可实现高灵敏度分子检测和分析的具有纳米孔的裸露的单层石墨烯膜

摘要

提供包括纳米孔的基本裸露的、单层石墨烯膜，所述纳米孔从第一膜表面向第一石墨烯膜表面对面的第二膜表面延伸穿过所述石墨烯膜的厚度。从所述第一石墨烯膜表面到第一贮池的连接，在所述第一石墨烯膜表面，将离子溶液中的物质提供给所述纳米孔，并且提供从所述第二石墨烯膜表面到第二贮池的连接，以便在所述物质和离子溶液穿过所述纳米孔而从所述第一石墨烯膜表面向所述第二石墨烯膜表面移位之后，收集所述物质和离子溶液。电路连接在所述纳米孔对侧，以测量离子电流穿过所述石墨烯膜中的纳米孔的流动。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年9月18日提交的美国临时专利申请号61/243,607的权益，其全部内容通过引用结合到本文中。本申请还要求于2010年6月16日提交的美国临时专利申请号61/355,528的权益，其全部内容通过引用结合到本文中。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院(NIH)颁发的合同号为2R01HG003703-04的政府资助下做出的。政府在本发明中享有一定权利。

背景

本发明总体上涉及分子检测和分析，更具体地讲，涉及纳米孔的配置(configuration)，其布置(arrange)为用于检测穿过纳米孔而移位(translocate)的分子。

包括生物分子(例如多核苷酸例如生物聚合物核酸分子DNA、RNA和肽核酸(PNA)以及蛋白质和其它生物分子)在内的分子的检测、表征、鉴定和测序，是重要而不断发展的研究领域。目前非常需要能以快速、可靠而便宜的方式测定聚合物分子的杂化状态、构型、单体堆积(monomer stacking)和序列的方法。在聚合物合成和制造方面的进展以及在生物研发和药物方面的进展，尤其是在基因治疗、新药物开发和患者与合适治疗的匹配等领域的进展，大部分都依赖于这些方法。

在用于分子分析的一种方法中，已经证明分子例如核酸和蛋白质可穿过天然或固态纳米级的孔或纳米孔而转运，并且可通过穿过纳米孔的转运和在其转运期间，辨别分子特性，包括其鉴定、其杂化状态、其与其它分子的相互作用及其序列(即组成聚合物的单体的线性次序)。可通过例如电泳或其它移位机制来完成分子穿过纳米孔的转运。

在将纳米孔用于分子分析的一种特别受欢迎的配置中，离子电流穿过纳米孔的流动作为液体离子溶液而被监测，并且提供在该溶液中待研究的分子穿过纳米孔。当离子溶液中的分子穿过纳米孔而移位时，这些分子至少部分地阻断液体溶液、以及溶液中的离子穿过纳米孔而流动。可测量穿过纳米孔的离子电流的减少来检测这种对离子溶液的阻断。采用使单分子跨越纳米孔的配置，已经证明该离子阻断测量技术成功检测出单个分子的纳米孔移位事件。

理想地，这种用于分子分析的离子阻断测量技术，正如已经提出的其它技术一样，应当使得能够在单一单体分辨级别上进行高灵敏度和分辨率的分子表征。对单一单体特性的明确分辨对于可靠应用(例如生物分子测序应用)而言是至关重要的。但是在实践中，尤其是用于固态纳米孔的配置中，这种性能难以达到。已经发现通过其中形成纳米孔的一层或多层材料的厚度来测定的固态纳米孔的长度，影响了穿越纳米孔的分子性质，并直接限制了对纳米孔中的分子进行检测和分析的灵敏度和分辨率。

发明概述

提供了克服常规传感器的灵敏度和分辨率限制的纳米孔传感器。在一个这样的实例中提供了纳米孔传感器，其包括具有介于第一膜表面和第一膜表面对面的第二膜表面之间小于约1 nm厚度的固态膜。纳米孔延伸穿过介于所述第一和第二膜表面之间的膜厚度并且其直径大于膜厚度。从所述第一膜表面到第一贮池(reservior)具有连接，以在所述第一膜表面将离子溶液中的物质提供给所述纳米孔，并且从所述第二膜表面到第二贮池具有连接，以便在所述物质和离子溶液穿过所述纳米孔而从所述第一膜表面向所述第二膜表面移位之后，收集所述物质和离子溶液。连接电路，以监测离子溶液中的物质穿过膜中纳米孔的移位。

这种纳米孔传感器可提供为石墨烯(graphene)纳米孔传感器。在此提供了包括纳米孔的基本裸露的、单层石墨烯膜，所述纳米孔从第一石墨烯膜表面向第一石墨烯膜表面对面的第二石墨烯膜表面延伸穿过所述石墨烯膜的厚度。从所述第一石墨烯膜表面到第一贮池的连接，在所述第一石墨烯膜表面将离子溶液中的物质提供给所述纳米孔，并且提供从所述第二石墨烯膜表面到第二贮池的连接，以便在所述物质和离子溶液穿过所述纳米孔而从所述第一石墨烯膜表面向所述第二石墨烯膜表面移位之后，收集所述物质和离子溶液。电路连接在所述纳米孔对侧，以测量离子电流穿过所述石墨烯膜中的纳米孔的流动。

在另一石墨烯纳米孔传感器中，基本裸露的、单层石墨烯膜包括纳米孔，所述纳米孔从第一石墨烯膜表面向第一石墨烯表面对面的第二石墨烯膜表面延伸穿过所述石墨烯膜的厚度并且其直径小于约3 nm且大于石墨烯厚度。电路连接在所述纳米孔对侧，以测量离子电流穿过所述石墨烯膜中的纳米孔的流动。

