他莫昔芬联合雷帕霉素、人参皂苷Rg3复合物在制备治疗肝癌药物中的应用

摘要

本发明涉及他莫昔芬联合雷帕霉素、人参皂苷Rg3在制备治疗肝癌药物中的应用。他莫昔芬联合雷帕霉素、人参皂苷Rg3治疗肝癌时，能增加肝癌细胞对化疗的敏感性。他莫昔芬通过抑制Akt的活性诱导乳腺上皮细胞凋亡，而当Akt通路激活后则诱导乳腺癌细胞产生对他莫昔芬的耐药。三者联用，能协同诱导肿瘤细胞凋亡。同时人参皂苷Rg3能够抑制肿瘤细胞VEGF的表达，从而抑制肿瘤血管的形成；还能够抑制基质金属蛋白酶的表达，干扰内皮细胞与细胞外基质的相互作用，从而阻断肿瘤的浸润与转移，提高手术治疗的彻底性，减少术后复发转移的几率，能够提高肿瘤病人的自身免疫力，抑制肿瘤的转移，并降低肿瘤病人放化疗后的毒副作用。

说明书

技术领域

本发明涉及他莫昔芬联合雷帕霉素、人参皂苷Rg3在制备治疗肝癌药物中的应用。

背景技术

肝癌是江苏省的高发肿瘤，进展迅速，其发病率、死亡率均较高。除可切除的小型肝癌患者的5年存活率达到80～90%外，不能手术的肝癌患者自症状发作后的平均存活时间只有3～4个月。目前肝癌治疗仍以手术切除为主，然而能够施行完全肝癌切除手术患者比例不到肝癌总例数的10%，其余90%肝癌患者不能手术切除肝癌，或即便能手术切除肝癌，80%的病人在术后两年内复发。

许多临床病理因素影响其愈后，并可作为肝癌的愈后因子。其中Survivin已被报道是预测肝癌复发的一种有用指标；磷酸化Akt（p-Akt）过度表达常常与肝癌预后不良密切相关。研究发现survivin、p-Akt异常表达是肝癌手术后复发的危险因子，且两者可作为肝癌复发的独立的危险因子。因此，有这些危险因素的肝癌病人，术后要考虑给予辅助治疗。肝癌药物辅助治疗及术后治疗成了一个重要方法。目前常用的化疗药物有阿霉素、氟尿嘧啶、顺铂等进行静脉或肝动脉输注或栓塞化疗，然而由于肝癌时肝脏已经受到严重损害，导致具体治疗选择受到很大制约，而且这些疗法不仅毒性严重，且通常也无明显疾病缓解或延长生命效果。靶向治疗药物sorafenib具有抗肿瘤血管形成和抗细胞增殖作用，因副作用轻，能延长病人的生存而受肿瘤关注，但因其价格昂贵，限制了其在临床使用。因此，迫切需要有效、低毒及价廉的药物,为肝癌的治疗提供一个新措施。

近年来国内外的研究发现肝癌组织中存在雌激素受体，雌激素通过雌激素受体介导的信号通路来诱导基因转录，从而诱导肝癌的发生。原发性肝癌组织雌激素受体表达的阳性率与肝癌的分期有关，提示早期的肝癌可能更大程度上依赖雌激素，为肝癌的内分泌治疗提供了理论依据。

他莫昔芬是一种非甾体抗雌激素药物，因其疗效好，副作用轻，价格低廉已广泛用于雌激素受体阳性的各期乳腺癌的治疗。其抗肿瘤作用是通过雌激素受体依赖和非雌激素受体依赖的机制诱导乳腺癌细胞凋亡。目前，在肝癌研究中也发现，他莫昔芬除了通过与雌激素受体结合发挥作用外，还通过调节蛋白激酶C活性、氧化应激、钙内流机制发挥作用。新近研究发现他莫昔芬通过下调端粒酶活性诱导肝癌细胞凋亡。临床随机对照研究结果显示，晚期、无法进行手术切除的肝癌患者，口服他莫昔芬能够延长病人生存且无明显毒副反应，初步显示出他莫昔芬在肝癌治疗中良好的应用前景。因此，在晚期肝癌或肝癌术后患者中值得推广使用。

目前文献报道在临床应用一般为他莫昔芬，或他莫昔芬和雷帕霉素联用，但实际临床经验获知患者在使用上述药物时，仍然发现疗效增效不大，且特别是患者为手术切除肝癌的患者，复发率较高，且术后愈合缓慢。

