一种克服靶细菌限制修饰障碍导入外源DNA的方法

摘要

本发明公开了一种克服靶细菌限制修饰障碍导入外源DNA的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：1)将靶细菌基因组中所有DNA甲基转移酶编码基因在自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌中共表达，得到重组菌A；2)将外源DNA分子导入所述重组菌A进行体内修饰，得到甲基化修饰的外源DNA分子；3)将所述甲基化修饰的外源DNA分子导入所述靶细菌中。本发明的实验证明，本发明与现有的克服细菌限制修饰障碍，实现遗传操作的方法相比转化率高。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种克服靶细菌限制修饰障碍导入外源DNA的方法。

背景技术

细菌限制修饰系统由限制性内切酶(限制酶)与DNA甲基转移酶组成，前者能够特异性 识别并切割DNA，后者能够向DNA的碱基添加一个甲基修饰，从而防止限制酶对DNA的切割。 限制修饰系统能够选择性的降解侵入细菌内部的外源DNA，实现细菌自我保护的目的。根据 限制修饰系统的亚基组成、切割位点、序列特异性与辅因子特征，将其划分为四大类型。I 型、II型和III型限制修饰系统的限制酶亚基能够识别并切割未甲基化的DNA，但如果DNA 首先被甲基转移酶亚基识别并修饰后，限制酶即不能完成切割。IV型限制修饰系统只有限制 酶组成，不含甲基转移酶，它识别并切割具有外源甲基化模式的DNA，因此，是一种甲基化 依赖的限制酶。另外，最近研究表明DNA骨架的磷硫酰修饰酶及其对应的限制酶是一类新型 的限制修饰系统(Nucleic Acids Research，38，7133-7141)。这种复杂的修饰-切割模式， 极大的保护了细菌自身DNA的安全性，是细菌作为有效防止噬菌体、环境中死细菌释放的DNA 等外源DNA入侵的主要手段。同时，这也成为现今利用分子生物学手段将外源DNA导入细菌、 实现遗传操作的主要障碍。含有多套限制修饰系统细菌的遗传操作尤为困难。

迄今为止研究人员发明了两类技术克服限制修饰障碍。第一类策略即修饰外源DNA的策 略，包括体外修饰和大肠杆菌体内修饰。如利用靶细菌粗蛋白抽提物(含有DNA甲基转移酶) 体外修饰外源DNA，能够实现对幽门螺杆菌、蜡样芽胞杆菌和韦氏芽胞杆菌的转化(Molecular Microbiology，37，1066-1074，Applied and Environmental Microbiology，74，7817-7820)； 或在大肠杆菌中克隆表达靶细菌DNA甲基转移酶，体内修饰外源质粒DNA，如在大肠杆菌TOP10 中克隆表达青春棒杆菌的两个DNA甲基转移酶，进行穿梭质粒的体内修饰，实现了青春棒杆 菌的遗传转化(Nucleic Acids Research，37，e3)。第二类方法即灭活限制修饰系统的方法， 包括利用物理手段灭活和基因敲除。利用转化后加热的方法暂时性灭活靶细菌限制酶，外源 质粒对谷氨酸棒杆菌转化率提高至10⁸CFU/μg DNA(Microbial Biotechnology，52， 541-545)；敲除丙酮丁醇梭菌CAC1502基因后可以使其接受非甲基化质粒DNA(PLoS ONE，5， e9038)；但也有报道表明敲除SauI限制性内切酶不足以使金黄色葡萄球菌接受外源DNA (Applied and Environmental Microbiology，75，3034-3038)。

虽然上述技术可以在一定程度上提高外源DNA对靶细菌的转化率，但是还存在以下问题 和不足之处：部分方案虽然能够利用靶细菌DNA甲基转移酶在体外修饰外源DNA分子，但利 用粗蛋白抽提物的体外修饰效率较低，且在修饰的同时限制酶也会降解部分质粒；体内修饰 方案未解除大肠杆菌自身DNA甲基转移酶对外源DNA分子的甲基化，这种带有大肠杆菌甲基 化模式的DNA易激活靶细菌的III型限制系统；许多细菌的限制酶为非热敏感性，不能利用 加热手段暂时灭活；如果细菌含有多套限制修饰系统时，逐个敲除限制酶基因费时费力，同 时敲除限制酶还造成靶细菌易受噬菌体感染，对工业微生物发酵菌种的构建极为不利；技术 的通用性不强，可能仅适用于一种或少数几种细菌

发明内容

本发明的一个目的是提供一种将外源DNA分子导入靶细菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将靶细菌基因组中所有DNA甲基转移酶编码基因在自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌 中共表达，得到重组菌A；

2)将外源DNA分子导入所述重组菌A进行体内修饰，得到甲基化修饰的外源DNA分子；

3)将所述甲基化修饰的外源DNA分子导入所述靶细菌中。

上述方法中，步骤1)中，所述将靶细菌基因组中所有的DNA甲基转移酶编码基因在自 身限制修饰系统缺失的大肠杆菌中共表达为将所述靶细菌基因组中所有的DNA甲基转移酶编 码基因通过重组载体导入所述自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌内；

步骤2)包括如下步骤：

A)将所述外源DNA分子导入所述重组菌A中，得到重组菌B；

B)诱导培养所述重组菌B，得到诱导后重组菌B；

C)提取所述诱导后重组菌B的DNA，即得到甲基化修饰的外源DNA分子。

上述方法中，步骤1)中，所述重组载体为将所述所有DNA甲基转移酶编码基因均插入 pWYE724质粒中，得到共表达所有DNA甲基转移酶的重组载体；

上述重组载体中的每个DNA甲基转移酶编码基因可以使用各自的启动子或共用一个启动 子(构成操纵子的结构)。

步骤2)的B)中，所述诱导培养采用的诱导剂为阿拉伯糖。

上述方法中，步骤2)的B)中，所述诱导培养为将所述重组菌B在含有终浓度为0.2％ (质量百分含量)的阿拉伯糖的液体培养基中诱导培养；

所述诱导培养的温度为25℃-37℃，所述诱导培养的时间为3-24小时；

所述诱导培养的温度具体为30℃，所述诱导培养的时间具体为12小时。

上述方法中，所述靶细菌为含有限制修饰系统的真细菌或古生菌，所述含有限制修饰系 统的真细菌或古生菌具体为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208、蜡样芽 胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 10987或汉氏硝化细菌(Nitrobacter hamburgensis)X14；

