白质-染料结合原理快速灵敏 定量微克级蛋白质的方法。生物化学年报(Anal.Biochem.)72：248-254)检测蛋 白质浓度。用Kjeldahl法检测有机氮浓度。用氨基酸分析仪检测游离氨基酸浓度 (BC有限公司(BiochromLtd.)，剑桥科技园区(Cambridge Science Park)， 英国)(Di Cagno等，2004.应用环境与微生物学(Appl.Environ.Microbiol.) 70：1088-1096)。

为了进行比较，检测用WO2008/010252所述乳杆菌(旧金山乳杆菌LS40、 LS13、LS44、LS35、LS14、LS11、LS18、LS4、LS15和LS41)制作的面团中的 游离氨基酸浓度，该面团按照该文献图8所示方法于30℃发酵了24小时。

实施例4：用脱毒小麦粉制作发酵烘焙产品

如前所述，两种选定乳酸菌的培养物在培养基中扩增，洗涤和用水重悬。将小麦 粉(30％)与水(70％)混合，水中含有所述两种乳酸菌的混合物，乳酸菌在悬浮液中的 细胞密度约10⁸cfu/g，加入真菌酶，各自浓度为400ppm。37℃发酵12小时。发 酵后，直接向液体面团中加入天然玉米(10％)、稻米粉(10％)、鸡蛋(5％)、糖(3％)、 黄油(1％)和烘焙酵母(1.5％)。以上浓度以面团总重为基准。揉合后，30℃发酵1.5 小时，然后将发酵面团250℃烘烤50分钟。

还可以包括对湿的小麦粉面团进行干燥的步骤。制作无谷蛋白面包还用到了其它 成分。

为了进行比较，还按照WO2008/010252的方法制作面包1、2、4和5。对用 本发明方法和现有技术方法制作的面包分别进行感官分析，尤其是以下指标：弹性， 酸香(acid fragrance)，酸味，甜度，干燥度和芳香度。各指标按照0至100打 分。用主组分分析法对感官分析的结果进行处理。此外，还按照美国谷物化学联盟 (American Association of Cereal Chemistry，AACC)的标准方法分析了 面包的比容，面包瓤结构(crumb structure)，硬度和纤维含量。

实施例5：将脱毒小麦粉制成的发酵烘焙产品供乳糜泻患者食用

将前文制得的基于脱毒小麦粉的烘焙产品给5名乳糜泻患者食用。乳糜泻病理诊 断是按照欧洲小儿胃肠病学、肝病学和营养协会的标准做出的。患者平均年龄约15 岁。这些乳糜泻患者缓解至少已有两年，并且正在接受有控制的无谷蛋白饮食。所有 患者在被招募后表现为血清病理指标阴性，组化检查阴性。每名患者在为期60天的 时间内，每日食用含脱毒小麦粉的烘焙产品，脱毒小麦粉的量与10g天然谷蛋白小麦 粉相当。在那不勒斯腓特烈二世大学医院小儿胃肠道科(Dipartimento di  Pediatria e Gastroeneterologia dell′Universitàdegli Studi di  Napoli，Federico II)进行免疫化学和组织学分析。患者的招募获得了其家长的 知情同意，该项试验事先获得了那不勒斯大学道德委员会的批准。

结果

(1)选定乳酸菌的肽酶活性

用合成底物检测肽酶活性，这些底物分别针对寡肽来源谷蛋白降解中的重要肽酶 (图1)。可以发现，旧金山乳杆菌DPPMA12和胚芽乳杆菌DPPMA125显示出所有在 此考虑的酶活。除了三肽酶(PepT)活性之外，两种选定乳酸菌，尤其是胚芽乳杆菌 DPPMA125显示的其它肽酶活性效价显著(P＜0.05)高于Rizzello等的研究 (Rizzello等，2007.应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.) 73：4499-4507)中所用的生物型。检测到，随着脯氨酸残基出现在不同的结合位点， 酶活存在显著差异，尤其是PepI、PepQ、PepR和PepX活性。麦谷蛋白，尤其是 麦醇溶蛋白含有非常高的谷氨酰胺和脯氨酸残基百分比(45-60％)。于是，这最后一 个亚氨基酸(iminoacid)专门出现在源自小麦粉的造成乳糜泻的毒性表位中。为了 提供适合高度降解有脯氨酸参与的键的微生物，这样的酶活当然是高效的谷蛋白降解 和迅速的水解过程的前提条件。所以，已有大型的培养物保藏库可供筛选并且已经分 析了大量的酶活性都表明，需要找到不常见的选定菌株。面包制作中常用的真菌蛋白 酶通过互补作用增强了选定乳酸菌的肽酶活性。面包生产中，根据烘焙产品的设计， 用这些酶来调整蛋白质浓度和基于此的“面粉强度”。

图4显示的是现有技术乳酸菌与本发明两株乳酸菌(DPPMA12和DPPMA125)的 肽酶活性比较，显而易见的是，本发明两株菌的明显具有更高的氨肽酶、脯氨酸亚氨 基肽酶和脯氨酰-二肽基氨肽酶活性。

