植物叶片叶绿素含量测量方法及系统

摘要

本发明公开了一种植物叶片叶绿素含量测量方法及系统，涉及叶绿素含量检测技术领域，所述方法包括：S1：获取所述待测植物叶片表面的激光后向散射图像；S2：对图像中的光斑进行边缘检测，并获取光斑的中心；S3：获取距离中心点预设距离的像素值；S4：对所述漫射方程进行拟合反演，以获得光学特性参数；S5：建立叶绿素含量与光学特性参数之间的预测关系模型，获得所述待测植物叶片的叶绿素含量。本发明通过对散射图像进行处理，实现了较厚叶片的叶绿素无损测量，在不提高仪器成本的情况下，保证植物叶片叶绿素含量的测量精度。

说明书

技术领域

本发明涉及叶绿素含量检测技术领域，特别涉及一种植物叶片叶 绿素含量测量方法及系统。

背景技术

叶绿素在植物进行光合作用的过程中起着重要的作用，其含量是 植物营养胁迫、光合作用能力和生长状况的重要指示因子。叶绿素含 量检测技术的研究在农业生产、林业研究等方面有着至关重要的意 义。

目前测定植物叶片叶绿素含量的标准方法是分光光度计法，即将 植物叶片取回实验室，将叶片称重剪碎，用丙酮提取叶片叶绿素，然 后用分光光度计测定提取液在645nm和663nm的光密度，依次用 OD645和OD663表示，然后按公式换算成叶绿素含量。这种方法具 有耗时长、环节多、操作复杂、对叶片有破坏性、不便于野外现场测 量、不便于连续测量等诸多缺点，而且实验条件等受到诸多因素的影 响，需要严格控制。

在叶绿素快速测定方面，主要基于叶绿素与光的相互作用特性， 目前国内外已开发出多款实用的产品。叶片的光学测量模式通常有三 种：一是透射测量模式，二是反射测量模式，三是激光诱导荧光测量 模式。

透射测量模式中使用最广泛的是日本美能达公司产的 SPAD-502，它是根据叶绿素在可见光区域特定波长位置有吸收谷和 反射峰的特点，通过发射一束已知强度的光照射在需测定的叶片位 置，检测被测试叶片特定波长吸收率和反射率来推算叶片叶绿素含 量。英国CL-01叶绿素仪的测定叶夹是10～127mm范围内可调的， 可测定常见植物叶片的任意位置的叶绿素含量，其他所有产品的叶夹 都是固定的，只能测定叶片边缘和小叶片中部的叶绿素含量。CL-01 叶绿素仪的测定范围很广，达到0～2000单位，能够测定叶绿素含量 非常高的叶片。美国CCM-200叶绿素仪是通过在红光和蓝光两个波 段激发光源时的光学吸收率，测量被测物的叶绿素相对含量。它可以 精确测量植物和作物的相对叶绿素含量，广泛用在氮肥管理，除草剂 应用，研究叶衰老、环境胁迫等。公开号为：CN100462712A的中国 专利公开了一种便携式植物氮素和水分含量的无损检测方法及测量 仪器，该系统可利用多波长校正背景、去除背景成分影响，实现无损 检测作物叶片中的色素含量。公开号为：CN200965518Y的中国专利 公开了一种叶绿素测定仪，其采用两个不同波长的光源分别照射植物 叶片表面，比较叶片表面透射光的光密度差异，从而测量出叶绿素的 相对含量，最终确定含氮量。

在反射测量模式中，使用较多的是美国ASD公司生产的地物光 谱仪，它通过光谱仪测量叶片反射光谱，由用户自行建立光谱与叶绿 素含量之间的模型，从而实现快速测量。公开号为：CN100590417C 的中国专利基于可见-近红外光谱，测量叶绿素、叶黄素、水分和氮 素，对校正集样本进行光谱采集，在对光谱数据进行预处理和波段优 选后建立光谱值与植物组分含量标准之间的校正模型，采集未知样本 的光谱，对光谱数据预处理后，将选定波段数据代入校正模型，对待 组分的含量进行预测。