所述自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌具体为大肠杆菌(Escherichia coli)EC135CGMCC NO.5925；其限制修饰系统基因型为mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Δdcm::FRTΔdam::FRT。

上述方法中，所述外源DNA分子为pAD123、pAD43-25、pMK3、pMK4、pHCMC02、pHCMC04、 pDG148StuI、pWYE748或pBBR1-MCS5-P_{Nham_3450}-GFP。

上述方法中，所述解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208中所有DNA 甲基转移酶编码基因为BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835和 BAMTA208_16660；所述BAMTA208_06525、BAMTA208_6715、BAMTA208_19835和BAMTA208_16660 的核苷酸序列依次为序列表中的序列2、序列3、序列4和序列5；

所述蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 10987中所有DNA甲基转移酶编码基因为 BCE_0393、BCE_4605、BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365和BCE_0392；所述BCE_0393、BCE_4605、 BCE_5606、BCE_5607、BCE_0365和BCE_0392的核苷酸序列依次为序列表中的序列6、序列7、 序列8、序列9、序列10和序列11；

所述汉氏硝化细菌(Nitrobacter hamburgensis)X14中所有DNA甲基转移酶编码基因为 Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803和Nham_3225；所述Nham_0569、Nham_0582、Nham_0803 和Nham_3225的核苷酸序列依次为序列表中的序列12、序列13、序列14和序列15。

在上述方法前还包括确定靶细菌基因组中所有DNA甲基转移酶编码基因的步骤：

(a)通过同源序列比对等方法，预测靶细菌中编码DNA甲基转移酶的基因；

(b)将预测的所有编码DNA甲基转移酶的基因分别连入可诱导的表达载体，再转入自身 限制修饰系统缺失的大肠杆菌中，然后分别诱导培养。

(C)分别制备上述转入表达载体的大肠杆菌的基因组DNA(包括染色体DNA与表达载体)， 检测DNA是否含已被甲基化修饰，如果确定DNA已被甲基化修饰，即证明预测的DNA甲基转 移酶确实具有DNA甲基化修饰功能，并且其蛋白在大肠杆菌中具有活性。检测方法包括高效 液相色谱法和DNA点杂交方法。

上述DNA甲基转移酶，包括I型、II型与III型甲基转移酶，I型DNA甲基转移酶应包 括甲基转移亚基与DNA识别亚基。

其中所述可诱导的表达载体，可以是低拷贝，也可以是高拷贝载体，但应与转化靶细菌 的穿梭/整合质粒能够相容。甲基转移酶的启动子可以是其自身的启动子，也可以是在大肠杆 菌中可诱导型的启动子，包括但不局限于阿拉伯糖诱导启动子、IPTG诱导型启动子和鼠李糖 诱导启动子。甲基转移酶诱导温度为8℃-43℃。

其中所述自身限制修饰系统缺失的大肠杆菌为已知的限制酶、DNA甲基转移酶完全缺失 的大肠杆菌，这些酶包括但不局限于Dam、Dcm、EcoKI、Mrr、McrA和Mrr。

本发明的另一个目的是提供一株大肠杆菌(Escherichia coli)EC135。

本发明提供的大肠杆菌，其保藏编号为CGMCC NO.5925。

菌株EC135于2012年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)，保藏号为CGMCC No.5925，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

其中所述转化靶细菌的方法，因选择的靶细菌不同而异，包括但不局限于化学转化法、 接合转移、电转化法及原生质体转化法。

本发明的实验证明，本发明与现有的克服细菌限制修饰障碍，实现遗传操作的方法相比， 优点在于：

1.使用一株自身限制修饰系统完全缺失的大肠杆菌作为宿主，一方面克服了大肠杆菌修 饰模式(Dam、Dcm和EcoKI)对靶细菌IV型限制修饰系统的激活作用，另一方面，大肠杆菌 Mrr、McrA和McrBC的缺失有利于靶细菌DNA甲基转移酶的克隆表达；

2.对靶细菌所有的DNA甲基转移酶进行共表达，真正实现靶细菌DNA甲基化模式的精确 模拟；

3.使用的是在大肠杆菌体内DNA甲基化修饰的方式，在培养细菌的过程中同时完成，无 需额外的体外反应，无需添加甲基化反应底物，方便快捷；

4.在本发明中可使用酿酒酵母组装多个甲基转移酶基因，共表达质粒的构建可在一周内 完成，加速了靶细菌限制修饰障碍克服的过程；

5.利用本方法得到的靶细菌转化子，其限制修饰系统与出发菌株一致。本方法不会对靶 细菌原有的限制修饰系统造成损伤；

6.本发明具有很强的通用性，已成功应用于两株芽胞杆菌，一株革兰氏阴性、化能自养 细菌的遗传操作，并有望扩展至更多的细菌种属。

本发明对于含有多套限制修饰系统的顽固型细菌遗传操作系统构建具有重要意义。

附图说明

图1为TOP10dcm基因敲除PCR检测结果

图2为EC135dam基因敲除PCR检测结果

图3为解淀粉芽胞杆菌TA208DNA甲基转移酶基因PCR扩增结果

图4为点杂交检测解淀粉芽胞杆菌TA208DNA甲基转移酶活性

图5为pWYE724质粒图谱

图6为EcoRV单切检测pM.Bam电泳图

图7为pM.Bam质粒图谱

图8为不同宿主制备的穿梭质粒对解淀粉芽胞杆菌TA208的转化效率(*未检测到)

图9为解淀粉芽胞杆菌TA208upp基因敲除PCR验证结果

图10为解淀粉芽胞杆菌TA208和BS043在MM、MM+5-FU培养基生长情况

图11为点杂交检测蜡样芽胞杆菌ATCC 10987DNA甲基转移酶活性

图12为HindIII单切检测pM.Bce电泳图

图13为pM.Bce质粒图谱

图14为不同宿主制备的穿梭质粒对蜡样芽胞杆菌ATCC 10987的转化效率(*未检测 到)

图15为点杂交检测汉氏硝化细菌X14DNA甲基转移酶活性

图16为BamHI单切检测pM.Nham电泳图

图17为pM.Nham质粒图谱

图18为绿色荧光蛋白在汉氏硝化细菌X14中的表达

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规 生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、限制修饰系统完全缺失的大肠杆菌EC135的构建

以大肠杆菌TOP10(北京全式金生物技术有限公司，货号为CD101)为出发菌株，依次敲 除dcm基因(Dcm甲基化酶编码基因)，将染色体recA基因突变为野生型，敲除dam基因(Dam 甲基化酶编码基因)得到大肠杆菌EC135，具体如下：

