一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法

摘要

本发明公开了一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，其涉及一种定量检测方法，特别是涉及一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，本发明通过部分光漂白受体，用供体、受体两种激发光交替激发样品，采集受体部分光漂白前后供体通道和受体通道的荧光强度，即可定量获得供体-受体对的FRET效率。该方法直接对待测样品进行检测，不需要任何辅助样品和额外的系统校正与补偿，不仅可以定量检测供体受体浓度比为1:1时FRET效率,而且还可以有效解决一个供体与多个受体存在时的FRET效率定量检测。该方法操作简单，对样品光损伤小，可以对同一个样品进行多次重复检测，可应用于样品中供体受体对FRET效率的快速定量检测中。

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量检测方法，特别是涉及一种基于受体部分光 漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法。

背景技术

荧光共振能量转移(FRET)是一个依赖于距离的光物理进程，处 于激发态的荧光团通过偶极子间的相互作用将能量以非辐射的方式 转移给邻近的受体分子。FRET效率(E)是因发生FRET效应而使供 体转移给受体的能量百分比，因E与供受体间距离的六次方成反比， 对距离的变化非常敏感，测量尺度在纳米范围，FRET技术被广泛应用 于研究生物学、化学、医学问题如蛋白质间相互作用和构象的变化。

目前应用最为广泛的是荧光寿命测量法(FLIM)和敏化受体发射 法(E-FRET)。荧光寿命测量法是目前较为精确的方法，其他E的计 算方法一般都以荧光寿命法作为对照，然而荧光寿命测量法所用仪器 比较贵重，对激光器和人员技能要求较高，而且测量时间比较长，容 易对样品进行光漂白。此外，E-FRET方法能够较为精确的测量E，但 受光漂白程度、系统参数、供体激发光串扰和受体发射光串扰的影响， 不仅需要多个辅助样品而且整个实验过程中需保证系统参数不变。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种操作简单的、适用于活 样品快速定量检测的FRET效率定量检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于受体部分 光漂白和供体受体交替激发的FRET效率定量检测方法，包括先检测 供体再检测受体方法或先检测受体再检测供体方法的处理步骤，其中 先检测供体再检测受体方法处理步骤包括：

A：选用供体激发光激发供体受体对，用供体通道采集供体发射 的荧光强度，记为I_DD′；

B：选用受体激发光仅激发受体，用受体通道采集受体发射的荧 光强度，记为I_AA′；

C：利用最大强度的受体激发光漂白部分受体；

D：选用供体激发光激发漂白后的供体受体对，用供体通道采集 供体发射的荧光强度，记为

E：选用受体激发光仅激发漂白后的受体，用受体通道采集受体 发射的荧光强度，记为

F：计算部分受体光漂白前后供体通道荧光强度的增加量ΔI_DD′及 受体通道荧光强度的减少量ΔI_AA′：

$\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }=I_{\mathrm{DD}}^{\mathrm{post}\prime }-{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime };$

$\Delta {I_{\mathrm{AA}}}^{\prime }={I_{\mathrm{AA}}}^{\prime }-I_{\mathrm{AA}}^{\mathrm{post}\prime };$

G：计算漂白区域FRET效率E′：

$E^{\prime }=\frac{\frac{\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }}{{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }}}{k\frac{\Delta {I_{\mathrm{AA}}}^{\prime }}{{I_{\mathrm{AA}}}^{\prime }}+\frac{\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }}{{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }}};$

先检测受体再检测供体方法处理步骤包括：

A1：选用受体激发光仅激发受体，用受体通道采集受体发射的荧 光强度，记为I_AA″；

B1：选用供体激发光激发供体受体对，用供体通道采集供体发射 的荧光强度，记为I_DD″；

C1：利用最大强度的受体激发光漂白部分受体；

D1：选用受体激发光仅激发漂白后的受体，用受体通道采集受体 发射的荧光强度，记为

E1：选用供体激发光激发漂白后的供体受体对，用供体通道采集 供体发射的荧光强度，记为

F1：计算部分受体光漂白前后供体通道荧光强度的增加量ΔI_DD″ 及受体通道荧光强度的减少量ΔI_AA″：

$\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }=I_{\mathrm{DD}}^{\mathrm{post}\prime \prime }-{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime };$