发明内容：

本发明提供了他莫昔芬联合雷帕霉素、人参皂苷Rg3复合物在制备治疗肝癌药物中的应用治疗肝癌的新方案。

人参皂苷Rg3；本发明的技术方案为：

他莫昔芬联合雷帕霉素、人参皂苷Rg3在制备治疗肝癌药物中的应用。按重量分数计所述的复合物由人参皂苷Rg3 1-2份，他莫昔芬1-2份，雷帕霉素0.01-0.02份构成。

有益效果

1、他莫昔芬联合雷帕霉素、人参皂苷Rg3治疗肝癌时，能增加肝癌细胞对化疗的敏

感性。他莫昔芬通过抑制Akt的活性诱导乳腺上皮细胞凋亡，而当Akt通路激活后则诱导乳腺癌细胞产生对他莫昔芬的耐药。三者联用，能协同诱导肿瘤细胞凋亡。同时人参皂苷Rg3能够抑制肿瘤细胞VEGF的表达，从而抑制肿瘤血管的形成；还能够抑制基质金属蛋白酶的表达，干扰内皮细胞与细胞外基质的相互作用，从而阻断肿瘤的浸润与转移，提高手术治疗的彻底性，减少术后复发转移的几率，能够提高肿瘤病人的自身免疫力，抑制肿瘤的转移，并降低肿瘤病人放化疗后的毒副作用。

2、本发明通过复方组配的复合物治疗肝癌，发挥各种药物的协同作用，同时降低单个药物副作用，其组方疗效显著。

附图说明

附图1为不同药物对survivin、p-Akt阳性表达患者的生存时间，其中A组：观察组； B组：单药治疗组； C组：三药联合治疗组。

 

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。他莫昔芬联合雷帕霉素人参皂苷Rg3复合物以下简称复合物，且所述的复合物由人参皂苷Rg3 1-2g，他莫昔芬1-2g，雷帕霉素0.01-0.02mg构成。

实施例1

1. 试剂: RPMI-1640培养基为美国GIBCOL BRL公司产品；鼠抗survivin、 p70s6k Thr389单克隆抗体购自Cell signal公司；二抗HRP标记抗鼠lgG、化学发光(ECL)底物购自Santa Cruz公司；他莫昔芬，雷帕霉素、人参皂苷Rg3皆购自Sigma公司, 海肾荧光素酶质粒pRL-CMV 购自Promega 公司。质粒pLUC编码萤火虫荧光素酶基因和survivin启动子序列由美国北卡罗里大学Xun博士惠赠。 

2. 细胞培养:人肝癌HepG2细胞株常规培养于RPMI-1640培养液中，内加10%小牛血清、人青霉素(浓度l00 U/ml)和链霉素(浓度100 μg/ml)，37℃、5%CO₂培养箱中培养。孵育箱内贴壁生长3～4代后,取对数生长期的细胞进行实验。

 3.分组：将对数生长期细胞制成单个细胞悬液，以每孔1×10⁴个细胞接种到6孔板，每孔加100μl,37℃、5%CO₂湿度培养箱中24h后，第二天分别加入含有20μM他莫昔芬、10nM雷帕霉素(在20μM他莫昔芬前1小时), 10nM复合物，同时设立阴性对照，即阳性对照组为20μM他莫昔芬、10nM雷帕霉素(在20μM他莫昔芬前1小时)。

 4. 四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法实验 ：将对数生长期细胞制成单个细胞悬液，以每孔2×10³个细胞接种到96孔板，每孔加100μl,37℃、5%CO₂湿度培养箱中24h后，分别加入含有不同浓度他莫昔芬、雷帕霉素、复合物的培养液100μl，每个样本不同浓度设平行的3个孔，对照组加不含样本的培养液100μl，再放入培养箱中孵育24～72 h。每孔加入用无血清1640按5mg/ml新鲜配制的MTT溶液20μl。继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μl二甲亚砜，振荡10min，测定490nm波长上各孔A值。

实验结果：

  复合物以浓度依赖方式减少HepG2细胞增殖，与对照药组比较，复合物浓度达到20μM时，细胞增殖活性下降至50%。复合物浓度在10μM时，细胞增殖活性下降与G0/G1期细胞比例增加有关。