制备TOP10菌株的感受态细胞，将质粒pKD46(购自美国Coli Genetic Stock Center， 以下简写为CGSC，编号7739)转化入TOP10菌株，30℃筛选氨苄青霉素抗性转化子，得到 TOP10/pKD46。

利用引物WB089与WB090，以pKD3质粒(购自美国CGSC，编号7631)为模板扩增氯霉 素抗性基因，切胶回收1166bp，得到氯霉素抗性基因PCR产物。

将TOP10/pKD46菌株在LB培养基中30℃培养，在OD₆₀₀为0.2时加入终浓度100mM的阿 拉伯糖诱导1小时，制备感受态后利用5μL回收的氯霉素抗性基因PCR产物转化40μL感 受态细胞，30℃复苏1小时后将复苏产物涂布于含有34μg/mL氯霉素的LB平板，37℃培养 过夜。挑选重组子，利用引物WB064和WB065进行菌落PCR鉴定。阳性重组子PCR产物大小 应为1816bp，而原始基因大小为1980bp。挑取阳性重组子，在LB液体培养基中42℃连续培 养三代，以消除pKD46质粒，得到TOP10dcm::CmR菌株。

稀释涂布平板后挑取单菌落TOP10dcm::CmR菌株制备电转感受态，将pCP20(购自美国 CGSC，编号7629)质粒转化入TOP10dcm::CmR菌株，筛选氨苄青霉素抗性重组子后挑单菌 落在不含抗生素的LB培养基中30℃培养至OD₆₀₀为0.2，然后提高温度至42℃培养过夜。稀 释菌液后涂布无抗性的LB平板，挑取单菌落利用引物WB064和WB065进行菌落PCR鉴定。氯 霉素抗性基因消除的阳性重组子扩增产物应为大小应为886bp(图1)，将阳性重组子命名为 TOP10Δdcm::FRT。

由于dam与recA双突变是致死基因型，因此在敲除dam基因之前要先回复突变recA1基 因。利用引物WB253和WB254，以大肠杆菌W3110(购自美国CGSC，编号4474)染色体DNA 为模板扩增野生型recA基因(1236bp)，连接至载体pKOV(购自美国Addgene，货号#25769) 的NotI与BamHI位点，得到pKOV-recA。将pKOV-recA转化入TOP10Δdcm::FRT菌株，30℃ 筛选氯霉素抗性转化子，挑取转化子后在42℃液体LB培养基中培养过夜，并涂布含有氯霉 素的LB平板，使pKOV-recA整合至染色体recA1位点。得到单菌落后利用引物WB255和WB256 进行菌落PCR，如果有大于7Kb的PCR条带，即说明pKOV-recA已整合至染色体。挑取正确 的重组子，42℃培养后涂布于含有10％蔗糖的LB平板，将单菌落在含有氯霉素和不含氯霉素 的LB平板上划线同时传代，挑选氯霉素敏感的菌落。利用引物WB255和WB256扩增recA基 因后测序，recA+重组子recA基因第482位碱基应为G，而TOP10菌株为A。

dam基因的敲除与dcm敲除步骤相同，所用的氯霉素抗性基因扩增引物为WB087和WB088， 外侧检测引物为WB062和WB063。基因敲除后扩增产物大小为740bp，原始基因大小为1356bp (图2)。

经过上述三步遗传操作，所得到的dcm dam缺失、recA回复突变的菌株即为EC135。

上述提到的菌株EC135于2012年3月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5925，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

所用到的PCR引物序列见表1。

表1、本发明所使用的PCR引物

实施例2、外源DNA分子克服限制修饰障碍导入解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208

一、共表达TA208所有DNA甲基转移酶编码基因的重组菌的构建

1、菌株TA208编码DNA甲基转移酶基因的获得

1)菌株TA208编码DNA甲基转移酶基因的预测

菌株TA208全基因组序列已经得到测定，在GenBank登录号为CP002627。其染色体上共 存在5个推定的编码DNA甲基转移酶的基因，基因的locus_tag分别是BAMTA208_06525， BAMTA208_6715，BAMTA208_14440，BAMTA208_19835和BAMTA208_16660。五个基因片段的PCR 扩增结果如图3所示。

2)、菌株TA208编码DNA甲基转移酶基因的验证

将上述五个基因分别克隆至pBAD43质粒(Tight regulation，modulation，and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter.L M Guzman，D Belin，M J Carson，J Beckwith.Journal of Bacteriology，1995 177：4121-30，公众可从 中国科学院微生物研究所获得。)的NcoI和XbaI、EcoRI和XbaI、EcoRI和XbaI、EcoRI和 SalI、EcoRI和SalI位点间，得到含有BAMTA208_06525的pBAD43质粒、含有BAMTA208_6715 的pBAD43质粒、含有BAMTA208_14440的pBAD43质粒、含有BAMTA208_19835的pBAD43质粒 和含有BAMTA208_16660的pBAD43质粒；再将5种质粒分别转化入大肠杆菌EC135，得到重 组菌1-5。提取重组菌1-5的质粒送去测序验证正确，因此重组菌为阳性重组菌。

点杂交验证：将验证为阳性的重组菌1-5诱导甲基转移酶表达(在LB培养基中培养至 OD₆₀₀为0.2后加入终浓度为0.2％(质量百分含量)的阿拉伯糖，30℃诱导12小时)，然后用 DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)提取总DNA，得到DNA1-DNA5。将上述得到的DNA1-DNA5 分别煮沸3min变性为单链后插入冰水混合物淬火。以EC135/pBAD43(pBAD43转入EC135) 为阴性对照。

将EC135/pBAD43的总DNA和5个样品DNA1-DNA5分别均按450ng、150ng和50ng点至 Protran BA85硝酸纤维素膜(Whatman)上，重复点三张膜。紫外交联2分钟后将膜放入用 TBST(200mM NaCl，0.1％Tween20，50mM Tris-HCl，pH7.4)配制的5％脱脂奶粉，室温(25℃) 封闭1小时。然后将三张膜放入杂交袋，分别加入10mL 1∶10000稀释的兔抗N6mA血清(New England Biolabs)，10mL 1∶10000稀释的兔抗N4mC血清(New England Biolabs)，10mL 1∶20000稀释的鼠抗5mC单克隆抗体(Zymo Research，货号A3001-50)。室温(25℃)孵育 1小时后用TBST洗膜5次，将膜放入杂交袋后加入相应的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗 (美国Jackson ImmunolResearch，货号111-035-003)或羊抗鼠二抗(美国Zymed，货号 81-6520)，稀释比例为1∶10000。室温孵育1小时后用TBST洗膜5次。取ECL试剂A、B液 (Amersham，货号RPN2232)各0.5mL，混匀后均匀滴加在膜表面。暗室中将荧光信号曝光于 X光片。