这些配置可实现用于评价聚合物分子的方法，其中待评价的聚合物分子在离子溶液中提供。离子溶液中的聚合物分子通过基本裸露的、单层石墨烯膜中的纳米孔从第一石墨烯膜表面向第一石墨烯表面对面的第二石墨烯膜表面移位，并监测离子电流穿过所述石墨烯膜中的纳米孔的流动。

这些传感器的布置和传感方法可实现高分辨率、高灵敏度分子检测和分析，从而达到对聚合物中的空间邻近的(closely-spaced)单体的检测，并因此序贯分辨由例如DNA聚合物链中的各单体所导致的不同离子阻断。根据以下描述和附图以及权利要求书，本发明的其它特征和优势将会清楚明了。

附图简述

图1是用于通过测量穿过纳米孔的离子流动而检测分子的实例石墨烯纳米孔装置的示意性透视图；

图2A-－2E是膜中6个理论纳米孔的示意性侧面图，每个纳米孔的直径为2.4 nm，纳米孔长度范围分别为0.6 nm、1 nm、2 nm、5 nm和10 nm，在各个区域穿过各纳米孔的平均离子电流密度为纳米孔中所示的箭头长度；

图3是离子电流阻断的曲线图，定义为穿过未阻断纳米孔的离子电流与穿过用所指出直径的分子阻断的相同纳米孔的离子电流之间差异的绝对值，用3M KCl离子溶液和纳米孔偏压160 mV，对于具有2.5 nm直径和有效长度为0.6 nm、2 nm、5 nm和10 nm的纳米孔而言；

图4是实验性石墨烯膜的X射线衍射图，显示来自石墨烯单层中碳原子的六方堆积的必需(requisite)六方晶格；

图5是显示膜的单层石墨烯的实验性石墨烯膜的拉曼位移测量(Raman shift measurement)图；图6是实验测量的离子电流数据随施加在实验性石墨烯膜顺侧(cis side)和反侧(trans side)的3M KCl离子溶液间的偏压而变化的图；

图7显示图6的图和离子电流随包括8 nm宽纳米孔的实验性石墨烯膜的电压而变化的图；

图8是离子电导随纳米孔直径而变化的图，对于长度为0.6 nm、2 nm和10 nm的纳米孔而言；

图9是当DNA片段穿过纳米孔而移位时，所测离子电流随时间而变化的图，对于实验性石墨烯膜中2.5 nm纳米孔而言；

图10A-10C是取自图9的图的所测离子电流随时间变化的图，详细显示以单行方式(in single-file fashion)、部分折叠方式和半折叠方式的DNA纳米孔移位的电流概况(current profile)；

图11是400个移位事件的离子电流阻断随DNA在石墨烯膜纳米孔中移位而变化的图；和

图12是离子电流阻断的百分比变化随穿过纳米孔的距离而变化的图，对于0.6 nm长的纳米孔和1.5 nm长的纳米孔而言。

详述

图1是实例石墨烯纳米孔分子表征装置10的示意性透视图。为了论述清楚，图1所示的装置特征并非按比例显示。如图1所示，在装置中，在裸露的、单层石墨烯膜14中提供了纳米级的孔径即纳米孔12。石墨烯膜是自支持的，意即在膜的范围下没有结构来支持该膜。在膜边缘，可提供例如支持框架16，其继而可在支持基底或其它结构18上提供。将自支持的裸露的石墨烯膜配置在流体池中，使得在石墨烯膜的第一侧或顺侧具有与含有包含待表征分子20的液体溶液的第一液体贮池或液体供给的连接，而在石墨烯膜的第二侧或反侧具有与第二液体贮池的连接，其中表征的分子经穿过石墨烯纳米孔12的移位而转运。

在石墨烯纳米孔的一个应用中，如图所示，待表征的分子20包括具有待表征的核苷碱基22序列的单链DNA分子(ssDNA)，例如通过测定沿各ssDNA主链的碱基序列的同一性。为了论述清楚，该测序实例在以下描述中将被采用，但这并非石墨烯纳米孔表征装置的唯一应用。另外，以下所述的测序操作并不限于DNA的实例；同样可表征多核苷酸RNA。石墨烯纳米孔装置所能实现的分子表征包括各种各样的分析，包括例如测序、杂交检测、分子相互作用的检测和分析、构型检测和其它分子表征。待表征的分子20一般而言可包括任何分子，包括聚合物和生物分子(例如蛋白质、核酸例如多核苷酸DNA和RNA、糖聚合物和其它生物分子)。因此以下论述并非意欲仅限于具体的实施方案，而是提供用于分子表征的多种实施方案中的一个实例的详情。

给图1的石墨烯纳米孔提供用于使分子20穿过裸露的、自支持的、单层石墨烯膜而穿越纳米孔的特征性布置。例如，可提供浸入石墨烯膜14任一侧的溶液中的氯化银电极24、26，用于控制跨越石墨烯膜的各溶液的电压。在膜相对侧的两种溶液中的电极间施加偏压24，使得在膜的第一侧或顺侧的溶液中提供的分子例如ssDNA分子受电泳驱动而穿过纳米孔12，到达膜的第二侧或反侧的溶液中，因为DNA主链在溶液中带负电荷。

本文中本发明人做出意想不到的发现：垂直于分隔两个填充有离子溶液的贮池的裸露、单层石墨烯膜平面的离子电阻率极其大，使得可用如上所述方式建立跨越石墨烯膜的两种溶液之间的重大偏压。正如在以下实验论述中进一步解释的那样，该发现实现了图1的配置，其中可用分子电泳所需方式来维持对跨越石墨烯单层的电压的电控制。