(2)经水解面粉的特征鉴定

37℃发酵12小时后，选择性提取各种蛋白质组分进行互补分析实验 (complementary ahalytical assays)。二维电泳分析(图2)清楚地显示，发 酵过程的最后，Svevo和Duilio硬粒小麦粉中已无可检出的微量麦醇溶蛋白。就 市售“OO0”型面包小麦粉、其它被测品种的硬粒小麦粉(Arcangelo、Ciccio、 Colosseo、Gargano和Simeto)以及大麦粉、黑麦粉和燕麦粉提取物中的麦谷蛋 白也可看到相似的结果。用MALDI-TOF MS技术分析用60％乙醇提取的小麦粉蛋白 质。欧洲标准麦醇溶蛋白峰在37℃发酵12小时后完全消失。光谱分析只检测到一 些分子量低于8kDa的峰。用R5抗体和ELISA进行的免疫学分析证实，发酵样品中 没有可测出的微量麦醇溶蛋白。用同样的方法测定到市售“OO”型面包小麦粉、硬粒 小麦粉以及大麦粉、黑麦粉和燕麦粉中的残余谷蛋白浓度均低于20ppm。这些检测 所用的方法是AIC(意大利乳糜泻联合会)、WHO和FAO的官方方法。与文献报道的 数据(Rizzello等，2007.应用环境与微生物学(Appl.Environ.Microbiol.) 73：4499-4507)相比，本发明水解过程的效率相同(残余谷蛋白＜20ppm)，但 时间显著缩短(12小时相比对48小时)。如此高的反应速度，一方面是由于采用了 更高浓度的真菌蛋白水解酶(400ppm)，另一方面主要是因为选定乳酸菌生物型具 有更高的肽酶活性。仍然与只考虑采用低初始谷蛋白浓度的面包小麦粉的文献相比， 本发明证明了本发明方法对于具有较高蛋白质初始浓度的多种硬粒小麦粉和大麦粉、 黑麦粉和燕麦粉也有效。

图3中报道的是市售“OO”型面包小麦粉在发酵前和发酵后的有机氮含量。经 水解面粉几乎完全由低分子量肽和氨基酸的混合物构成。经水解面粉中只含有低于 20％的初始麦谷蛋白。经水解面粉中的氨基酸浓度约为15000mg/kg，小麦粉中的 浓度则为＜1.000mg/kg。更高的游离氨基酸生物利用度使得该水解小麦粉成为一种 高营养含量的原料，同时保留了其它谷物营养特征例如无机盐、维生素和纤维素。用 作生产无谷蛋白食品的原料时，所述水解小麦粉能够弥补因无谷蛋白饮食造成的营养 失衡(Grehn等，2001.Scand J Nutr 45：178-182；Mariani等，1998. 儿科胃肠道学和营养学杂志(J Pediart Gastroenterol Nut)27：519-523； Thompson等，2005.人类营养与饮食杂志(J.Human.Nutr.Diet.) 18：163-169)。

与现有技术乳酸菌的比较实验显示：在经历最高水解条件后，面团中的氨基酸浓 度明显更低，约为2000mg/kg(图6)。这证实了多种小麦蛋白质的不同水解程度。 并且，由于释放出的氨基酸是烘焙过程中产生并决定着烘焙产品风味的挥发性化合物 的前体，本发明中显著提高的游离氨基酸浓度表明更多的挥发性化合物合成，因此， 本发明产品具有更佳的风味。

(3)用脱毒小麦粉生产发酵烘焙产品

以上举例说明生物技术方法用于制作基于脱毒小麦粉的发酵烘焙产品的应用。除 了制作烘焙产品之外，本发明方法还为用先前所述的原料来生产无谷蛋白面包作了标 准化和优化。除了可以直接使用脱毒小麦粉之外，还可使用喷雾干燥机对其处理，随 后用作干品。这后一项技术可方便原料的长期保存，保持小麦粉的营养特性。

图7显示本发明(DPPMA12+DPPMA125)面包与现有技术相比最佳的感官品质。 并且，表1显示，与现有技术相比，本发明面包的特征在于较高的比容，较多的面包 瓤泡，较低的硬度和较高的纤维含量。因为含小麦粉，尽管是脱毒小麦粉，带来的差 异有利于获得更好的流变学特征和化学特征。

表1

*旧金山乳杆菌DSM18426、DSM18427，胚芽乳杆菌DSM18430

(4)将脱毒小麦粉制作的烘焙产品给乳糜泻患者食用

将用前述生物技术方法制作的烘焙产品供乳糜泻患者日常食用，剂量相当于10g 天然谷蛋白。表2报道了缓解乳糜泻患者食用脱毒小麦粉产品后(10g谷蛋白当量， 60天)的免疫化学和组织学指标。

表2

可以看出，所有的患者在招募时(T₀)的血清和组织指标都显示正常(马氏级数) 。在60天期间(T₆₀)每日食用10g谷蛋白对等物后，生物化学和免疫化学指标与初 始值相比都没有改变。尤其值得注意的是，马氏级数(Marsh Grade)与初始值完全 相同，该指标体现肠道粘膜健全程度和功能性，基于生物光学样品测得。没有患者在 受试期间发生肠道(intestinal villas)萎缩。5名受试者中只有一名因个人原 因而非病情而中途退出。基于对所得结果数据最谨慎的体内临床分析可以说，全体患 者都能够耐受脱毒小麦粉。所以，脱毒小麦粉可以用于制作无谷蛋白食品。