结果如图4所示(图中的m6A/m4C/m5C分别为使用不同抗体的杂交结果)，可以看出， BAMTA208_06525，BAMTA208_6715，BAMTA208_19835和BAMTA208_16660具有DNA甲基化修 饰活性，为DNA甲基转移酶基因。

2、共表达所有DNA甲基转移酶编码基因的重组菌的获得

1)构建

分别以含有BAMTA208_06525(序列2)的pBAD43质粒、含有BAMTA208_6715(序列3) 的pBAD43质粒、含有BAMTA208_19835(序列4)的pBAD43质粒和含有BAMTA208_16660(序 列5)的pBAD43质粒为模板，BAMTA208_06525所用引物为WB325和WB475(大小为839bp， 图3)，BAMTA208_6715所用引物为WB476和WB477(大小为1512bp，图3)，BAMTA208_19835 所用引物为WB478和WB479(大小为1794bp，图3)，BAMTA208_16660所用引物为WB480和 WB326(大小为1272bp，图3)，引物序列如表1所示，进行PCR扩增，分别得到4个PCR产 物。

将4个PCR产物分别切胶回收后，再将4个PCR产物等量混合浓缩至总体积50μL，得到 PCR总产物。

EcoRI和SalI双酶切500ng pWYE724质粒(质粒图谱见图5，其序列为序列1)，切胶 回收后与上述PCR总产物混合，然后用醋酸锂转化法(Methods in Enzymology，350，87-96.) 转化酿酒酵母DAY414(Mds3regulates morphogenesis in Candida albicans through the TOR pathway，Zacchi LF，Gomez-Raja J，Davis DA，Molecular and Cellular Biology，2010， 30：3695-3710，公众可从中国科学院微生物研究所获得)。在不添加色氨酸的完全合成培养 基(SC trp-，北京泛诺基公司)平板上筛选转化子。挑取单菌落入YPD培养基，玻璃珠法提 取酵母质粒(Nucleic Acids Research，20，3790)。将质粒转化入大肠杆菌TOP10，用含有 100μg/mL壮观霉素的LB平板筛选转化子，提取质粒后EcoRV单切，正确的重组质粒应产生 8515bp、3633bp、1018bp及571bp四条带(如图6所示)，命名为pM.Bam(结构示意图如图 7所示)，送去测序结果正确。

将质粒pM.Bam转化入由实施例1得到的菌株EC135，按照上述的方法酶切验证，正确的 转化子即为EC135/pM.Bam，为解淀粉芽胞杆菌TA208DNA甲基化模式精确模拟的宿主。

2)验证

为检测甲基化模拟的有效性，利用终浓度为0.2％的阿拉伯糖诱导在30℃诱导12小时， 使EC135/pM.Bam中的甲基转移酶基因表达，提取总DNA，使用菌株TA208的染色体DNA为对 照按照上述1的方法进行点杂交检测，结果为EC135/pM.Bam与TA208的杂交结果无显著差异， 说明甲基转移酶均得到表达，说明EC135/pM.Bam为共表达所有DNA甲基转移酶编码基因的重 组菌。

二、外源DNA分子克服限制修饰障碍导入靶细菌

1、穿梭质粒导入克服限制修饰障碍导入靶细菌

A、导入

1)将穿梭质粒pAD43-25(7262bp，购自美国Bacillus Genetic Stock Center，以下 简写为BGSC，货号ECE166)转化入上述一得到的EC135/pM.Bam，分别得到重组菌。

2)、将重组菌经阿拉伯糖诱导(使用终浓度为0.2％的阿拉伯糖在30℃诱导12小时)， 得到诱导后重组菌。

3)、提取诱导后重组菌的质粒(这里的质粒包括pM.Bam和穿梭质粒，但是pWYE724为低 拷贝质粒，pM.Bam拷贝数为5个左右/细胞，穿梭质粒的拷贝数为300个左右/细胞)，转化 解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TA208(Complete genome sequence of Bacillus amyloliquefaciens TA208.a strain for industrial production of guanosine and ribavirin，Guoqiang Zhang，Aihua Deng，Qingyang Xu，Yong Liang，Ning Chen，Tingyi Wen，Journal of Bacteriology，193(12)：3142-3143)，方法如Analytical Biochemistry， 409，130-137记载，得到TA208/pAD43-25(EC135/pM.Bam)。

采用同样的方法将穿梭质粒pAD43-25分别转入TOP10和EC135，经修饰后再转入TA208 中，分别得到TA208/pAD43-25(TOP10)和TA208/pAD43-25(EC135)。

采用同样的方法将穿梭质粒pAD123(5952bp，购自美国BGSC，编号ECE165)、pMK3(7214bp， 购自美国BGSC，编号ECE15)、pMK4(5585bp，购自美国BGSC，编号ECE16)、pHCMC02(6866bp， 购自美国BGSC，编号ECE188)、pHCMC04(8089bp，购自美国BGSC，编号ECE189)、pDG148StuI (8272bp，购自美国BGSC，编号ECE145)分别转入EC135/pM.Bam、TOP10和EC135经修饰后 再转入TA208中，分别得到如下：