进一步发现裸露、单层石墨烯膜具有足够的机械强度可作为填充有两种溶液的贮池之间的结构屏障而操作，无论这些贮池是否通过石墨烯膜中的纳米孔而彼此直接连通，所述膜仅在其边缘由框架支持，意即在其范围内是自支持的。因此，可操作单个裸露的石墨烯层的连接纳米孔的膜，以分隔两个填充有离子溶液的贮池，使用熟悉纳米孔领域人员的已知方法，用于在裸露的石墨烯膜的顺侧和反侧施加两种离子溶液间的偏压，以电泳驱动分子穿过纳米孔。

可使用其它技术和布置，以使分子穿过纳米孔，并且不需要特别的技术。电泳驱动分子穿过纳米孔移位的进一步细节和实例在以下文献中提供："Molecular and Atomic Scale Evaluation of Biopolymers, 美国号6,627,067 (2003年9月30日授予Branton等人)，其全部内容都通过引用结合到本文中。

如图1所示，可提供电路26、28，用于测量石墨烯膜的顺侧和反侧之间离子电流穿过纳米孔12而流动的变化。用该配置，可检测分子穿过纳米孔12的移位并根据该检测当分子受驱动而穿过纳米孔时，可对其进行分析。这种分子检测技术不过是采用石墨烯膜和纳米孔的各种各样的检测技术中的一种。可采用纳米孔所连接的电极之间例如碳纳米管或其它探头之间的遂穿电流(Tunneling current)，在探头中或石墨烯膜本身的电导变化，或其它分子检测技术，其描述于例如"Molecular Characterization with Carbon Nanotube control, 美国号7,468,271 (2008年12月23日授予Golovchenko等人)，其全部内容都通过引用结合到本文中。

特别考虑到通过离子电流流动测量的分子检测技术，本文中本发明人做出了意想不到的发现：当没有移位物质时穿过裸露、单层石墨烯膜的纳米孔的离子电流，和当被纳米孔中的分子阻断时穿过纳米孔的离子电流流动，两者均为离子电流穿过任何其它已知脂质或固态膜界面中的类似直径的纳米孔的离子电流流动的约3倍。本发明人认为，与另一固态膜中类似直径的生物孔或纳米孔相比，这种显著更大的穿过裸露的、单层石墨烯膜的纳米孔的离子电流流动是由于薄的石墨烯膜所致，相应地是由于穿过膜的纳米孔的长度所致。

裸露的石墨烯膜是单原子层的六方碳晶格，因此为原子级薄，仅约0.3 nm厚。以这样的厚度，可在其中纳米孔长度大大小于孔直径的方案中表征穿过裸露、单层石墨烯膜中纳米孔的离子流动。在这个方案中，纳米孔的离子电导与纳米孔直径d成比例，并且与在纳米孔中间的电流密度相比，穿过纳米孔的离子电流密度在纳米孔外围(意即在纳米孔边缘)明显达到峰值。相比之下，通过离子电导来表征纳米孔长度大于其直径的纳米孔，所述离子电导与纳米孔面积成比例，并且其均匀跨过纳米孔直径，且离子电导率穿过纳米孔中间以及在纳米孔外围均匀流下。

在这两个纳米孔长度方案中，纳米孔电导间的明显区别如图2A－2E所示。参考这些图，在穿过纳米孔的十个点显示了平均电流密度，每个纳米孔的直径为2.4 nm，长度分别为0.6 nm、1 nm、2 nm、5 nm和10 nm。图中箭头的相对长度表示各箭头位置所代表的纳米孔区域中的相对平均电流密度。如图2A－2C所示，对于小于2.4 nm纳米孔直径的纳米孔长度而言，在纳米孔外围的电流密度达到峰值。随着纳米孔长度接近纳米孔直径时，跨越纳米孔的电导变得更均匀。当纳米孔长度大于纳米孔直径时，如图2D和图2E所示，跨越纳米孔的离子电导是一致均匀的，并不偏好纳米孔外围。在纳米孔不同区域的局部电流密度随纳米孔长度的增加而变得越来越均匀。

因此，在裸露的、单层石墨烯膜中，纳米孔直径大于纳米孔长度的纳米孔在无阻碍状态所显示的总离子电导，显著大于在厚度大于纳米孔直径的膜中的相等直径的纳米孔的总电导。其它条件相同，与厚度大于直径的膜中相等直径的开放纳米孔相比，厚度小于直径的膜中，较大的电导导致穿过给定直径的开放纳米孔的总离子电流显著更大。穿过石墨烯膜的较大离子电流，促进了对穿过纳米孔的离子电流流动的高准确度测量。

因为穿过长度小于纳米孔直径的纳米孔的离子电流主要是在纳米孔外围，而非穿过纳米孔中轴，所以从中间穿越纳米孔的分子直径的小变化对离子电流流动的变化具有巨大影响。这是因为以下事实：分子直径的差异出现在纳米孔边缘而不是在纳米孔中间，对于长度短的纳米孔而言，在纳米孔边缘的离子电流流动最大，对于长度短的纳米孔而言，在纳米孔中间的离子电流较低。因此，与长度大于纳米孔直径的纳米孔相比，长度小于纳米孔直径的裸露的、单层石墨烯纳米孔，对分子尺寸的颗粒或不同尺寸颗粒、分子或其组分的差异更敏感。

这一考虑的结果在数量上示于图3，其中对所计算的纳米孔中离子电流阻断水平与跨越直径为2.5 nm和有效长度为0.6 nm、2 nm、5 nm和10 nm的纳米孔中间的聚合物分子的直径之间的关系作图。所计算的电流阻断是穿过未阻断纳米孔(即纳米孔中无聚合物分子)的离子电流与穿过用所指出直径的聚合物阻断的相同纳米孔的离子电流之间差异的绝对值。所述图假定用3M KC1离子溶液和纳米孔顺侧与反侧间偏压160 mV的分子移位。如此处的图所示，穿过纳米孔的离子电流显示出随纳米孔长度减少，对移位分子的直径改变的敏感度增加。