$\Delta {I_{\mathrm{AA}}}^{\prime \prime }={I_{\mathrm{AA}}}^{\prime \prime }-I_{\mathrm{AA}}^{\mathrm{post}\prime \prime };$

G1：计算漂白区域FRET效率E″：

$E^{\prime \prime }=\frac{\frac{\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }}{{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }}}{k\frac{\Delta {I_{\mathrm{AA}}}^{\prime \prime }}{{I_{\mathrm{AA}}}^{\prime \prime }}+\frac{\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }}{{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }}}.$

进一步作为优选的实施方式，在扩散不可忽略的样本中，把先检 测供体再检测受体方法与先检测受体再检测供体方法分别测量的E′ 和E″值取平均值作为FRET效率的测量值E。

进一步作为优选的实施方式，激发光源是激光、汞灯、氙灯、LED 中的一种。

进一步作为优选的实施方式，部分受体光漂白后做时间序列，步 骤C或C1完成之后，每隔一个任意时间间隔，重复执行步骤D或D1、 E或E1，得到数据或或

进一步作为优选的实施方式，重复执行完步骤D或D1、E或E1 后，根据步骤F或F1所述的公式和得到数 据ΔI_DD′₁，ΔI_DD′₂或ΔI_DD″₁，ΔI_DD″₂、ΔI_AA′₁，ΔI_AA′₂或ΔI_AA″₁，ΔI_AA″₂。

进一步作为优选的实施方式，根据G或G1所述的公式：

得到$E^{\prime }=\frac{\frac{\Delta {I^{\prime }}_{\mathrm{DD}1}}{{I^{\prime }}_{\mathrm{DD}}}}{k\frac{\Delta {I^{\prime }}_{\mathrm{AA}1}}{{I^{\prime }}_{\mathrm{AA}}}+\frac{\Delta {I^{\prime }}_{\mathrm{DD}1}}{{I^{\prime }}_{\mathrm{DD}}}},$$E^{\prime \prime }=\frac{\frac{\Delta {I^{\prime }}_{\mathrm{DD}2}}{{I^{\prime }}_{\mathrm{DD}}}}{k\frac{\Delta {I^{\prime }}_{\mathrm{AA}1}}{{I^{\prime }}_{\mathrm{AA}}}+\frac{\Delta {I^{\prime }}_{\mathrm{DD}2}}{{I^{\prime }}_{\mathrm{DD}}}}$或$E^{\prime }=\frac{\frac{\Delta {I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}1}}{{I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}}}}{k\frac{\Delta {I^{\prime \prime }}_{\mathrm{AA}2}}{{I^{\prime \prime }}_{\mathrm{AA}}}+\frac{\Delta {I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}1}}{{I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}}}},$

$E^{\prime \prime }=\frac{\frac{\Delta {I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}1}}{{I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}}}}{k\frac{\Delta {I^{\prime \prime }}_{\mathrm{AA}1}}{{I^{\prime \prime }}_{\mathrm{AA}}}+\frac{\Delta {I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}1}}{{I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}}}}$计算其平均值即为E：

$E=\frac{1}{2}(E^{\prime }+E^{\prime \prime })$

本发明的有益效果：本发明通过部分光漂白受体，采用供体、受 体两种激发光交替激发，采集受体部分光漂白前后供体通道和受体通 道的荧光强度，即可定量获得供体受体对的FRET效率。该方法直接 对待测样品进行检测，不需要任何辅助样品和额外的系统校正与补 偿，不仅可以定量检测供体受体浓度比为1∶1时FRET效率，而且还 可以有效解决一个供体与多个受体存在时的FRET效率定量检测。该 方法操作简单，对样品光损伤小，可以对同一个样品进行多次重复检 测，因而特别适合对活样品中供体受体对FRET效率的快速定量检测。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明：

