外源DNA导入花生方法的研究及抗叶斑病变异品系的鉴定

摘要

本研究采用花粉管通道法和原位转化法对丰花1号、白沙1016、丰花3号和79266四个花生栽培品种进行了遗传转化，初步探讨了两种转化方法对结实率和T<,1>代出苗率的影响；确定了大田叶片涂抹筛选抗PPT转基因花生的技术方法。对危害花生的三种叶斑病的病原菌进行了分离鉴定，重点对花生褐斑病病原菌的培养特性和致病性进行了探讨。对利用花粉管通道法将国槐DNA和野生花生A．glabraDNA导入79266和白沙1016获得的7个抗叶斑病变异品系进行了系统的田间抗病性鉴定、主要农艺性状考察、品质性状分析和DNA差异的SSR多态性分析。取得的主要研究结果如下： 1．花粉管通道法和原位转化法进行花生基因转化的研究试验采用花粉管通道法和原位转化法对花生四个品种进行目的基因导入，发现两种导入方法对当代的结实率有较大影响，花粉管通道法当代的结实率高于原位转化法当代的结实率；两种导入方法对T<,1>代出苗率也有较大影响，花粉管通道法T<,1>代的出苗率明显高于原位转化法。大田叶片涂抹60mg/LPPT时，未转化植株叶片褐化明显，四个品种的PPT临界浓度相同。筛选抗PPT转基因花生的适宜PPT浓度确定为60mg/L。 2、花生褐斑病、黑斑病和网斑病病原菌的获得试验采用组织分离法，获得了花生褐斑病、黑斑病和网斑病的病原菌。对花生褐斑病病原菌的培养特性和致病性的研究表明：该病菌生长的温度范围较广，在5～35℃间均能生长，生长适宜温度为15～30℃，最适为25℃：产孢适宜温度为15～30℃，最适为25℃。近紫外照射对褐斑病病菌的孢子萌发有较明显的促进作用。采用离体叶片接种和大田整株接种鉴定所分离的病原菌的致病性，两种接种方法均能使叶片和植株感病，但两种鉴定方法感病叶片的病斑特点有差异。 3、国槐DNA及野生花生DNA导入花生所选育抗叶斑病变异品系的鉴定。 (1)变异品系叶斑病病情级数与受体的比较 对变异品系花生褐斑病的抗性鉴定表明：国槐DNA导入79266所获得的5个变异品系中，品系3的褐斑病抗性最强，小区病级仅为2.72，品系4的抗性次之，小区病级为2.82，两品系较受体的小区病级3.30都极显著降低，品系1、2和5的褐斑病小区病级分别3.16、3.00和3.25，与受体相比，小区病级降低，但均未达显著水平。野生花生A．gLabrateDNA导入白沙1016所获得的两个变异品系对褐斑病的抗性鉴定发现，品系7的小区病级仅为2.91，品系6的小区病级为3.36，受体白沙1016的小区病级为4.15，两个变异品系的小区病级较受体都极显著降低。 对变异品系花生网斑病的抗性鉴定表明：国槐DNA导入受体获得的5个变异品系，品系2的网斑病抗性最强，小区病级仅为3.11，其次为品系3，小区病级为3.19，受体79266的小区病级高达4.56。品系1、4和5的小区病级分别为3.90、3.62和3.65，5个变异品系的网斑病小区病级较受体都极显著降低。野生花生A．glabrate DNA导入白沙1016获得的品系6和品系7的网斑病小区病级分别为4.10和3.68，受体白沙1016的小区病级为5.62，两个变异品系的抗病性提高幅度较大，差异达到极显著水平。 (2)变异品系叶斑病病程发展进度与受体的比较 79266的AUDPC值为205.33，变异品系1～5的AUDPC值分别为158.67、112．00、116．67、133.00和145.83，较受体79266极显著降低；白沙1016的AUDPC值为240.33，变异品系6和7的AUDPC值分别为170.33和177.33，较受体极显著降低，即变异品系的叶斑病病害严重程度和发展速度都较受体极显著降低。 (3)变异品系主要农艺性状与受体的比较 外源DNA导入花生后引起了农艺性状的较大变异，受体79266的主茎高为63cm，经国槐DNA导入79266获得的5个变异品系中，品系1的主茎高仅为39cm，较受体极显著降低，品系4的主茎高为54，较受体显著降低：受体79266的侧枝长为68cm，品系1的侧枝长仅为52cm，较受体极显著降低；受体79266的单株果数为15个，品系1的单株果数高达46个，较受体极显著提高，品系2和品系3的单株果数分别为30和31个，较受体显著提高；受体79266的百果重为271g，品系1、3和5的百果重的分别为133g、208g和237g，较受体极显著降低，品系4的百果重为246g，较受体显著降低：受体79266的单株果重为25.93g，品系2、3和4的单株果重分别为14.32g、21.99g、和12.32g，较受体极显著降低，品系5的单株果重为22.71g，较受体显著降低。受体白沙1016的百果重和单株果重分别为74g和20.76g，经野生花生A．glabrate DNA导入白沙1016获得．的品系6的百果重为66g，显著低于受体，品系7的百果重为89g，极显著高于受体；品系6的单株果重为15.33g，极显著低于受体。各品系对叶斑病的抗性与主要农艺性状无显著相关。 (4)变异品系品质性状与受体的比较 受体79266的蛋白质含量为24.69％，粗脂肪含量为54.1％，可溶性总糖含量为3.54％，0/L值为2.16。经国槐DNA导入79266获得的5个变异品系中，品系2和品系4的蛋白质含量分别是26.53％和26.13％，极显著高于受体，品系1和品系3的蛋白质含量分别是23.75％和23.00％，显著低于受体；品系2的粗脂肪含量为49.43％，极显著低于受体，品系3的脂肪含量为52.03％，显著低于受体：品系1的可溶性总糖含量为3.81％，显著高于受体，品系2和品系3的总糖含量分别为4.25％和4.29％，极显著高于受体，品系4的总糖含量为2.86％，极显著低于受体；品系2和品系4的0/L值分别为1.79和1.26，极显著低于受体，品系3的0/L值为2. 38，极显著高于受体。 受体白沙1016的蛋白质含量为27.32％，粗脂肪含量为53.73％，可溶性总糖含量为3.82％，0/L值为1.23。经野生花生A．glabrate DNA导入白沙1016获得品系6的蛋白质含量为24.82％，粗脂肪含量为51.13％，都极显著低于受体，可溶性总糖含量为4.60％，极显著高于受体，0/L值为2.04，极显著高于受体；品系7的可溶性总糖含量为5.24％，极显著高于受体，0/L值为2.32，极显著高于受体。 (5)变异品系与受体DNA差异的SSR多态性分析 采用40对引物进行SSR扩增，在品系1～7与受体间分别有19、20、18、19、20、17和15对引物扩增出条带，其中多态性引物分别有6、7、5、6、4、4和3对。采用筛选的多态性引物在7个变异品系与受体间分别扩增出22、24、22、23、23、24和24条带，其中多态性条带分别为9、8、6、7、5、6和5条。品系1与受体的多态性最高，在分子水平上的差异最大，品系5和品系7与其受体多态性最低，在分子水平上差异最小。