本发明人进一步发现：当纳米孔直径设定为尽可能接近移位分子直径时，纳米孔电导率对移位分子直径变化的敏感度最大。这种情况对于任何长度的纳米孔而言都是成立的。例如，如图3的图所示，对于直径为2.5 nm的纳米孔，随着移位分子的直径接近纳米孔直径，出现电流阻断，甚至在纳米孔长度大于纳米孔直径的情况下。但对于纳米孔长度小于纳米孔直径(即图中数据为2 nm和0.6 nm)的纳米孔而言，证明了当分子直径接近纳米孔直径时，这样的短长度纳米孔对移位分子直径的小变化的敏感度大得多。对于这些纳米孔，随阻断分子的直径增加，阻断电流呈指数增加。对于5 nm和10 nm长的纳米孔(其大于纳米孔直径)，阻断电流仅以近线性方式而增加，甚至当阻断分子的直径接近纳米孔直径时。

因此，优选通过给单层石墨烯膜提供以下纳米孔使移位分子直径中空间邻近的差异的分辨最大化：其直径大于膜边缘厚度、但并非远远大于通过纳米孔而移位的分子的预期直径，例如不超过5%。对于给定应用的纳米孔直径，为测定该第二个条件，可进行类似于以下实施例所述的分析。简而言之，在这样的分析中，通过例如拉普拉斯方程(Laplace equation)来测定将用于分子移位的离子溶液的离子电流密度，设定分子移位检测的所需灵敏度，并对于什么样的纳米孔直径是可行的确定一般要求。根据这些因素，以及纳米孔直径大于膜厚度的最主要限制，就可选择使所有这些因素优化的纳米孔直径。

本发明人进一步发现：来自分隔两个电偏压(electrically-biased)的填充有离子溶液的贮池的裸露、单层石墨烯纳米孔的电噪声相应地不大于来自任何其它固态纳米孔的电噪声。因此，在任何给定直径的分子跨越期间，假定通过石墨烯纳米孔的离子电流变化，即离子阻断，大于长度大于纳米孔直径的其它已知纳米孔的离子电流变化时，裸露的、单层石墨烯纳米孔可产生比其它已知纳米孔更好的信噪比，因为与较少的计数率相比，每单位时间、或每个跨越核碱基(nucleobase)所计算的离子数越大就越准确。这些发现，以及石墨烯的已知化学惰性和异常大的强度，建立了连接纳米孔的裸露的、单层石墨烯膜，作为用于分子检测和表征的优良界面。

作为这些发现的结果，优选将膜提供为单层、裸露的石墨烯，所述裸露的即是两面都未涂覆增加石墨烯膜厚度的任何材料层或物质。在这种状态中，膜厚度最小并且在长度短的纳米孔方案中是安全的，在所述方案中，外围离子电流流动最大并且其中随分析物的物理尺寸变化而变化的纳米孔电导率最大。石墨烯膜所提供的非常短的纳米孔长度也使以下成为可能：石墨烯纳米孔检测聚合物中的空间邻近的单体以及由此序贯分辨例如DNA聚合物链中的各单体所导致的不同离子阻断。

已认识到，单层石墨烯膜对许多分子例如聚合物分子(例如DNA和RNA)具有亲和力。因此可预期DNA、RNA和其它类似分子具有优先吸附到裸露的石墨烯膜上的趋势。优选在合适环境下和/或在保持膜的裸露状态、而不添加表面层的表面处理下至少部分地抑制石墨烯表面的吸附性质。

例如，可提供离子溶液，其特征在于pH大于约8(例如介于约8.5至11之间)并包括相对高的盐浓度(例如大于约2M和范围为2.1M至5M)。通过使用高离子强度的碱性溶液，使分子对裸露的石墨烯膜表面的粘附最小。任何合适的所选盐都可使用，例如KCl、NaCl、LiCl、RbCl、MgCl₂或任何易溶的盐，其与分析物分子间的相互作用并非破坏性的。

另外，如下所详述的，在石墨烯膜的合成和处理期间，优选极其小心地将膜保持在原始条件下，使得基本上不存在可将分子吸引到石墨烯表面的残余物或其它物质。还认识到，在操作中，石墨烯膜可在电学上处理，以从石墨烯表面驱赶分子。例如，假定带负电荷的DNA分子通过石墨烯膜中的纳米孔而移位时，石墨烯膜在负电压时其自身可以是电子偏倚的(electrically biased)，其排斥带负电荷的DNA分子。在此可以任何合适方式与石墨烯膜电接触，使得能够施加所选电压。在这种情况下，可将石墨烯膜任一侧离子溶液间的电压设定得足够高，以产生克服石墨烯表面排斥的电泳力，使DNA通过纳米孔而移位，而不是吸附到石墨烯表面。

至于用于制造石墨烯纳米孔装置的方法，可通过任何方便且合适的技术合成单层、裸露的石墨烯，而无需特定的合成技术。一般而言，可采用在催化剂材料例如镍层上用甲烷气的常压化学气相沉积(atmospheric chemical vapor deposition)而形成石墨烯层。可采用拉曼光谱、透射电镜和所选区域的衍射研究，以证实待使用的所合成石墨烯区域在性质上的确是单层。

为了布置成为石墨烯膜，可通过任何合适的技术进行将石墨烯层向装置结构的转移，但优选转移所用的任何材料都不会破坏石墨烯表面。在一项优选技术中，将所选处理材料涂覆在催化剂材料和基底上的合成石墨烯层上。对于许多应用，可优选采用这样的处理材料：一旦完成对石墨烯层的处理，可以容易地将所述材料从石墨烯表面除去。甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物(MMA-MAA)可以是特别适合的处理材料。有了MMA-MAA层在石墨烯层上，就可将整个结构切割成小片。

