一种吐根药材及其制剂中盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱的HPLC定量方法

摘要

本发明涉及一种吐根药材及其制剂中盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱HPLC定量方法。其特征：首次采用HPLC法，以普通的等度洗脱，体积比为8～9.5∶3～5∶86～88的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；205nm为检测波长，同时测定了吐根药材及其流浸膏、浸膏与酊剂中盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱的含量，结束了吐根生物碱类在多国法定标准中一直都是酸碱滴定测定总生物碱；4次柱层析分离后，采用差示分光光度法，分别在283nm和350nm处以ΔA测定吐根酚碱和吐根碱的历史。本方法只需用酸性含水甲醇或含水甲醇，超声提取药材细粉或稀释各制剂后，吸取一定量续滤液，氧化铝柱除杂，即可进样测定。方法快捷、快捷、准确、重现。

说明书

技术领域

本发明涉及一种吐根药材及其制剂中盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱HPLC定量方 法。

背景技术

吐根为茜草科植物Cephaelis ipecacuanha(Brot.)A.Rich.或Cephaelis  acuminata Karsten的干燥根茎。是祛痰止咳药。是巴西、哥斯达黎加或印度进口药材， 在美国药典(24版)和欧洲药典(7.0)都有收载。美国药典收载有吐根药材、吐根粉和 吐根糖浆的质量标准，其含量测定是：分别测定吐根总生物碱、吐根碱和吐根酚碱的含 量。总生物碱采用氯仿提取后，酸碱回滴定法测定总生物碱含量。吐根碱和吐根酚碱的 含量测定则极其繁琐、费时，需用4根色谱柱，以不同的洗脱溶剂，经4次柱层析，将 吐根碱和吐根酚碱分离后，采用差示分光光度法，分别在283nm和350nm波长处，测定 吸收度A的差值，以ΔA计算含量。流程越长，待测成分的损失越多，导致方法的重现性 与准确性越差。目前为止，还没查阅到有关吐根生物碱类，用高效液相定量测定的报道。

在美国药典(24版)和欧洲药典(7.0)的检测方法基础上，由进口厂家起草， 中国药品生物制品检定所复核，制定了中国吐根药材的检验标准，含量测定仍然采用的 是有机溶剂提取后，酸碱回滴定法测定总生物碱含量。样品取样量大，花费的有机溶剂 多。不仅如此，原酸碱滴定方法，在供试品溶液的制备上存在着致命的缺陷。首先看滴 定法的样品前处理程序“取吐根药材粉末7.5g，精密称定，加乙醚100ml，振摇5分钟， 再加氨试液5ml，振摇1小时，加水5 ml，剧烈振摇，分出乙醚层，棉花过滤，滤液置 烧瓶中，残渣用乙醚洗涤2次，每次25 ml，合并乙醚提取液，蒸干，残渣加90％乙醇 2ml使溶解，蒸干，并在100℃加热干燥5分钟，残渣加90％的中性乙醇5ml，水浴加热 使溶解，精密加盐酸滴定液(0.1mol/L)15ml，加甲基红指示液1～2滴，用氢氧化钠滴 定液(0.1mol/L)滴定。每1ml盐酸滴定液(0.1mol/L)相当于24.03mg的吐根碱 (C₂₉H₄₀N₂O₄)。该处理程序不合理之处在于：

1)选择的提取溶剂乙醚，穿透力太弱，无法直接从植物细粉中将生物碱定量提 取出来。

2)加少量氨试液的目的是为了使植物细胞中的生物碱游离，增大乙醚的穿透力， 使生物碱易被乙醚提取出来，应先加氨试液，再加乙醚。可操作却是先加乙醚，再加氨 试液，这样乙醚包覆了细粉，氨试液不能充分与细粉接触，乙醚的穿透力得不到提高， 生物碱很难提取完全。

3)从植物细粉中提取生物碱，除了利用提取溶剂的相似相溶与强大穿透力之外， 还要借助于外力，即加热或超声。原处理程序中的“振摇”操作，既无振摇频率，也无 振摇强度和振摇次数，这样，“振摇”操作会因人而异，方法的重现性很难保证。