目录

论文说明：英文缩略表

声明

摘要

1引言

1.1花生基因转化方法的研究

1.1.1农杆菌介导的转化方法

1.1.2基因枪介导的转化方法

1.1.3聚乙二醇介导的基因转化法

1.1.4花粉管通道法的基因转化法

1.2植物抗真菌病害基因工程的研究进展

1.2.1植物抗病性的遗传基础及可能的作用机制

1.2.2植物抗真菌病害基因工程的策略

1.2.3植物抗真菌基因工程面临的挑战

1.3本研究的目的意义

2材料与方法

2.1采用花粉管通道法和原位转化法进行花生基因转化的研究

2.1.1试验材料

2.1.2试验方法

2.2花生叶斑病病原菌的分离纯化与致病性研究

2.2.1试验材料

2.2.2试验方法

2.3国槐DNA与野生花生DNA导入花生选育的抗叶斑病品系的鉴定

2.3.1试验材料

2.3.2试验方法

3结果与分析

3.1采用花粉管通道法和原位转化法进行花生基因转化的研究

3.1.1两种转基因操作方法对花生的影响

3.1.2 PPT对转基因植株检测浓度的确定

3.1.3抗PPT转基因株的筛选

3.1.4抗除草剂植株的PCR分子检测

3.2花生叶斑病病原菌的分离纯化与致病性研究

3.2.1花生褐斑病、黑斑病和网斑病病原菌的获得

3.2.2花生褐斑病病菌的培养特性研究

3.2.3花生褐斑病病菌的致病性研究

3.3国槐DNA与野生花生DNA导入花生所选育抗叶斑病变异品系的鉴定

3.3.1花生变异品系对花生褐斑病和网斑病的抗性鉴定

3.3.2花生变异品系农艺性状考察及与抗病性的相关性分析

3.3.3花生变异品系的品质性状比较

3.3.4花生变异品系DNA的SSR差异分析

4讨论

4.1采用花粉管通道法和原位转化法进行花生基因转化的研究

4.2花生叶斑病病原菌的分离纯化与致病性研究

4.3国槐DNA与野生花生DNA导入花生所选育抗叶斑病变异品系的鉴定

5结论

5.1采用花粉管通道法和原位转化法进行花生基因转化的研究

5.2花生叶斑病病原菌的分离纯化与致病性研究

5.3国槐DNA与野生花生DNA导入花生所选育抗叶斑病变异品系的鉴定

5.3.1变异品系对花生褐斑病和网斑病抗性的鉴定

5.3.2变异品系农艺性状的考察

5.3.3变异品系品质性状的考察

5.3.4变异品系与受体DNA的SSR多态性分析

5.3.5花生抗叶斑病变异品系的综合评价

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况