TA208/pAD123(EC135/pM.Bam)、TA208/pAD123(TOP10)、TA208/pAD123(EC135)、

TA208/pMK3(EC135/pM.Bam)、TA208/pMK3(TOP10)、TA208/pMK3(EC135)、

TA208/pMK4(EC135/pM.Bam)、TA208/pMK4(TOP10)、TA208/pMK4(EC135)、

TA208/pHCMC02(EC135/pM.Bam)、TA208/pHCMC02(TOP10)、TA208/pHCMC02(EC135)、

TA208/pHCMC04(EC135/pM.Bam)、TA208/pHCMC04(TOP10)、TA208/pHCMC04(EC135)、

TA208/pDG148StuI(EC135/pM.Bam)、TA208/pDG148StuI(TOP10)、TA208/pDG148StuI (EC135)。

B、转化率计算

TA208/pAD43-25(EC135/pM.Bam)、TA208/pAD43-25(TOP10)和TA208/pAD43-25(EC135)、 TA208/pAD123(EC135/pM.Bam)、TA208/pAD123(TOP10)、TA208/pAD123(EC135)、TA208/ pMK3(EC135/pM.Bam)、TA208/pMK3(TOP10)、TA208/pMK3(EC135)、TA208/pMK4 (EC135/pM.Bam)、TA208/pMK4(TOP10)、TA208/pMK4(EC135)、TA208/pHCMC02 (EC135/pM.Bam)、TA208/pHCMC02(TOP10)、TA208/pHCMC02(EC135)、TA208/pHCMC04 (EC135/pM.Bam)、TA208/pHCMC04(TOP10)、TA208/pHCMC04(EC135)、TA208/pDG148StuI (EC135/pM.Bam)、TA208/pDG148StuI(TOP10)、TA208/pDG148StuI(EC135)转化后涂布的 平板上单菌落的个数，根据所使用的穿梭质粒DNA的量(pM.Bam拷贝数太低，所以加入质粒 的总量即为穿梭质粒的DNA量)计算转化率。随机挑取4个转化子提取质粒DNA验证。实验 重复三次，结果取平均值±标准差。

转化率为：单菌落数(CFU)×(转化后复苏液的体积/所涂布菌液的体积)×复苏液稀 释倍数/转化所用的穿梭质粒的量(μg)。

结果如图8所示，可以看出，

TA208/pAD43-25(EC135/pM.Bam)的转化率为6.4±2.6×10⁵CFU/μg DNA；

TA208/pAD43-25(TOP10)的转化率为0；

TA208/pAD43-25(EC135)的转化率为2.4±1.6×10³CFU/μg DNA；

TA208/pAD123(EC135/pM.Bam)的转化率为9.1±4.3×10⁵CFU/μg DNA；

TA208/pAD123(TOP10)的转化率为0；

TA208/pAD123(EC135)的转化率为0；

TA208/pMK3(EC135/pM.Bam)的转化率为2.2±0.5×10⁵CFU/μg DNA；

TA208/pMK3(TOP10)的转化率为0；

TA208/pMK3(EC135)的转化率为4.5×10¹CFU/μg DNA；

TA208/pMK4(EC135/pM.Bam)的转化率为3.0±0.4×10⁶CFU/μg DNA；

TA208/pMK4(TOP10)的转化率为0；

TA208/pMK4(EC135)的转化率为3.1×10²CFU/μg DNA；

TA208/pHCMC02(EC135/pM.Bam)的转化率为2.0±0.3×10⁶CFU/μg DNA；

TA208/pHCMC02(TOP10)的转化率为0；

TA208/pHCMC02(EC135)的转化率为6.3×10¹CFU/μg DNA；

TA208/pHCMC04(EC135/pM.Bam)的转化率为1.9±0.1×10⁶CFU/μg DNA；

TA208/pHCMC04(TOP10)的转化率为0；

TA208/pHCMC04(EC135)的转化率为1.5×10¹CFU/μg DNA；

TA208/pDG148StuI(EC135/pM.Bam)的转化率为9.7±3.2×10⁴CFU/μg DNA；TA208/

pDG148StuI(TOP10)的转化率为0；

TA208/pDG148StuI(EC135)的转化率为0；

TOP10制备的质粒不能转化菌株TA208，EC135菌株中制备的质粒转化率在0～ 10³CFU/μgDNA水平，而EC135/pM.Bam中制备的穿梭质粒转化率在10⁴～10⁶CFU/μgDNA水平。

同时提取每种菌的单菌落的质粒和未转入前的质粒进行电泳或测序比较，结果大小一 致，说明这些菌株都为转入外源DNA分子的阳性质粒。

2、整合型质粒导入靶细菌

含有upp基因同源臂、氯霉素抗性基因的整合型质粒pWYE748制备方法如下：以引物 WB607、WB608为引物，TA208染色体DNA为模板PCR扩增upp基因上游同源臂641bp；以WB609、 WB610为引物，质粒pMK4为模板扩增氯霉素抗性基因906bp；以WB611、WB612为引物，TA208 染色体DNA为模板PCR扩增upp基因下游同源臂669bp；将三段PCR产物切胶回收后，各取1 μL混合后作为模板，以WB607、WB612为引物再次PCR得到2216bp的片段，将PCR产物克 隆入pMD19-T质粒(Taraka，货号D106A)，所得质粒即为整合质粒pWYE748。

采用上述1的转化方法，将整合型质粒pWYE748在EC135/pM.Bam内修饰后，再转化菌 株TA208并筛选氯霉素抗性转化子。

用引物WB605和WB606PCR扩增鉴定，以转化子的DNA和野生型TA208的基因组DNA为 模板，扩增结果如图9所示，转化子扩增大小为2375bp(氯霉素抗性基因插入upp基因)， 而野生型TA208原始的氯霉素抗性基因大小为2049bp，证明转入外源基因，整合成功，将该 转化子命名为BS043。

upp基因编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶，可将5-氟尿嘧啶转化为5-氟尿嘧啶核苷单磷酸， 最终代谢为有毒的代谢产物5-氟尿嘧啶核苷二磷酸，可强烈抑制胸苷酸合成酶的活性，造成 菌体死亡。

进一步证明BS043是否导入了外源基因，方法为：菌株BS043在不添加和添加10μM5- 氟尿嘧啶(Sigma，货号F6627)的MM培养基上生长(培养基成分见Molecular Microbiology， 46，25-36.，并添加100mg/L的腺苷)，以菌株TA208为对照。结果如图10所示，可以看出， BS043可在添加10μM5-氟尿嘧啶的MM培养基上生长，说明转入外源基因，整合成功。

而在EC135及TOP10中提取的整合质粒pWYE748转化TA208多次均未得到转化子。

实施例3、外源DNA分子克服限制修饰障碍导入蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 10987

一、共表达ATCC 10987所有DNA甲基转移酶编码基因的重组菌的构建

1、菌株ATCC 10987编码DNA甲基转移酶基因的获得

1)菌株ATCC 10987编码DNA甲基转移酶基因的预测

菌株ATCC 10987全基因组序列已经公布，GenBank登录号为AE017194。其染色体上共 存在9个推定的编码DNA甲基转移酶的基因，基因的locus_tag分别是BCE_0841-BCE_0842， BCE_0839-BCE_0842，BCE_0365，BCE_0392，BCE_0393，BCE_4605，BCE_5606，BCE_5607和 BCE_1018。