4)在吐根细粉、水和氨试液相互混合的乳状混合液容器中，如何在不更换容器 的情况下，将乙醚提取液定量地与细粉分离又是影响方法准确性和重现性的因素。

5)“残渣加90％乙醇2ml使溶解，蒸干”，该操作是否更换容器，按字面意思， 是不更换容器的，假若如此，该步操作的意义何在？

综上原因，原酸碱滴定方法不但操作程序长、乙醚用量大、污染环境，而且存在 众多不确定因素，无法定量地将生物碱提取出来，也就无法准确地进行定量测定。

吐根流浸膏、吐根浸膏都是按中国药典2010年版一部附录IO项下的规定制备， 吐根酊剂是按中国药典2010年版一部附录IN项下规定的乙醇稀释流浸膏制成。吐根流 浸膏和吐根酊剂是小儿化痰止咳颗粒剂质量标准项下附带的原料制剂，其定量测定方法 都是酸溶解，氯仿萃取除杂，再碱化，氯仿萃取生物碱后，蒸干，酸碱滴定，操作繁琐， 污染环境，准确度难以保证。

在上述背景情况下，为简便、快捷、科学、准确、多指标控制吐根药材与其流浸 膏、浸膏和酊剂的质量，发明了吐根药材及其制剂中盐酸吐根酚碱和吐根碱HPLC定量 方法。

发明内容

首次报道了盐酸吐根酚碱与盐酸吐根碱的光谱扫描图(见图1、2)，以此为依据， 采用HPLC法、普通的等度洗脱、反相色谱柱，体积比为8～9.5∶3～5∶86～88的乙腈 -甲醇-0.1％磷酸为流动相；205nm为检测波长，同时测定了吐根药材及其流浸膏、浸膏 与酊剂中盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱的含量，结束了吐根生物碱类在多国法定标准中一 直都是酸碱滴定测定总生物碱；4次柱层析分离后，采用差示分光光度法，分别在283nm 和350nm处测定吐根酚碱和吐根碱的历史。发明方法只需用酸性含水甲醇或含水甲醇， 超声提取药材细粉或稀释其流浸膏、浸膏与酊剂后，吸取一定量续滤液，氧化铝柱除杂， 即可进样测定，方法简便、快捷、准确、重现。

通过方法学考察，盐酸吐根酚碱进样量在0.01456～0.2184μg，与峰面积呈良好的 线性关系，回归方程为：Y＝8184939.7X+1642，，γ＝0.99997(见表1、图3)；盐酸吐根碱 进样量在0.0321～0.321μg，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程：Y＝6856886.5X- 18354，γ＝0.99997(见表2、图4)。采用加样回收实验，结果表明：盐酸吐根酚碱的平 均回收率为96.93％(n＝9)，RSD为1.31％(见表3)；盐酸吐根碱的平均回收率为99.47％ (n＝9)，RSD为2.02％(见表4)。精密度(见表5)、稳定性(见表6)、重复性(见表7)、 柱耐用性(见表8)实验均符合方法学要求。适用于吐根药材(见图5、6)及其制剂(见 图7、8)中盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱的定量测定。

本发明测定吐根药材及其制剂中盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱含量所采用的技术方 案为：

(1)色谱条件与系统适用性试验  以体积比为8～9.5∶3～5∶86～88的乙腈-甲 醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：40℃；检测波长为205nm；理论板数按盐酸吐根碱峰计算 应不低于1500；

(2)对照品溶液的制备取盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱对照品适量，精密称定， 置棕色量瓶中，加甲醇制成原液，再取原液，加流动相制成每1ml含盐酸吐根酚碱10～ 30μg、盐酸吐根碱30～10μg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备取吐根药材细粉0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中； 或取相当于1g吐根药材的制剂，置25ml的量瓶中；药材细粉精密加入1∶200的盐酸 -60％甲醇混合溶液25ml，密塞，称定重量，以功率250W，频率40kHz超声处理30分钟， 放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；吐根制剂加60％甲醇至刻度，   摇匀，滤过；精密量取药材细粉续滤液2ml或制剂续滤液1ml，置装有100-120目中性氧 化铝1～1.5 g内径1cm的中性氧化铝柱上，并洗脱至10 ml的量瓶中至约9 ml，加1 滴磷酸，用60％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试 品溶液，即得；