然后可处理所得小片，以除去石墨烯层下面的催化剂层和基底材料并同时粘附处理层。例如，给定Ni催化剂层，可用HC1溶液将Ni层蚀刻掉并释放石墨烯/MMA-MAA复合材料，用蒸馏水漂清。漂浮在水上的石墨烯/MMA-MAA复合材料，随后可用例如涂覆有SiN_x层的硅片来捕获。硅片的中心区可用KOH或其它合适蚀刻剂来蚀刻，产生独立式(free-standing) SiN_x膜，例如面积为50 x 50μm²。然后可用聚焦的离子束(FIB)或其它方法穿过SiN_x膜钻一个合适的洞，使其构成石墨烯层膜的框架。例如，在氮化物膜中可形成例如200 nm x 200 nm的正方形窗口，以产生石墨烯膜的框架。

随着这个装置配置的完成，可将石墨烯/MMA-MAA复合材料放置在石墨烯膜中的正方形窗口，使用例如氮气风(氮气的温和射流)，将石墨烯稳固地压向基底。然后可在例如丙酮的缓慢液滴下，接着再浸入丙酮、二氯乙烷和异丙醇中除去MMA-MAA。

一旦配置成膜，优选从石墨烯薄膜上除去任何残余物，以减少物质粘附到石墨烯的趋势。例如一旦除去MMA-MAA，可在室温下将图1所示的包括伸出氮化物框架的石墨烯膜的所得结构短暂(例如1分钟)浸入例如KOH溶液中，然后用例如水，再用异丙醇，最后用乙醇充分漂清。为了避免破坏石墨烯膜，该结构可经临界点干燥。最后，可将该结构暴露给所选环境，例如在约450°C，在含4% H₂的He气流中例如达20分钟的快速热退火过程，以除去任何残余烃类。为了避免再次污染，优选将该结构立即装载到例如TEM中，用于进一步处理。

然后可在石墨烯膜中形成纳米孔。可使用聚焦的电子束或其它方法而形成纳米孔。纳米孔直径优选大于石墨烯膜厚度，以获得以下好处：出乎意料地发现如上所述的外围离子电流增加和对分子尺寸变化的敏感度增加。对于ssDNA的移位，可优选纳米孔直径介于约1 nm至约20 nm之间，最优选直径介于约1 nm至约2 nm之间。对于dsDNA的移位，可优选纳米孔直径介于约2 nm至约20 nm之间，最优选直径介于约2 nm至约4 nm之间。当纳米孔形成后，优选将石墨烯结构保存在洁净环境下，例如~10^-5托的真空下。

为了完成图1的纳米孔分子传感装置，可在例如聚醚醚酮(PEEK)或其它合适材料的微观流体盒中，在两个半电池之间插入安装的石墨烯膜，所述盒用例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)密封垫密封。优选密封垫口小于石墨烯膜的尺寸，以将石墨烯膜边缘完全密封而与溶液隔离。

实施例I

本实施例描述了单层、裸露的石墨烯膜的实验性示例。通过CVD在镍表面合成石墨烯层。通过在涂覆有SiO₂层的硅基底上的电子束蒸发而提供镍薄膜。镍层经过热退火，产生Ni薄膜显微结构，其单晶粒大小介于约1 μm和20 μm。这些晶粒表面具有原子级的平台和台阶，类似于外延生长的单晶基底表面。在该拓扑结构下，石墨烯在Ni晶粒上的生长类似于石墨烯在单晶基底表面上的生长。

在CVD合成中，在约1000°C的温度下，将Ni层暴露给H₂和CH₄气，拉曼光谱、透射电镜和所选区域的衍射研究表明，石墨烯薄膜具有极好质量和大部分(87%)是一层和两层厚的域(domain)的混合物，域大小为~10 μm。3层或更多层的石墨烯层的更厚区域，其通过在光学显微镜中的颜色对比而容易地区分，仅覆盖总表面的少部分。如果发现更厚的区域或域边界，就丢弃该区域。

通过先用MMA-MAA共聚物(MMA(8.5)MAA EL9, Microchem Corp.)涂覆石墨烯来将石墨烯转移到载体Si/SiN_x芯片并将其切割成0.5 nm x 0.5 mm的小片。将这些小片浸入1N HC1溶液达~8 hr，以将Ni薄膜蚀刻掉并释放石墨烯/聚合物膜，将其转移到蒸馏水中，石墨烯/聚合物漂浮在蒸馏水上，石墨烯一侧向下。涂覆有~250 nm厚SiN_x的载体Si芯片用于捞起漂浮的石墨烯/聚合物薄膜小片，注意石墨烯/聚合物薄膜各自延伸到芯片的中心区。使用标准的各向异性蚀刻技术显微制造芯片的中心区，留下一个约50 x 50μm²的SiN_x区，将其涂覆为独立式SiN_x膜，其中用聚焦的离子束(FIB)钻一个~200 nm x 200 nm的正方形窗口。用氮气风将石墨烯稳固地压向芯片表面。这导致少量液体从石墨烯下被挤出，其强有力而不可逆地粘附到载体芯片的SiN_x涂层上。在丙酮的缓慢液滴下，接着随后浸入丙酮、二氯乙烷和最后异丙醇中，除去石墨烯上方的聚合物。

为了从石墨烯薄膜上除去任何残余物，随后在室温下将各芯片浸入33重量% KOH溶液中达1 min，然后用异丙醇和乙醇充分漂清。为了避免破坏悬浮的独立式的石墨烯薄膜部分，各芯片经临界点干燥。最后，将芯片装载到快速热退火炉(thermal annealer)中并在含有4% H₂的He的气流中加热到450°C达20分钟，以除去任何残余烃类。为了避免再次污染，将芯片立即装载到透射电镜中，用于进一步处理。