2)、菌株ATCC 10987编码DNA甲基转移酶基因验证

将BCE_0841-BCE_0842，BCE_0839-BCE_0842，BCE_0365，BCE_0392，BCE_0393，BCE_4605， BCE_5606，BCE_5607和BCE_1018分别克隆至pBAD43质粒NheI和KpnI、NcoI和KpnI、NheI 和KpnI、NheI和KpnI、NheI和KpnI、NheI和KpnI、NheI和KpnI、NheI和XbaI、NheI和 KpnI位点间，得到含有BCE_0841-BCE_0842的pBAD43质粒，含有BCE_0839-BCE_0842的 pBAD43质粒，含有BCE_0365的pBAD43质粒，含有BCE_0392的pBAD43质粒，含有BCE_0393 的pBAD43质粒，含有BCE_4605的pBAD43质粒，含有BCE_5606的pBAD43质粒，含有BCE_5607 的pBAD43质粒和含有BCE_1018的pBAD43质粒。

再将上述质粒分别转化入大肠杆菌EC135，得到重组菌1-9。

提取重组菌1-9的质粒送去测序验证正确，因此重组菌为阳性重组菌。

点杂交验证：

将验证为阳性的重组菌1-9诱导甲基转移酶表达(使用终浓度为0.2％的阿拉伯糖在30℃ 诱导12小时)后，用DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)提取总DNA，得到DNA1-DNA9。 将上述得到的DNA1-DNA9煮沸3min变性为单链后插入冰水混合物淬火。以EC135/pBAD43为 阴性对照。

将EC135/pBAD43的总DNA和9个样品DNA1-DNA9分别均按450ng、150ng和50ng点至 Protran BA85硝酸纤维素膜(Whatman)上，重复点三张膜。紫外交联2分钟后将膜放入用 TBST(200mM NaCl，0.1％Tween20，50mM Tris-HCl，pH7.4)配制的5％脱脂奶粉，室温封 闭1小时。然后将三张膜放入杂交袋，分别加入10mL 1∶10000稀释的兔抗N6mA血清，10mL 1∶10000稀释的兔抗N4mC血清，10mL 1∶20000稀释的鼠抗5mC单克隆抗体。室温孵育1 小时后用TBST洗膜5次，将膜放入杂交带后加入相应的羊抗兔或羊抗鼠二抗，稀释比例为1∶ 10000。室温孵育1小时后用TBST洗膜5次。取ECL试剂A、B液各0.5mL，混匀后均匀滴加 在膜表面。暗室中将荧光信号曝光于X光片。

结果如图11(图中的m6A/m4C/m5C分别为使用不同抗体的杂交结果)，可以看出，BCE_0393， BCE_4605，BCE_5606，BCE_5607，BCE_0365和BCE_0392具有DNA甲基化修饰活性，为DNA 甲基转移酶基因。

2、共表达所有DNA甲基转移酶编码基因的重组菌的获得

1)构建

分别以含有BCE_0393(序列6)的pBAD43质粒、含有BCE_4605(序列7)的pBAD43质 粒、含有BCE_5606(序列8)的pBAD43质粒、含有BCE_5607(序列9)的pBAD43质粒、含 有BCE_0365(序列10)的pBAD43质粒、含有BCE_0392(序列11)的pBAD43质粒为模板， BCE_0393所用引物为WB325和WB575(大小为2160bp)，BCE_4605为WB576和WB577(大小 为1102bp)，BCE_5606为WB578和WB579(大小为1345bp)，BCE_5607为WB580和WB581 (大小为1316bp)，BCE_0365为WB582和WB583(大小为1071bp)，BCE_0392为WB584和WB326 (大小为1257bp)，引物序列如表1所示，进行PCR扩增，分别得到6个PCR产物。

将6个PCR产物分别切胶回收后，再将6个PCR产物等比例混合，浓缩至总体积50μL， 得到PCR总产物。

EcoRI和SalI双酶切500ng pWYE724质粒，切胶回收后与上述PCR总产物混合，然后 用醋酸锂转化法(Methods in Enzymology，350，87-96.)转化酿酒酵母DAY414。在不添加 色氨酸的完全合成培养基(SC trp-，北京泛诺基公司)平板上筛选转化子，挑取单菌落入 YPD培养基，玻璃珠法提取酵母质粒(Nucleic Acids Research，20，3790)。将质粒转化入 大肠杆菌TOP10，用含有100μg/mL壮观霉素的LB平板筛选转化子，提取质粒后HindIII单 切，正确的重组质粒应产生6544bp、4237bp、3642bp、1315bp及827bp五条带(如图12所 示)，命名为pM.Bce(结构示意图如图13所示)，送去测序结果正确。

将质粒pM.Bce转化入由实施例1得到的菌株EC135，按照上述的方法酶切验证，正确的 转化子即为EC135/pM.Bce，为蜡样芽胞杆菌ATCC 10987DNA甲基化模式精确模拟的宿主。

2)验证

为检测甲基化模拟的有效性，将EC135/pM.Bce使用终浓度为0.2％阿拉伯糖诱导在30℃ 诱导12小时，使甲基转移酶基因表达，提取总DNA，使用菌株ATCC 10987的染色体DNA为 对照按照前面的方法进行点杂交检测，结果为EC135/pM.Bce与ATCC 10987的杂交结果无显 著差异，说明甲基转移酶均得到表达，说明EC135/pM.Bce为共表达所有DNA甲基转移酶编码 基因的重组菌。

二、穿梭质粒克服限制修饰障碍导入靶细菌

将穿梭质粒分别转入EC135/pM.Bce、EC135和TOP10，阿拉伯糖诱导(方法见前面)后 提取质粒，分别转化菌株ATCC 10987，方法同实施例2的一，上述穿梭质粒为pAD43-25、 pAD123、pMK3、pMK4、pHCMC02，分别得到如下：

ATCC 10987/pAD43-25(EC135/pM.Bce)、ATCC 10987/pAD43-25(TOP10)、ATCC 10987/ pAD43-25(EC135)、ATCC 10987/pAD123(EC135/pM.Bce)、ATCC 10987/pAD123(TOP10)、 ATCC 10987/pAD123(EC135)、ATCC 10987/pMK3(EC135/pM.Bce)、ATCC 10987/pMK3(TOP10)、 ATCC 10987/pMK3(EC135)、ATCC 10987/pMK4(EC135/pM.Bce)、ATCC 10987/pMK4(TOP10)、 ATCC 10987/pMK4(EC135)、ATCC 10987/pHCMC02(EC135/pM.Bce)、ATCC 10987/pHCMC02 (TOP10)、ATCC 10987/pHCMC02(EC135)；