在激光诱导荧光测量模式中，公开号为：CN201464366U的中国 专利公开了一种叶绿素荧光探测仪，可测量植被冠层的荧光强度，该 叶绿素荧光探测仪的能量探测单元用于探测植被在自然光照条件下 的入射能量和植被反射能量，并将能量信号传输给输出单元，得出能 量计算模型，从而获得植被冠层的荧光强度。

但由于基于透射测量模式的SPAD叶绿素仪是点接触式的，读取 的数值仅是仪器探头触点处的叶绿素含量，如要获取大区域的叶绿素 含量需要进行大量测定，而且该仪器适合较薄的植物叶片，对于测量 较厚植物叶片叶绿素含量，光难以透过，因此测量精度会受到影响。

反射测量模式的仪器中，需要使用全谱测量光谱仪，因此仪器的 成本一般较高。

激光诱导荧光测量模式的仪器中，测量精度较高，但仪器成本也 较高。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明要解决的技术问题是：如何实现较厚叶片叶绿素含量的无 损测量，并在不提高仪器成本的情况下，保证植物叶片叶绿素含量的 测量精度。

(二)技术方案

为解决上述技术问题，本发明提供了一种植物叶片叶绿素含量测 量方法，包括以下步骤：

S1：通过激光器的出射光线照射待测植物叶片表面，并通过图像 传感器获取所述待测植物叶片表面的激光后向散射图像；

S2：对所述待测植物叶片表面的激光后向散射图像进行灰度转 化，对转化后的图像进行去噪处理，再对去噪后的图像中的光斑进行 边缘检测，并获取光斑的中心；

S3：以所述光斑的中心为圆心、N个像素为步长作同心圆，直至 到达所述光斑的边缘，将每个同心圆的横纵坐标方向的像素值相加取 平均值作为距离中心点预设距离的像素值，其中，N为大于零的整数；

S4：构建漫射方程，将所述预设距离和对应的像素值代入所述漫 射方程，对所述漫射方程进行拟合反演，以获得光学特性参数，所述 光学特征参数包括：约化散射系数和吸收系数中的至少一个；

S5：利用回归方法建立叶绿素含量与光学特性参数之间的预测关 系模型，根据所述预测关系模型获得所述待测植物叶片的叶绿素含 量。

优选地，步骤S5中，所述叶绿素含量与光学特性参数之间的预 测关系模型通过以下步骤获得：

S51：选择预设数量的植物叶片作为样品；

S52：通过激光器的出射光线照射所述样品表面，并通过图像传 感器获取所述样品表面的激光后向散射图像；

S53：对所述样品表面的激光后向散射图像进行灰度转化，对转 化后的图像进行去噪处理，再对去噪后的图像中的光斑进行边缘检 测，并获取光斑的中心；

S54：以所述光斑的中心为圆心、N个像素为步长作同心圆，直 至到达所述光斑的边缘，将每个同心圆的横纵坐标方向的像素值相加 取平均值作为距离中心点预设距离的像素值，其中，N为大于零的整 数；

S55：构建漫射方程，将所述预设距离和对应的像素值代入所述 漫射方程，对所述漫射方程进行拟合反演，以获得光学特性参数；

S56：对所述样品的叶绿素含量和光学特性参数进行回归，以获 得所述叶绿素含量与光学特性参数之间的预测关系模型。

优选地，所述激光器的波长为670nm。

优选地，通过激光器的出射光线照射所述待测植物叶片表面或样 品表面时，调节所述激光器的出射光线，使获得的激光后向散射图像 中的光斑直径小于叶片的宽度。

优选地，在步骤S56中，所述光学特性参数与叶绿素的关系模型 包括：约化散射系数与叶绿素的关系模型、和吸收系数与叶绿素的关 系模型中的至少一个。

优选地，步骤S56之后还包括以下步骤：

S57：获得约化散射系数、以及吸收系数分别与所述叶绿素含量 的对应关系的误差值，选择误差值较小的对应关系模型进行叶绿素含 量的最终测量。

优选地，所述漫射方程为

$R\left(\rho \right)=\frac{1}{4\pi }[z_0({\mu }_{\mathrm{eff}}+\frac{1}{r_1})\frac{\exp (-{\mu }_{\mathrm{eff}}{r}_1)}{{r_1}^2}+(z_0+2z_b)({\mu }_{\mathrm{eff}}+\frac{1}{r_2})\frac{\exp (-{\mu }_{\mathrm{eff}}{r}_2)}{{r_2}^2}]$