图4显示一种石墨烯膜的X射线衍射图，显示来自单层石墨烯中碳原子的六方堆积的必需六方晶格。图5显示石墨烯层的拉曼位移测量。非常小的G峰和非常尖的2D峰，得到G/2D之比小于1，表明是单层膜。

实施例II

本实施例描述了实施例I的单层、裸露的石墨烯膜的电导的实验测定。

可在聚醚醚酮(PEEK)制成的定制微观流体盒的两个半电池之间插入安装芯片的来自实施例I的单层石墨烯膜。芯片两侧用聚二甲基硅氧烷(PDMS)密封垫密封。压向Si/SiN_x载体芯片上的石墨烯薄膜的密封垫的开口的内径为~100 μm。因此，密封垫口小于石墨烯膜的尺寸(0.5 x 0.5 mm²)，并且将石墨烯膜边缘完全密封而与电解液隔离。在芯片对侧，电解液仅通过SiN_x膜中的200 nm宽的正方形窗口而接触石墨烯膜。注意，在该布置下，与电解液接触的两个石墨烯膜面之间有大的面积差异(100 μm直径的圆形面积对比正方形的200 nm x 200 nm面积)。

首先用乙醇填充两个半电池，以帮助润湿芯片表面。随后用去离子水、接着用不含缓冲液的1M KCl盐溶液冲洗电池。为了避免石墨烯膜与溶质之间的任何潜在相互作用(其可影响实验测量结果)，实验所用的所有电解液都尽可能地保持简单，并且不含缓冲液。所有溶液pH范围仅有0.2 pH单位，从5.09到5.29，如在所述实验中的使用前和使用后后测量的。

在每个半电池中的Ag/AgCl电极用于施加跨石墨烯膜的电压并测量离子电流。用Axopatch 200B (Axon instruments)放大器，已获取电流追踪图(current trace)，所述放大器连接到外部8-极贝塞尔低通滤波器(型号90IP-L8L, Frequency Devices, Inc.)，在50 kHz操作。用NI PCI-6259 DAQ卡(National Instruments)在250 kHz采样率和16-位分辨率下操作，将模拟信号数字化。所有实验都通过IGOR Pro软件来控制。

图6是实验测量的离子电流数据与施加在石墨烯膜顺侧和反侧的3M KCl离子溶液间的偏压之间关系的图。对该数据使用欧姆定律，发现与石墨烯膜平面垂直的离子电流电阻率正好是3-4 G'Ω范围。这证明本发明的一项发现是垂直于石墨烯膜平面的离子电阻率非常之大，并能实现这样的配置：其中可维持跨越、单层石墨烯膜的相当大的偏压，所述膜分隔两个偏压的填充有离子溶液的贮池。

用100 mV偏压施加在两个Ag/AgCl电极之间，对石墨烯膜顺侧和反侧的各种氯化物电解液进行离子电流测量。使用已用电导率标准溶液(Alfa Aesar, 产品号43405, 42695, 42679)标定的Accumet Research AR50电导仪测量电解液的电导率。所有流体实验都在温控(24°C)实验室条件下进行。表1显示石墨烯膜的电导远远低于nS水平。对于含有最大原子大小的阳离子Cs和Rb的溶液，观察到最高电导，这与介导其与石墨烯相互作用的最小水合外层相关。该电导归因于通过独立式石墨烯膜中缺损结构的离子转运。                                               

通过进一步实验排除了来自往返于石墨烯膜(to and from the graphene membrane)的电化学电流的贡献。在此为研究来自电化学(法拉第)电流的贡献，将分离的大面积石墨烯薄膜(~2 x 4 mm²)转移到玻片并在连接金属夹的一端接触银漆，在金属夹上放置蜡绝缘层。将石墨烯薄膜的暴露端浸入带有Ag/AgCl对电极(counter electrode)的1M KCI电解液中，并在反侧电极(trans-electrode)实验所用的相同电压范围内测量电化学I-V曲线。对表面积标准化后，结论是反侧电极装置中的任何电化学电流比通过表1中生长态(as-grown)石墨烯膜而测量的~pA电流小3个数量级，从而不能对其作出解释。当从CsCl到LiCl时，对不同阳离子所观察的电导比溶液电导率下降快得多，表明石墨烯-阳离子相互作用的影响。然而不能完全排除穿过接触芯片表面的石墨烯的离子转运。

实施例III

本实施例描述了包括纳米孔的实施例I的单层、裸露的石墨烯膜的电导的实验测定。

在用200kV加速电压操作的JEOL 2010 FEG透射电镜下，用聚焦电子束，穿过若干个实施例I的石墨烯膜钻单个纳米大小的纳米孔。通过EM可视化，在良好扩散的电子束中测定纳米孔直径，以使石墨烯膜的总电子暴露保持最小化。将8 nm的纳米孔直径测定为沿不同纳米孔轴的4次测量的平均值，如使用Digital Micrograph软件(Gatan, Inc.)根据标定的TE显微图而测定。如果芯片或TEM样品杆(holder)具有任何污染的有机残余物，则可看见无定形碳明显沉积在电子束下。将所述装置移开。钻出纳米孔后，将不立即进行研究的石墨烯纳米孔芯片保存在~10^-5托的清洁真空下。

图7显示如以上实施例II给出的离子电流与所施用电压之间关系的图，对于连续石墨烯膜、以及包括8 nm宽纳米孔的石墨烯膜而言。这些图证明石墨烯膜的离子电导率由于纳米孔所致而增加了数个数量级。