转化后涂布的平板上单菌落的个数，根据所使用的穿梭质粒DNA的量(pM.Bce拷贝数 为5个左右/细胞，穿梭质粒的拷贝数为300个左右/细胞，所以加入质粒的总量即为穿梭质 粒的DNA量)计算转化率。随机挑取4个转化子提取质粒DNA验证。实验重复三次，结果取 平均值±标准差。

转化率为：单菌落数(CFU)×(转化后复苏液的体积/所涂布菌液的体积)×复苏液稀 释倍数/转化所用的穿梭质粒的量(μg)。

结果如图14所示，可以看出，

ATCC 10987/pAD43-25(EC135/pM.Bce)的转化率为3.2±1.3×10⁵CFU/μg DNA；

ATCC 10987/pAD43-25(TOP10)的转化率为8.3±0.7×10³CFU/μg DNA；

ATCC 10987/pAD43-25(EC135)的转化率为7.1±2.9×10³CFU/μg DNA；

ATCC 10987/pAD123(EC135/pM.Bce)的转化率为9.0±1.4×10⁵CFU/μg DNA；

ATCC 10987/pAD123(TOP10)的转化率为8.7±0.8×10³CFU/μg DNA；

ATCC 10987/pAD123(EC135)的转化率为5.7±3.3×10³CFU/μg DNA；

ATCC 10987/pMK3(EC135/pM.Bce)的转化率为8.4±2.2×10⁵CFU/μg DNA；

ATCC 10987/pMK3(TOP10)的转化率为8.7±2.7×10²CFU/μg DNA；

ATCC 10987/pMK3(EC135)的转化率为1.2±0.6×10³CFU/μg DNA；

ATCC 10987/pMK4(EC135/pM.Bce)的转化率为2.3±0.2×10⁷CFU/μg DNA；

ATCC 10987/pMK4(TOP10)的转化率为3.3±0.4×10⁵CFU/μg DNA；

ATCC 10987/pMK4(EC135)的转化率为3.5±1.4×10⁵CFU/μg DNA；

ATCC 10987/pHCMC02(EC135/pM.Bce)的转化率为2.5±1.5×10⁵CFU/μg DNA；

ATCC 10987/pHCMC02(TOP10)的转化率为0；

ATCC 10987/pHCMC02(EC135)的转化率为0；

可以看出，EC135/pM.Bce中制备的质粒转化率是TOP10和EC135中制备的质粒转化率的 10²～10³倍。

同时提取每种菌的单菌落的质粒和未转入前的质粒进行电泳或测序比较，结果大小一 致，说明这些菌株都为转入外源DNA分子的阳性质粒。

实施例4、外源DNA分子克服限制修饰障碍导入汉氏硝化细菌(Nitrobacter hamburgensis)X14

一、共表达X14所有DNA甲基转移酶编码基因的重组菌的构建

1、菌株X14编码DNA甲基转移酶基因的获得

1)菌株X14编码DNA甲基转移酶基因的预测

菌株X14全基因组序列已经公布，GenBank登录号为CP000319，CP000320，CP000321 CP000322。其基因组中共存在10个推定的编码DNA甲基转移酶的基因，基因的locus_tag分 别是Nham_0569，Nham_0582，Nham_0803，Nham_0842，Nham_1185，Nham_1353，Nham_2515， Nham_3225，Nham_3845和Nham_4499。

2)、菌株X14编码DNA甲基转移酶基因的验证

将Nham_0569，Nham_0582，Nham_0803，Nham_0842，Nham_1185，Nham_1353，Nham_2515， Nham_3225，Nham_3845和Nham_4499分别克隆至pBAD43质粒的EcoRI和KpnI、EcoRI和KpnI、 NheI和KpnI、NheI和KpnI、EcoRI和KpnI、EcoRI和KpnI、NheI和KpnI、EcoRI和KpnI、 NheI和KpnI、EcoRI和KpnI位点，得到含有Nham_0569的pBAD43质粒，含有Nham_0582的 pBAD43质粒，含有Nham_0803的pBAD43质粒，含有Nham_0842的pBAD43质粒，含有Nham_1185 的pBAD43质粒，含有Nham_1353的pBAD43质粒，含有Nham_2515的pBAD43质粒，含有 Nham_3225的pBAD43质粒，含有Nham_3845的pBAD43质粒和含有Nham_4499的pBAD43质粒。 再将上述质粒分别转入大肠杆菌EC135，得到重组菌1-10。

提取重组菌1-10的质粒送去测序验证正确，因此重组菌为阳性重组菌。

点杂交验证：

将验证为阳性的重组菌1-10诱导甲基转移酶表达(使用终浓度为0.2％阿拉伯糖诱导在 30℃诱导12小时)后，用DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)提取总DNA，得到DNA1-DNA10。 将上述得到的DNA1-DNA10煮沸3min变性为单链后插入冰水混合物淬火。以EC135/pBAD43为 阴性对照。

将EC135/pBAD43的总DNA和10个样品DNA1-DNA10分别均按450ng、150ng和50ng点 至Protran BA85硝酸纤维素膜(Whatman)上，重复点三张膜。紫外交联2分钟后将膜放入 用TBST(200mM NaCl，0.1％Tween20，50mM Tris-HCl，pH7.4)配制的5％脱脂奶粉，室温 封闭1小时。然后将三张膜放入杂交袋，分别加入10mL 1∶10000稀释的兔抗N6mA血清， 10mL 1∶10000稀释的兔抗N4mC血清，10mL 1∶20000稀释的鼠抗5mC单克隆抗体。室温 孵育1小时后用TBST洗膜5次，将膜放入杂交带后加入相应的羊抗兔或羊抗鼠二抗，稀释比 例为1∶10000。室温孵育1小时后用TBST洗膜5次。取ECL试剂A、B液各0.5mL，混匀后 均匀滴加在膜表面。暗室中将荧光信号曝光于X光片。

结果如图15所示(图中的m6A/m4C/m5C分别为使用不同抗体的杂交结果)，可以看出， Nham_0569，Nham_0582，Nham_0803和Nham_3225具有DNA甲基化修饰活性，为DNA甲基转 移酶基因。