其中，R(ρ)为光强值，ρ为激光器的出光口与叶片表面之间的垂 直距离，R_eff为叶片表面向叶片组织内的反射系数，D 为漫射系数，z₀＝(μ_a+μ′_s)^-1，μ_eff＝[3μ_a(μ_a+μ′_s)]^1/2， $r_1=\sqrt{z_0^2+{\rho }^2},$$r_2=\sqrt{{(z_0+2z_b)}^2+{\rho }^2},$μ′_s为约化散射系数，μ_a为吸收系 数。

本发明还公开了一种植物叶片叶绿素含量测量系统，包括：

图像获取模块，用于通过激光器的出射光线照射待测植物叶片表 面，并通过图像传感器获取所述待测植物叶片表面的激光后向散射图 像；

中心获取模块，用于对所述待测植物叶片表面的激光后向散射图 像进行灰度转化，对转化后的图像进行去噪处理，再对去噪后的图像 中的光斑进行边缘检测，并获取光斑的中心；

像素值获取模块，用于以所述光斑的中心为圆心、N个像素为步 长作同心圆，直至到达所述光斑的边缘，将每个同心圆的横纵坐标方 向的像素值相加取平均值作为距离中心点预设距离的像素值，其中， N为大于零的整数；

反演模块，用于构建漫射方程，将所述预设距离和对应的像素值 代入所述漫射方程，对所述漫射方程进行反演，以获得光学特性参数， 所述光学特征参数包括：约化散射系数和吸收系数中的至少一个；

叶绿素含量获得模块，用于利用回归方法建立叶绿素含量与光学 特性参数之间的预测关系模型，根据所述预测关系模型获得所述待测 植物叶片的叶绿素含量。

(三)有益效果

本发明通过对散射图像进行处理，实现了较厚叶片的叶绿素无损 测量，在不提高仪器成本的情况下，保证植物叶片叶绿素含量的测量 精度。

附图说明

图1是按照本发明一种实施方式的植物叶片叶绿素含量测量方法 的流程图；

图2是在670nm波长下绿叶的激光后向散射图像；

图3是在670nm波长下黄叶的激光后向散射图像；

图4是在670nm波长下干叶的激光后向散射图像；

图5是在670nm波长下绿叶、黄叶和干叶的相对光强分布曲线图；

图6是按照图1所示的方法的线性回归示意图；

图7是约化散射系数与叶绿素含量之间的模型预测效果图；

图8是吸收系数与叶绿素含量之间的模型预测效果图；

图9是约化散射系数与叶绿素含量之间的模型的验证示意图；

图10是吸收系数与叶绿素含量之间的模型的验证示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细 描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

图1是按照本发明一种实施方式的植物叶片叶绿素含量测量方法 的流程图，参照图1，本实施方式的方法包括以下步骤：

S1：通过激光器的出射光线照射待测植物叶片表面，并通过图像 传感器获取所述待测植物叶片表面的激光后向散射图像；

S2：对所述待测植物叶片表面的激光后向散射图像进行灰度转 化，对转化后的图像进行去噪处理，再对去噪后的图像中的光斑进行 边缘检测，并获取光斑的中心；

S3：以所述光斑的中心为圆心、N个像素为步长作同心圆，直至 到达所述光斑的边缘，将每个同心圆的横纵坐标方向的像素值相加取 平均值作为距离中心点预设距离的像素值，其中，N为大于零的整数；

S4：构建漫射方程，将所述预设距离和对应的像素值代入所述漫 射方程，对所述漫射方程进行拟合反演，以获得光学特性参数，所述 光学特征参数包括：约化散射系数和吸收系数中的至少一个；