发现用已知石墨烯纳米孔直径和已知离子溶液电导率的实验能降低裸露的、单层石墨烯膜的有效绝缘厚度。对来自实施例I的10个单独的石墨烯膜进行处理，使其包括范围为5-23 nm的纳米孔直径。然后用提供给顺侧和反侧的溶液贮池的1 M KCl溶液，测量这10个膜中每一个的离子电导，电导率为11 S m^-1。图8是这10个膜的所测离子电导与纳米孔直径之间关系的图。图中的实心曲线是0.6 nm厚的绝缘膜的模拟电导，其最佳拟合了实验所测电导。2 nm厚的膜的模拟电导显示为点线，10 nm厚的膜的模拟电导显示为虚-点线，这是为了比较而呈现的。

在无限薄的绝缘膜中，直径d的纳米孔的离子电导G由下式给出：

其中是离子溶液电导率，F是法拉第常数，c是离子浓度，和μ_i(C)是用于KCl离子溶液的钾离子(i=K )和氯离子(i = Cl)的移位率。对于无限薄的膜而言，电导与直径的线性相关是根据电流密度在纳米孔周长为尖锐峰而得出的，如上所述。对于比纳米孔直径更厚的膜，电导率与纳米孔面积成比例。对于有限的、但厚度小的膜而言，计算机计算可预测电导。

如图8的图所示，与式(1)一致，直径范围为5-23纳米的单层裸露的石墨烯纳米孔的电导率与纳米孔直径显示出近线性相关。在理想化不带电的绝缘膜中随纳米孔直径和膜厚度的变化来计算纳米孔离子电导率，基于此计算可得到模拟曲线。对于离子电流密度，通过用合适的溶液电导率和边界条件，数字上解拉普拉斯方程，并对纳米孔区域积分以得到电导率，从而得到该曲线上的点。用COMSOL Multiphysics有限元求解器，以沿纳米孔的轴具有具有圆柱对称性的合适3-D几何形状，进行这些数值模拟。在稳态方案中解全套Poisson-Nerst-Planck方程。在目标物理参数范围内，高盐浓度和小的施加电压，发现数值模拟溶液与具有固定电导的拉普拉斯方程的溶液(其具有显著更少的计算罚(computational penalty))没有显著差异。用于该理想化模型的膜厚度L在本文中是指石墨烯的绝缘厚度，或L_IT。图8中与所测纳米孔电导数据的最佳拟合得到L_GIT = 0.6 (+0.9 - 0.6) nm，根据最小二乘方误差分析来确定不定度。

实施例IV

本实施例描述了在实施例I的单层、裸露的石墨烯膜中DNA穿过纳米孔的移位的实验性测量。

用含1mM EDTA的3M KCl盐溶液(pH 10.5)冲洗以上实施例的微观流体电池。如上所述，发现高盐浓度和高pH使DNA-石墨烯的相互作用最小化，因此优选这些溶液条件。将双链λDNA分子的10 kbp限制片断引入系统的顺侧小室。通过施加160mV电泳力，将带负电荷DNA分子经电泳拉向并被驱使而穿过纳米孔。每个穿过纳米孔的绝缘分子短暂地降低或阻断纳米孔的离子电导率，其方式反映出聚合物的大小和构象两者。随着DNA片段由于所施加的电泳力而穿越纳米孔，使用拟合函数用MATLAB分析移位事件，所述拟合函数由与合适贝塞尔滤波函数卷积(convolute)的多重矩形脉冲组成，以模拟记录条件。

图9是从对顺侧和反侧的贮池间施加偏压开始的1分钟内所测的穿过纳米孔的离子电流与时间关系的图。图中所测电流的每一次下降都对应一次穿过纳米孔的DNA移位，并能表征两个参数，即平均电流下降或阻断，和阻断持续时间，这是分子全部穿过纳米孔而移位所需的时间。注意，在1分钟时间周期内，裸露的石墨烯膜纳米孔的高数量的移位事件表明，用高pH盐溶液以及在DNA移位实验的准备期间对石墨烯膜的仔细清洁和处理，成功抑制了DNA向裸露的石墨烯膜表面的粘附。

图10A、图10B和图10C是单次移位事件中所测的穿过纳米孔的离子电流的图。在图10A中显示在以单行方式的DNA移位期间的离子电流流动阻断。在图10B中显示在部分折叠DNA移位期间的离子电流流动阻断。最后，在图10C中显示在半折叠DNA移位期间的离子电流流动阻断。这3个实验性移位事件代表了在DNA片段移位期间可发生的可能的离子电流的流动测量结果，并证明了与用较厚的常规固态纳米孔一样，用石墨烯纳米孔时，DNA折叠和构象也可发生。

在来自实施例I的分离的石墨烯膜中形成一个5nm宽的纳米孔，并用3 M KC1溶液(pH 10.4)进行双链DNA移位实验。每个单分子移位事件都可用两个参数来表征：平均离子电流下降或阻断，和阻断持续时间，这是分子全部穿过孔而移位所需的时间。图11是散点图，表明400个双链DNA单分子的每一个穿过石墨烯纳米孔而移位的电流下降值和阻断持续时间。该数据的特征性形状类似于在氮化硅纳米孔实验中所获得的形状，其中几乎所有事件(折叠或未折叠)都落入恒定的电子电荷不足(electronic charge deficit，ecd)线的附近，即不管其它同样分子怎样折叠，在每个分子穿过纳米孔而运动所需要的总时间期间，各自都阻断相同量的离子电荷穿过纳米孔的运动。此处正如先前的实验一样，证明了粘附到石墨烯表面并不抑制双链DNA穿过纳米孔。该图包围的几个事件不满足该条件，并且它们的移位时间长，表明石墨烯- DNA相互作用，这减慢了它们穿过纳米孔的移位。