2、共表达所有DNA甲基转移酶编码基因的重组菌的获得

1)构建

分别以含有Nham_0569(序列12)、含有Nham_0582(序列13)的pBAD43质粒、含有 Nham_0803(序列14)的pBAD43质粒和含有Nham_3225(序列15)的pBAD43质粒为模板， Nham_0569所用引物为WB325和WB585(大小为648bp)，Nham_0582为WB586和WB587(大 小为1983bp)，Nham_0803为WB588和WB589(大小为1317bp)，Nham_3225为WB590和WB326 (大小为1131bp)，引物序列如表1所示，进行PCR扩增，分别得到4个PCR产物。

将4个PCR产物分别切胶回收后，再将4个PCR产物等比例混合，并浓缩至总体积50μL， 得到PCR总产物。

EcoRI和SalI双酶切500ng pWYE724质粒，切胶回收后与上述PCR总产物混合，然后 用醋酸锂转化法(Methods in Enzymology，350，87-96.)转化酿酒酵母DAY414。在不添加 色氨酸的完全合成培养基(SC trp-，北京泛诺基公司)平板上筛选转化子，挑取单菌落入 YPD培养基，玻璃珠法提取酵母质粒(Nucleic Acids Research，20，3790)。将质粒转化入 大肠杆菌TOP10，用含有100μg/mL壮观霉素的LB平板筛选转化子，提取质粒后BamHI单切， 正确的重组质粒应产生8217bp、3848bp、1003bp和343bp四条带(如图16所示)，命名为 pM.Nham(结构示意图如如图17所示)，送去测序结果正确。

将pM.Nham转化入由实施例1得到的菌株EC135，按照上述的方法酶切验证，正确的转 化子即为EC135/pM.Nham，为汉氏硝化细菌X14的DNA甲基化模式精确模拟宿主。

2)验证

为检测甲基化模拟的有效性，阿拉伯糖诱导(使用终浓度为0.2％阿拉伯糖诱导在30℃ 诱导12小时)EC135/pM.Nham中的甲基转移酶基因表达，提取总DNA，使用菌株X14的染色 体DNA为对照按照前面的方法进行点杂交检测，结果为EC135/pM.Nham与菌株X14的杂交结 果无显著差异，说明甲基转移酶均得到表达，说明EC135/pM.Nham为共表达所有DNA甲基转 移酶编码基因的重组菌。

二、穿梭质粒克服限制修饰障碍导入靶细菌

质粒pBBR1-MCS5-P_{Nham_3450}-GFP具体构建方法为：以WB654、WB655为引物，菌株X14基因 组DNA为模板扩增Nham_3450基因启动子片段216bp；以WB656、WB650为引物，pAD123为模 板扩增GFP基因717bp；将两个PCR产物切胶回收后各取1μL作为模板，以WB654，WB650 为引物再次PCR扩增，得到933bp的PCR产物后克隆入pBBR1-MCS5(Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS，carrying different antibiotic-resistance cassettes.Kovach，Michael E.Elzer，Philip H.Steven Hill， D.Robertson，Gregory T.Farris，Michael A.Roop Ii，R.Martin Peterson，Kenneth M.. 1995，Gene 166(1)：175-176，公众可从中国科学院微生物研究所获得)质粒的SalI和 PstI位点，并进行测序验证。

质粒pBBR1-MCS5-P_{Nham_3450}-GFP是一个广宿主质粒，含有Nham_3450操控下的绿色荧光蛋 白编码基因，将其转入EC135/pM.Nham，阿拉伯糖诱导后提取质粒，转化菌株X14，菌株X14 的转化方法如下：将菌株在DSM756a培养基(1.5g yeast extract，1.5g peptone，2g NaNO₂， 0.55g sodium pyruvate，1mL trace element solution(33.8mg MnSO₄·H₂O，49.4mg H₃BO₃， 43.1mg ZnSO₄·7H₂O，37.1mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄，97.3mg FeSO₄·7H₂O and 25mg CuSO₄·5H₂O in 1L deionized water)and 100mL stock solution(0.07g CaCO₃，5g NaCl，0.5g MgSO₄·7H₂O， 1.5g KH₂PO₄in 1L deionized water)in 1L deionized water，pH 7.4))中培养至OD₆₀₀为0.1，冰浴10min，4℃8000rpm离心10min收集菌体，并用预冷的10％甘油洗涤菌体4次， 后重悬于1/1000原始培养体积的10％甘油。取90μL细胞，与150ng质粒混匀后加入1mm 的电转杯，1200V电击一次(ECM399电转仪)。将细胞洗入100mL756a培养基，28℃复苏1天， 然后加入终浓度20μg/mL的庆大霉素继续复苏1天。以1/100的体积比将复苏混合物转接入 含有20μg/mL庆大霉素的新鲜756a培养基。培养基OD₆₀₀为0.1后，以相同的方法再转接一 次，直至菌体生长至OD₆₀₀为0.1，得到X14/pBBR1-MCS5-P_{Nham_3450}-GFP(EC135/pM.Nham)；

分别取X14/pBBR1-MCS5-P_{Nham_3450}-GFP(EC135/pM.Nham)培养液10μL，涂片后置于荧光 显微镜下观察，以X14为对照。

结果如图18所示，A为X14，B为X14/pBBR1-MCS5-P_{Nham_3450}-GFP(EC135/pM.Nham)，可 以看出，X14/pBBR1-MCS5-P_{Nham_3450}-GFP(EC135/pM.Nham)细菌在488nm激发光下发出绿色 荧光，而未转化的细菌X14没有荧光。

说明转入外源基因。

取10mL X14/pBBR1-MCS5-P_{Nham_3450}-GFP(EC135/pM.Nham)菌液，用细菌DNA提取试剂盒 (天根，DP302-02)提取总DNA，然后取5μL DNA转化大肠杆菌TOP10，筛选庆大霉素抗性 转化子，提取质粒验证后与原始质粒pBBR1-MCS5-PNham_3450-GFP大小一致(5701bp)，说明 X14/pBBR1-MCS5-P_{Nham_3450}-GFP(EC135/pM.Nham)中的外源DNA分子pBBR1-MCS5-P_{Nham_3450}-GFP 没有损失，是克服限制修饰障碍完全转入X14中。

而Carsiotis，M.等报道(Genetic engineering of enhanced microbial nitrification. Carsiotis，M.and Khanna，S.US Environmental Protection Agency，Risk Reduction Engineering Laboratory.1989)，提取自大肠杆菌普通宿主的质粒DNA不能实现菌株X14的 遗传转化，因此本专利报道的方法具有较大优势。