S5：利用回归方法建立叶绿素含量与光学特性参数之间的预测关 系模型，根据所述预测关系模型获得所述待测植物叶片的叶绿素含 量。

优选地，步骤S5中，所述叶绿素含量与光学特性参数之间的关 系通过以下步骤获得：

S51：选择预设数量的植物叶片作为样品；

S52：通过激光器的出射光线照射所述样品表面，并通过图像传 感器获取所述样品表面的激光后向散射图像；

S53：对所述样品表面的激光后向散射图像进行灰度转化，对转 化后的图像进行去噪处理，再对去噪后的图像中的光斑进行边缘检 测，并获取光斑的中心；

S54：以所述光斑的中心为圆心、N个像素为步长作同心圆，直 至到达所述光斑的边缘，将每个同心圆的横纵坐标方向的像素值相加 取平均值作为距离中心点预设距离的像素值，其中，N为大于零的整 数；

S55：构建漫射方程，将所述预设距离和对应的像素值代入所述 漫射方程，对所述漫射方程进行拟合反演，以获得光学特性参数；

S56：对所述样品的叶绿素含量和光学特性参数进行回归，以获 得所述叶绿素含量与光学特性参数之间的预测关系模型。

优选地，所述激光器的波长为670nm。

优选地，通过激光器的出射光线照射所述待测植物叶片表面或样 品表面时，调节所述激光器的出射光线，使获得的激光后向散射图像 中的光斑直径小于叶片的宽度。

优选地，在步骤S56中，所述光学特性参数与叶绿素的关系模型 包括：约化散射系数与叶绿素的关系模型、和吸收系数与叶绿素的关 系模型中的至少一个。

优选地，步骤S56之后还包括以下步骤：

S57：获得约化散射系数、以及吸收系数分别与所述叶绿素含量 的对应关系的误差值，选择误差值较小的对应关系模型进行叶绿素含 量的最终测量。

优选地，所述漫射方程为

$R\left(\rho \right)=\frac{1}{4\pi }[z_0({\mu }_{\mathrm{eff}}+\frac{1}{r_1})\frac{\exp (-{\mu }_{\mathrm{eff}}{r}_1)}{{r_1}^2}+(z_0+2z_b)({\mu }_{\mathrm{eff}}+\frac{1}{r_2})\frac{\exp (-{\mu }_{\mathrm{eff}}{r}_2)}{{r_2}^2}]$

其中，R(ρ)为光强值，ρ为激光器的出光口与叶片表面之间的垂 直距离，R_eff为叶片表面向叶片组织内的反射系数，D 为漫射系数，z₀＝(μ_a+μ′_s)^-1，μ_eff＝[3μ_a(μ_a+μ′_s)]^1/2， $r_1=\sqrt{z_0^2+{\rho }^2},$$r_2=\sqrt{{(z_0+2z_b)}^2+{\rho }^2},$μ′_s为约化散射系数，μ_a为吸收系 数。

本发明的方法的测量原理是：当激光照射到植物叶片时，其中一 部分光被叶片吸收，另一部分光透过，还有一部分光先进入叶片内部， 再反射回来，这部分漫射光携带了植物叶片内部的物理、化学信息。 这些信息可间接反映植物叶片的成分信息。照射的激光会在叶片表面 形成一个光斑，光斑的中心是白色的亮斑，代表直接反射回来的镜面 反射光，光斑的外围是一圈光晕，这个光晕是后向散射光引起的，光 晕包含了植物内部的组分信息，通过对光晕图像进行处理，可得到植 物叶片叶绿素含量信息。本发明根据植物叶片叶绿素含量变化引起光 学特性参数(约化散射系数、吸收系数)的变化，通过拍摄植物叶片 的激光后向散射图像，反演出光学特性参数(约化散射系数、吸收系 数)，用光学特性参数(约化散射系数、吸收系数)与叶绿素的SPAD 值建立对应的函数关系，最终实现用激光后向散射图像技术测定植物 叶片叶绿素的目的，这种测定方法主要用于来测定植物叶片叶绿素含 量，用以判断作物生长状况，指导作物生产中的施肥和灌溉。