 5.流式细胞仪检测细胞凋亡: 将各组细胞用胰酶消化后收集，水平离心5min，PBS洗2遍，离心弃上清，加入1ml 70%预冷乙醇中，吹打均匀，4℃固定12h以上。PBS洗涤去乙醇，1500rpm, 5min，弃上清，共洗2遍。 1ml PBS重悬细胞，调节细胞浓度达10⁴/ml个，加入PI染液1ml，4℃冰箱，染色30-60min。离心，洗去PI染液，加少许PBS，上流式细胞仪进行检测。

       RT-PCR: 采用Invitrogen 公司的Trizol试剂，按照操作步骤提取细胞中的总RNA。以此RNA为模板，加入2.5mol/L oligo(dT)16和M-MLV逆转录酶，在37℃水浴1h，95℃维持灭活5 min，合成cDNA，合成的cDNA用于RT-PCR。survivin:上游引物5'-GGCTCTTTCTCTGTCCAGTT-3'，下游引物5'-ACCACCGCATCTCTACATTC-3'。 

        Western blot试验：各组细胞经冰PBS洗2次，加裂解液，冰上裂解lOmin，离心取上清。采用BCA蛋白质定量法测定蛋白质浓度，电泳前加2×SDS缓冲液，lOO℃水浴10min，6Oμg蛋白进行12% SDS-聚烯酰胺凝胶电泳；蛋白分离后，电泳转至硝酸纤维膜，室温封闭1h，一抗(鼠抗survivin；p70s6k Thr389) 4℃过夜，二抗室温1h，采用ECL显影，暗室压片。

   实验结果：RT-PCR和Western 法检测了20μM复合物，处理HepG2细胞48小时后survivin mRNA 和蛋白表达水平，结果显示survivin mRNA和蛋白表达水平均降低。用带有158bp的survivin核启动子的质粒转染HepG2细胞后，再用他莫昔芬处理，与对照相比，survivin启动子的活性急剧下降，结果提示复合物诱导细胞凋亡，且优于单个药物。

8.转染：于转染前一天将细胞接种到24孔板培养，实验当天细胞生长面积达70%，每个孔加400ng pLUC-sur，2ng海肾荧光素酶质粒pRL -CMV，以空质粒pcDNA3 .1 为对照，按照Lipofectamine 转染说明操作，转染至HepG2细胞。转染24小时后弃培养液，用PBS洗涤后，分别加入无血清培养液1.0ml，分别加入他莫昔芬、雷帕霉素，对照组加入等体积的无菌超纯水，继续培养6h，收集细胞，清洗细胞，每孔加入100μl双荧光素酶检测试剂盒中的细胞裂解液，进行细胞裂解收集。取20μl 细胞裂解产物，进行目的报告基因荧火虫荧光素酶及内对照海肾素荧光素酶检测，计算荧火虫荧光素酶的表达值与内对照肾素荧光素酶表达值的比值。

实验结果：HepG2细胞用复合物处理后，与对照相比，雷帕霉素单独使用减少细胞生长20%，survivin单独使用减少细胞生长45%，联合用药使用减少细胞生长近65%，显示出复合物在抑制细胞增殖中有协同作用。

   

实施例2

他莫昔芬抑制肿瘤生长在乳腺癌及肝癌的实验中已取得了明显的疗效，他莫昔芬联合雷帕霉素、人参皂苷Rg3能增强其细胞毒性药物的效果。因此他莫昔芬联合雷帕霉素、人参皂苷Rg3联合治疗，将为肝癌治疗提供一种高效、低毒、价廉的手段。

我们已在临床开展检测肝癌术后组织标本中survivin、p-Akt、ER表达100余例，对survivin、p-Akt阳性表达患者在门诊随访过程中部分应用莫昔芬联合雷帕霉素人参皂苷Rg3、他莫昔芬单药治疗和对照观察随访，至少2个以上疗程。结果显示：与单药治疗组和观察组（对照组未给药）相比，三药联合治疗组（莫昔芬联合雷帕霉素、人参皂苷Rg3复合物由人参皂苷Rg3 1-2份，他莫昔芬1-2份，雷帕霉素0.01-0.02份构成）

具有协同作用，能够延长肝癌患者缓解及生存时间，价格低廉且无明显不良反应，值得在临床进一步推广。

具体为病案号为：465289，465529，465309，466861，466546，466247，467585，468199，469578，470655，0476917，0478973。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏省人民医院

 

<120>  他莫昔芬联合雷帕霉素、人参皂苷Rg3复合物在制备治疗肝癌药物中的应用

 

<130> 

 

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<170>  PatentIn version 3.3

 

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<212>  DNA

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<212>  DNA

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