(4)测定法  分别精密吸取对照品溶液5μl，供试品溶液2-10μl，注入液相色 谱仪，测定，即得。

本发明的原理如下：

吐根酚碱和吐根碱为有机碱，可以与酸生成盐类，增大在亲水性溶剂中的溶解度， 被定量提取出来。所以直接以酸性含水甲醇或含水甲醇，超声提取药材细粉或稀释其流 浸膏、浸膏或酊剂后，吸取一定量续滤液，氧化铝柱除杂，即可进样测定。方法无萃取、 无蒸干、简便、快捷、实用。通过调整乙腈、甲醇与0.1％磷酸的体积比，使吐根酚碱和 吐根碱在不同的色谱柱上，波峰分离良好。再依据二种生物碱成分的进样量在一定范围 内，与其峰面积呈现良好的线性关系，而用于定量测定。

本发明的创新点及有益效果如下：

(1)首次报道了盐酸吐根酚碱与盐酸吐根碱的光谱扫描图，结果显示：二者光谱 扫描图基本一致，呈现三个吸收峰，分别为203±1nm、225±2nm、282±2nm，其波峰 的灵敏度，按波长的由小到大依次递减，三个吸收峰都能作为该生物碱的检测波长，但 从减少色谱柱污染、延长其使用寿命考虑，选择近于205nm处，作为检测波长，取样量 少，灵敏度高。该结果为同行进行吐根药材与制剂的测定提供了参考。

(2)首次采用HPLC法，以普通的等度洗脱、反相色谱柱，体积比为8～9.5∶3～ 5∶86～88的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；205nm为检测波长，同时测定了吐根药材 及其流浸膏、浸膏与酊剂中盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱的含量。方法只需用酸性含水甲 醇或含水甲醇，超声提取药材细粉或稀释流浸膏后，吸取一定量续滤液，氧化铝柱除杂， 即可进样测定，方法无浓缩、无萃取，无蒸干、简便、快捷、准确、重现。

(3)本测定方法的问世，结束了吐根生物碱类在多国法定标准中一直都是酸碱滴 定测定总生物碱；4次柱层析分离后，采用差示分光光度法，分别在283nm和350nm处， 以ΔA测定吐根酚碱和吐根碱的历史。大幅度降低了取样量，节约了检测时间，排除了毒 害试剂对环境污染，提高了方法的准确度与重现性。

(4)通过采用酸碱滴定方法与HPLC方法，对吐根药材含量的测定比较，结果说 明：原酸碱滴定方法不但操作程序长、乙醚用量大、污染环境，而且存在着提取溶剂选 择不当、氨试液的加入顺序欠妥、方法描述不严谨等众多不确定因素，导致无法定量地 将吐根生物碱类从植物组织中提取出来，也就无法准确地进行定量测定。出现了酸碱滴 定法的总碱含量小于HPLC法测定的二碱之和的情况(见表9)。

(5)吐根药材及其流浸膏剂的HPLC色谱图显示，二者都在60分钟之后，还有 一个强保留的未知波峰，其面积约占总峰面积的30％左右(见图9、11)，必须通过氧化 铝柱除杂，将其去除，缩短含量测定的运行时间(见图10、12)。以此提示：在吐根药材 及其流浸膏剂中主要成分并不是文献报道的吐根酚碱和吐根碱，还含另一占总峰面积 30％的未知成分，其化学结构与药效有待进一步研究。

附图说明

图1盐酸吐根酚碱峰的光谱扫描图

图2盐酸吐根碱峰的光谱扫描图

图3盐酸吐根酚碱线性关系图

图4盐酸吐根碱线性关系图

图5盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱对照品HPLC色谱图

图6吐根药材HPLC色谱图

图7盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱对照品HPLC色谱图

图8吐根流浸膏剂HPLC色谱图

图9吐根药材保留时间60分钟后的未知峰

图10氧化铝去除药材中未知峰的色谱图

图11吐根流浸膏剂保留时间60分钟后的未知峰

图12氧化铝去除流浸膏剂中未知峰的色谱图

图1、图2中，纵坐标为吸收度；横坐标为波长(nm)

图3、图4中，纵坐标为峰面积；横坐标为进样量(μg)

图5～图12中，1为盐酸吐根酚碱峰，2为盐酸吐根碱峰，3为未知峰

本发明具体实施方式

实施例1：吐根药材中盐酸吐根酚碱和吐根碱HPLC定量方法

(1)色谱条件与系统适用性试验  以体积比为9∶3∶88的乙腈-甲醇-0.1％磷酸 为流动相；柱温：40℃；检测波长为205nm；理论板数按盐酸吐根碱峰计算应不低于1500；