实施例1

首先，准备小麦叶片作为样品。实验所用的小麦品种为京9843、 农大211、京东12、烟农19四个品种。选择具有代表性的120个小 麦叶片作为实验样品，所选小麦叶片样品的生长阶段、大小、颜色等 差异尽量大。小麦叶片样品包含返青、拔节、孕穗、抽穗、开花、灌 浆、成熟过程的小麦叶片，小麦生长前期取新展开的第一叶片作为测 定部位，生长中后期则取功能叶作为测定部位。将样品分为两组，一 组为100个用于模型建立，另一组20个用于模型验证评估。

然后，测量叶绿素值。首先用SPAD502仪测出相应的SPAD值 (即叶绿素含量的相对值)，每个叶片用SPAD-502测量10个点取平 均值为该片叶子的SPAD值，该SPAD值作为该叶片的叶绿素值。测 量完后采集每个叶片的激光后向散射图像，从采集到样品的测量全过 程在8小时内完成。

之后，进行后向散射图像的采集。叶片样品台位于CCD摄像头 5正下方15-20cm，叶片样品台可以放置固定不同大小的叶片样品， 叶片展开放平，并用透明胶带粘贴固定，样品台具有升降装置，可以 微调样品与CCD摄像头之间的距离。

在图像采集时，选用波长为670nm的激光器，激光器固定于支 撑上，激光器与样品台上的样品的距离5-10cm，激光器与CCD摄像 头的垂直方向的夹角5～20°。而且激光器与样品台上样品间的距离 可调，激光器与CCD摄像头的垂直方向的夹角也可以调节。通过数 据传输线，激光器接在激光器控制器上，激光控制器可以调整激光的 光强和光斑大小等等。

用CCD摄像头的可见光图像采集功能，在可见光条件下，采集 小麦叶片的图像，观察小麦叶片的图像效果，通过调整CCD摄像头 的光圈大小和焦距，使得图像在可见光条件下，小麦叶片位于图像中 间位置，并分辨率、清晰度达到最佳，再改用CCD摄像头的图像采 集功能。打开激光器，调节支撑架使得激光器的光斑位于样品的正上 方。通过调整激光器控制器调节激光器的光束、光强、光斑大小等等， 使得光斑不大于小麦叶片的宽度。

采集小麦叶片的激光后向散射图像，观察图像效果，通过调节 CCD摄像头的光圈及焦距和激光器控制器，使得激光后向散射图像 清晰且曝光度均匀。所采集的绿叶、黄叶、干叶的图像依次如图2～4 所示。

对所采集的激光后向散射图像进行灰度转化、去噪、背景分割、 信息提取等处理。

为降低图像存储空间和处理的数据量，对图像进行格式转化，把 图像从24位RGB真彩图像转化为256级灰度图像。

接着，进行图像信息提取，包括以下步骤：

1、选取光斑图像中心点：对采集到的植物叶片的激光后向散射 图像进行灰度转化，用中值滤波等进行图像去噪处理，得到比较干净 的圆形光斑，然后使用MATLAB中的regionprops函数直接获得光斑 图像的中心，并使用进行边缘检测。

2、光强平均值的提取：以中心点为中心，以5个像素为步长， 画同心圆，每个同心圆的十字坐标方向的像素值相加取平均作为距离 中心点一定距离的像素值，依次完成光强平均值的提取，提取绿叶、 黄叶和干叶的相对光强分布曲线如图5所示。

3、光学特性参数提取：光强值对应着距离坐标值，根据漫射近 似理论反演出光学特性参数，漫射理论公式如下，μ′_s为约化散射系数， μ_a为吸收系数，当无限细光束垂直入射到组织表面时，在外延边界条 件下，且漫射系数D取：时，漫射方程的近似解：