在图11的图中，插图显示两个单分子的移位事件。在右边事件中，分子以未折叠线性方式穿过纳米孔，正如图10A的实施例那样。在左边事件中，当分子进入纳米孔时其折叠在自身上，正如图10B的实施例那样，这短时增加了电流阻断。

在DNA移位事件期间对纳米孔电导进行的测量可用作评价石墨烯膜有效绝缘厚度L_IT的替代方法。将实验所测的开放纳米孔和DNA阻断纳米孔的电导与通过数值解所测的电导相比较，其中膜厚度和纳米孔直径是拟合参数。在此，将DNA分子模拟为穿过纳米孔中心的直径为2 nm的长的、刚性绝缘棒。对于横向分辨率的计算，向DNA模型增加一级(step) 2.2 nm的直径，并计算当该不连续(discontinuity)穿过纳米孔中心而移位时离子电流的变化。通过将电流密度对纳米孔直径积分而算出总离子电流。

在直径2.0 nm的未折叠的双链DNA的移位期间，使用所观察到的平均电流阻断ΔI =1.24 ± 0.08 nA，和所观察的纳米孔电导G =105 ±1 nS不存在DNA，求出石墨烯膜绝缘厚度为L_IT = 0.6 ± 0.5 nm，与如上所述的根据开放纳米孔测量而推导的值非常一致。根据这些计算而推导的纳米孔直径d_GIT = 4.6 + 0.4 nm也与得自纳米孔TEM的几何直径5 ± 0.5 nm一致。

来自两个实验的最佳拟合值L_IT = 0.6 nm与分子动力学模拟一致，表明在膜每一侧的石墨烯-水的距离为0.31-0.34 nm。L_IT也可受到固定化水分子的典型存在情况和斯特恩层(Stern layer)中吸附离子的影响。另一方面，理论研究反对石墨烯上的任何固定化水层，而实验测量却支持水与内部弯曲的碳纳米管表面之间的异常高的滑动(slip)。尽管实际上对裸露的单石墨烯层上具体吸附的离子表面化学知之甚少，但对穿过直径小于1 nm的碳纳米管内体积的离子电流的测量可表明，离子根本就没有固定在这些石墨表面上。在此所测的L_IT的低于纳米的值支持这一观点。

在此所得的L_IT的极其小的值表明，单层、裸露的石墨烯膜中的纳米孔对于当分子穿过纳米孔时沿分子长度而辨别空间的和/或化学的分子结构而言是特别理想的。可根据石墨烯膜绝缘厚度L_IT的测定，来实现由这样的纳米孔所能得到的分子检测分辨率的数字建模。

在这类模型的实例中，指定一个长而绝缘的2.2 nm-直径的圆柱体，其可穿过2.4 nm-直径纳米孔的中心而对称地移位。在沿其长度的某位置处，圆柱体直径从2.2 nm不连续地变为2.0 nm。当该不连续穿过孔时，对该几何形状求出电导，得到如图12的图所示的数据。当分子圆柱体的大直径部分从纳米孔出来时，可清楚见到降低离子电流的流动阻断，这对应于增加的纳米孔电导。给出了两个L_IT值的计算结果。对于保守的L_IT = 1.5 nm而言，空间分辨率定义为如下距离：在该距离内，电导率从其最大值的75%变为所述值的25%，所述空间分辨率由以下公式给出：，而最佳拟合值L_GIT= 0.6 nm导致。

根据以上详述的实验以及根据以上描述的建模两方面，可得出以下结论：裸露的单层石墨烯膜中的纳米孔固有地能够以低于纳米的分辨率来探测分子。在移位期间，将石墨烯纳米孔边界功能化或观察其局部平面内离子电导率，可提供进一步提高该系统分辨率的额外或备选方法。

根据以上描述，已经证明可将原子级的裸露的、单层石墨烯薄层制作到包括其直径大于膜厚度的纳米孔的自支持的膜中，用于传感通过纳米孔的分子移位事件。作为裸露的单层，石墨烯膜的厚度最小并且在长度短的纳米孔方案中是安全的，在所述方案中，外围离子电流流动最大并且其中随纳米孔长度而变化的纳米孔电导率最大。石墨烯膜所提供的非常短的纳米孔长度也使以下成为可能：石墨烯纳米孔检测聚合物中的空间邻近的单体，并因此序贯分辨由例如DNA聚合物链中的各单体所导致的不同离子阻断。

基于这些考虑，认识到如果技术进步可实现这些，则备选材料的固态膜可代替单层、裸露的石墨烯膜层。具体地讲，可采用这样的固态膜来获取上述分子传感能力，并且尤其是DNA传感能力：所述固态膜的厚度小于约1 nm并可机械支持穿过膜厚度而延伸的、直径大于膜厚度的纳米孔。应理解的是，可要求达到垂直于膜平面的电阻、机械完整性和上述其它特征的条件，以实现在顺侧和反侧的贮池之间膜材料的布置，用于通过膜纳米孔的分子移位。离子电流阻断测量或其它电学测量都可采用，只要适用于给定应用，而无需特定测量技术。

从这种理解进一步延伸开来，认识到可采用纳米孔的备选配置。例如，也可采用这样的膜或其它结构：其中可产生具有非常尖锐或突出的边缘位置的孔径，在该位置处所述孔径直径被降低到纳米级，并且其大于直径减小位置的厚度。因此，可以使用这样的任何固态结构配置：其中具有经配置而满足这些要求的孔径，从而获得上述分子传感的优势。

当然可认识到，本领域技术人员可对上述实施方案作出各种修改和添加，只要不偏离本发明对本领域贡献的精神和范围。因此，应理解，本文寻求提供的保护应视为延伸到完全在本发明范围之内的主题权利要求及其所有等同实施方案。