(2)对照品溶液的制备  取盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱对照品适量，精密称定， 置棕色量瓶中，加甲醇制成原液，再取原液，加流动相制成每1ml含盐酸吐根酚碱10～ 30μg、盐酸吐根碱30～10μg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备  取吐根药材细粉0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入1∶200的盐酸-60％甲醇混合溶液25ml，密塞，称定重量，以功率250W，频率 40kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精 密量取续滤液2ml，置装有100-120目中性氧化铝1.5 g内径1cm的中性氧化铝柱上， 并洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用60％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用 0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，即得；

(4)测定法  分别精密吸取对照品溶液5μl，供试品溶液5-10μl，注入液相色 谱仪，测定，计算含量。测定了6批不同产地的吐根药材含量，结果见表9。

实施例2：吐根流浸膏中盐酸吐根酚碱和吐根碱HPLC定量方法

(1)色谱条件与系统适用性试验  以体积比为8.5∶4∶87.5的乙腈-甲醇-0.1％ 磷酸为流动相；柱温：40℃；检测波长为205nm；理论板数按盐酸吐根碱峰计算应不低于 1500；

(2)对照品溶液的制备  取盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱对照品适量，精密称定， 置棕色量瓶中，加甲醇制成原液，再取原液，加流动相制成每1ml含盐酸吐根酚碱10～ 30μg、盐酸吐根碱30～10μg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备  精密吸取吐根流浸膏1ml，置25ml的量瓶中，加60％ 甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置装有100-120目中性氧化铝1g内 径1cm的中性氧化铝柱上，并洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用60％的 甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，即得；

(4)测定法  分别精密吸取对照品溶液5μl，供试品溶液2-3μl，注入液相色 谱仪，测定，计算含量。测定了3批吐根流浸膏剂含量，结果见表9。

实施例3：吐根酊剂中盐酸吐根酚碱和吐根碱HPLC定量方法

(1)色谱条件与系统适用性试验  以体积比为9.5∶3.1∶87.4的乙腈-甲醇-0.1％ 磷酸为流动相；柱温：40℃；检测波长为205nm；理论板数按盐酸吐根碱峰计算应不低于 1500；

(2)对照品溶液的制备  取盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱对照品适量，精密称定， 置棕色量瓶中，加甲醇制成原液，再取原液，加流动相制成每1ml含盐酸吐根酚碱10～ 30μg、盐酸吐根碱30～10μg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备  精密吸取吐根酊剂20ml，置25ml的量瓶中，加60％ 甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置装有100-120目中性氧化铝1g内 径1cm的中性氧化铝柱上，并洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用60％的 甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，即得；

(4)测定法  分别精密吸取对照品溶液5μl，供试品溶液2-3μl，注入液相色 谱仪，测定，计算含量。测定了1批吐根酊剂含量，结果见表9。

实施例4：吐根浸膏剂中盐酸吐根酚碱和吐根碱HPLC定量方法

(1)色谱条件与系统适用性试验  以体积比为9∶3.5∶87.5的乙腈-甲醇-0.1％ 磷酸为流动相；柱温：40℃；检测波长为205nm；理论板数按盐酸吐根碱峰计算应不低于 1500；

(2)对照品溶液的制备  取盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱对照品适量，精密称定， 置棕色量瓶中，加甲醇制成原液，再取原液，加流动相制成每1ml含盐酸吐根酚碱10～ 30μg、盐酸吐根碱30～10μg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备  取吐根浸膏0.5g，置25ml的量瓶中，精密称定，加 60％甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置装有100-120目中性氧化铝1g内 径1cm的中性氧化铝柱上，并洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用60％的 甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，即得；

(4)测定法  分别精密吸取对照品溶液5μl，供试品溶液2-3 μ l，注入液相色 谱仪，测定，计算含量。测定了1批吐根浸膏含量，结果见表9。

表1盐酸吐根酚碱进样量与峰面积

表2盐酸吐根碱进样量与峰面积

表3样品中盐酸吐根酚碱的回收率试验结果

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表4样品中盐酸吐根碱的回收率试验结果

表5精密度实验结果(峰面积)

表6稳定性实验结果(峰面积)

表7重复性试验结果(mg/g)

表8吐根药材酸碱滴定方法与HPLC方法测定结果比较

表9药材与制剂中盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱含量测定结果

注：哥斯是哥斯达黎加的缩写