$R\left(\rho \right)=\frac{1}{4\pi }[z_0({\mu }_{\mathrm{eff}}+\frac{1}{r_1})\frac{\exp (-{\mu }_{\mathrm{eff}}{r}_1)}{{r_1}^2}+(z_0+2z_b)({\mu }_{\mathrm{eff}}+\frac{1}{r_2})\frac{\exp (-{\mu }_{\mathrm{eff}}{r}_2)}{{r_2}^2}]$

式中：z₀＝(μ_a+μ′_s)^-1，μ_eff＝[3μ_a(μ_a+μ′_s)]^1/2，R(ρ)为光强值，ρ为激光器的出光口与叶片表面之 间的垂直距离，R_eff为组织表面向组织内的反射系数， 当组织的折射率n＝1.4时，R_eff＝0.493。

利用以上公式，由试验获得的组织表面漫射光分布运用函数 polyfit来进行最小二乘法多项式进行非线性拟合，从而获得组织内部 的吸收系数μ_a和约化散射系数μ′_s，即只要知道了光强R和距离ρ， 就可以反演出吸收系数μ_a和约化散射系数μ′_s，根据所述叶绿素含量 和光学特性参数进行线性回归，如图6所示。

叶绿素含量与光学参数关系模型的建立：用光学特性参数(约化 散射系数、吸收系数)与SPAD值建立对应的函数关系，即只要知道 了叶片的光学特性参数(约化散射系数、吸收系数)就可通过这种函 数关系计算出叶片叶绿素的SPAD值，最终实现使用激光后向散射图 像测量叶绿素含量的目的。用线性回归方法建立起来的光学特性参数 与叶绿素含量之间的模型预测效果图，如图7和图8所示，模型的函 数式具体如下：

(1)y＝4.5759x-74.507，x为约化散射系数，y为叶绿素的SPAD 值。

(2)y＝393.62x-23.697，x为吸收系数，y为叶绿素的SPAD值。

定量预测模型建立过程中，对于120个小麦叶片样本，根据其 SPAD值的大小排序按2∶1的比例划分校正集、预测集，校正集用于 建立SPAD值与光学特性参数的对应模型关系，预测集用于验证该模 型是否满足要求。用划分校正集、预测集来建立预测模型是通用的方 法，这里不再详述。

利用上述方法建立定性与定量模型后，均采用预测集样品来进行 验证，验证过程均为：把对采集的预测集样品的激光后向散射图像进 行处理，提取出光学特性参数，将其光学特性参数代入已建立的模型， 根据该模型中已建立SPAD值与光学特性参数的对应关系模型，计算 出植物叶片的SPAD预测值，然后根据预测值与真实值，计算出相关 系数，用相关系数来衡量模型的误差值是否满足要求，一般相关系数 大于0.7，说明模型效果较好。并根据误差要求，对模型进行反复优 化。如果模型达不到要求，需重新采集样品、重复步骤上面的步骤， 直至所建立的模型满足要求。图9和图10结果表明，所建立的预测 模型能准确识测量植物叶片的叶绿素含量。

本发明还公开了一种植物叶片叶绿素含量测量系统，包括：

图像获取模块，用于通过激光器的出射光线照射待测植物叶片表 面，并通过图像传感器获取所述待测植物叶片表面的激光后向散射图 像；

中心获取模块，用于对所述待测植物叶片表面的激光后向散射图 像进行灰度转化，对转化后的图像进行去噪处理，再对去噪后的图像 中的光斑进行边缘检测，并获取光斑的中心；

像素值获取模块，用于以所述光斑的中心为圆心、N个像素为步 长作同心圆，直至到达所述光斑的边缘，将每个同心圆的横纵坐标方 向的像素值相加取平均值作为距离中心点预设距离的像素值，其中， N为大于零的整数；

反演模块，用于构建漫射方程，将所述预设距离和对应的像素值 代入所述漫射方程，对所述漫射方程进行反演，以获得光学特性参数， 所述光学特征参数包括：约化散射系数和吸收系数中的至少一个；

叶绿素含量获得模块，用于利用回归方法建立叶绿素含量与光学 特性参数之间的预测关系模型，根据所述预测关系模型获得所述待测 植物叶片的叶绿素含量。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关 技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下， 还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明 的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。