图1是本发明的FRET效率定量检测方法步骤流程图；

图2是在先检测供体再检测受体方法中的供体-受体对(18AA constructs)的供、受体荧光强度在光漂白过程中的变化；

图3是在先检测受体再检测供体方法中的供体-受体对(18AA constructs)的供、受体荧光强度在光漂白过程中的变化。

具体实施方式

参照图1，一种基于受体部分光漂白和供体受体交替激发的FRET 效率定量检测方法，包括先检测供体再检测受体方法或先检测受体再 检测供体方法的处理步骤，其中先检测供体再检测受体方法处理步骤 包括：

A：选用供体激发光激发供体受体对，用供体通道采集供体发射 的荧光强度，记为I_DD′；

B：选用受体激发光仅激发受体，用受体通道采集受体发射的荧 光强度，记为I_AA′；

C：利用最大强度的受体激发光漂白部分受体；

D：选用供体激发光激发漂白后的供体受体对，用供体通道采集 供体发射的荧光强度，记为

E：选用受体激发光仅激发漂白后的受体，用受体通道采集受体 发射的荧光强度，记为

F：计算部分受体光漂白前后供体通道荧光强度的增加量ΔI_DD′及 受体通道荧光强度的减少量ΔI_AA′：

$\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }=I_{\mathrm{DD}}^{\mathrm{post}\prime }-{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime };$

$\Delta {I_{\mathrm{AA}}}^{\prime }={I_{\mathrm{AA}}}^{\prime }-I_{\mathrm{AA}}^{\mathrm{post}\prime };$

G：计算漂白区域FRET效率E′：

$E^{\prime }=\frac{\frac{\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }}{{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }}}{k\frac{\Delta {I_{\mathrm{AA}}}^{\prime }}{{I_{\mathrm{AA}}}^{\prime }}+\frac{\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }}{{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime }}};$

先检测受体再检测供体方法处理步骤包括：

A1：选用受体激发光仅激发受体，用受体通道采集受体发射的荧 光强度，记为I_AA″；

B1：选用供体激发光激发供体受体对，用供体通道采集供体发射 的荧光强度，记为I_DD″；

C1：利用最大强度的受体激发光漂白部分受体；

D1：选用受体激发光仅激发漂白后的受体，用受体通道采集受体 发射的荧光强度，记为

E1：选用供体激发光激发漂白后的供体受体对，用供体通道采集 供体发射的荧光强度，记为

F1：计算部分受体光漂白前后供体通道荧光强度的增加量ΔI_DD″ 及受体通道荧光强度的减少量ΔI_AA″：

$\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }=I_{\mathrm{DD}}^{\mathrm{post}\prime \prime }-{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime };$

$\Delta {I_{\mathrm{AA}}}^{\prime \prime }={I_{\mathrm{AA}}}^{\prime \prime }-I_{\mathrm{AA}}^{\mathrm{post}\prime \prime };$

G1：计算漂白区域FRET效率E″：

$E^{\prime \prime }=\frac{\frac{\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }}{{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }}}{k\frac{\Delta {I_{\mathrm{AA}}}^{\prime \prime }}{{I_{\mathrm{AA}}}^{\prime \prime }}+\frac{\Delta {I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }}{{I_{\mathrm{DD}}}^{\prime \prime }}}.$

在扩散不可忽略的样本中，把先检测供体再检测受体方法与先检 测受体再检测供体方法分别测量的E′和E″值取平均值作为FRET效率 的测量值E。

激发光源是激光、汞灯、氙灯、LED中的一种。

部分受体光漂白后做时间序列，步骤C或C1完成之后，每隔一 个任意时间间隔，重复执行步骤D或D1、E或E1，得到数据或或

重复执行完步骤D或D1、E或E1后，根据步骤F或F1所述的公 式和得到数据ΔI_DD′₁，ΔI_DD′₂或ΔI_DD″₁，ΔI_DD″₂、ΔI_AA′₁， ΔI_AA′₂或ΔI_AA″₁，ΔI_AA″₂。

根据G或G1所述的公式：

$E=\frac{\frac{\Delta I_{\mathrm{DD}}}{I_{\mathrm{DD}}}}{k\frac{\Delta I_{\mathrm{AA}}}{I_{\mathrm{AA}}}+\frac{\Delta I_{\mathrm{DD}}}{I_{\mathrm{DD}}}},$

得到$E^{\prime }=\frac{\frac{\Delta {I^{\prime }}_{\mathrm{DD}1}}{{I^{\prime }}_{\mathrm{DD}}}}{k\frac{\Delta {I^{\prime }}_{\mathrm{AA}1}}{{I^{\prime }}_{\mathrm{AA}}}+\frac{\Delta {I^{\prime }}_{\mathrm{DD}1}}{{I^{\prime }}_{\mathrm{DD}}}},$$E^{\prime \prime }=\frac{\frac{\Delta {I^{\prime }}_{\mathrm{DD}2}}{{I^{\prime }}_{\mathrm{DD}}}}{k\frac{\Delta {I^{\prime }}_{\mathrm{AA}1}}{{I^{\prime }}_{\mathrm{AA}}}+\frac{\Delta {I^{\prime }}_{\mathrm{DD}2}}{{I^{\prime }}_{\mathrm{DD}}}}$或$E^{\prime }=\frac{\frac{\Delta {I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}1}}{{I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}}}}{k\frac{\Delta {I^{\prime \prime }}_{\mathrm{AA}2}}{{I^{\prime \prime }}_{\mathrm{AA}}}+\frac{\Delta {I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}1}}{{I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}}}},$

$E^{\prime \prime }=\frac{\frac{\Delta {I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}1}}{{I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}}}}{k\frac{\Delta {I^{\prime \prime }}_{\mathrm{AA}1}}{{I^{\prime \prime }}_{\mathrm{AA}}}+\frac{\Delta {I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}1}}{{I^{\prime \prime }}_{\mathrm{DD}}}}$计算其平均值即为E：

$E=\frac{1}{2}(E^{\prime }+E^{\prime \prime })$

在一种实施例中，选用人类肺腺癌ASTC-a-1细胞样品。所用供 体-受体对为18AA constructs(两端分别连接一个增强型青色荧光蛋 白(ECFP)、一个增强型黄色荧光蛋白(EYFP)以及二者之间连接的一段 包含18个氨基酸的序列组成(GLRSRAQASNSAVEGSAM))，具体步骤如 下：

(1)将ASTC-a-1细胞接种到平皿中培养24小时，转染质粒18AA constructs，在平皿中培养24小时；

(2)参照图2，在激光扫描共聚焦显微镜上进行双波长荧光成像 和受体光漂白，先采用氩离子激光器的458nm激光作为供体激发光， 激发ECFP，通过带通475-496nm供体通道采集供体ECFP发射的荧光 强度I_DD′，再采用氩离子激光器的514nm激光作为受体激发光，选择 性激发EYFP，通过长通560nm受体通道采集受体发射的荧光强度 I_AA′，然后采用最大强度的514nm激光选择性光漂白受体EYFP，采 集受体部分光漂白后供体通道和受体通道的荧光强度得 到供体通道荧光强度的增加量ΔI_DD′及受体通道荧光强度的减少量 ΔI_AA′；

(3)参照图3，在激光扫描共聚焦显微镜上进行双波长荧光成像 和受体光漂白，先采用氩离子激光器的514nm激光作为受体激发光， 激发EYFP，通过长通560nm受体通道采集受体发射的荧光强度I_AA″， 再采用氩离子激光器的458nm激光作为供体激发光，激发ECFP，通 过带通475-496nm供体通道采集供体ECFP发射的荧光强度I_DD″，然 后采用最大强度的514nm激光选择性光漂白受体EYFP，采集受体部 分光漂白后供体通道和受体通道的荧光强度得到供体 通道荧光强度的增加量ΔI_DD″及受体通道荧光强度的减少量ΔI_AA″；

(4)计算荧光共振能量转移效率E：

$E=\frac{1}{2}(E^{\prime }+E^{\prime \prime }).$

当然，本发明创造并不局限于上述实施方式，熟悉本领域的技术 人员在不违背本发明精神的前提下还可做出等同变形或替换，这些等 同的变形或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围。