一种耐温型产碱杆菌及其在威兰胶生产中的应用

摘要

本发明公开了一株耐温型产碱杆菌，其分类命名为产碱杆菌(Alcaligenes sp.)HT-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M 2012062。本发明还公开了上述菌株在威兰胶生产中应用。本发明的菌株能在高温下发酵生产威兰胶，显著缩短发酵时间，提高生产强度，节能环保。且该菌株能利用多种碳源和氮源，培养条件粗放，出胶率高，质量好。

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种耐温型产碱杆菌(Alcaligenes sp.)HT-1及其 在威兰胶(welan gum)生产中的应用。

背景技术

微生物多糖以其分子结构多样性、独特的物理学和流变学特性以及使用安全性，在 工业生产和生活的许多领域具有广泛的应用价值。目前全世界微生物多糖需求量约为 15-20万吨/年，年产值可达150-200亿美元，产量和年增长量均在10％以上，而一些新 型多糖年增长量在30％以上。上世纪80年代继黄原胶之后，美国Kelco公司陆续发现 了一组新型的微生物多糖即结冷胶类多糖，引起了科学界和工业界的浓厚兴趣。威兰胶 是结冷胶家族的一员，它的单体组成为葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖和鼠李糖。威兰胶 具有许多优良而独特的理化特性，可以作为增稠剂、悬浮剂、稳定剂等广泛用于石油、 混凝土、涂料行业，也可用于油墨、食品、纺织印染、农药、化妆品、医药等行业。

目前，威兰胶的生产主要是采用微生物发酵法，菌种是发酵的基础，通过菌种选育 改良，筛选出高产稳定的生产菌，可以使发酵过程达到经济高效的目的。此外，微生物 的发酵生产水平还取决于最佳的环境条件，温度对发酵的影响及其调节控制是影响有机 体生长繁殖最重要的因素之一，主要表现在对细胞生长、产物合成、发酵液的物理性质 和生物合成方向等方面。在一定的范围内，随着温度的升高，微生物体内生化反应酶活 力增加，细胞的生长繁殖速度加快；随着温度的升高，气体在溶液中的溶解度减小，氧 的传递速率也会改变。在工业化的发酵过程中，由于菌体释放的发酵热常常超过微生物 的最适培养温度，因此一般不须要加热反而需要冷却的情况较多。因此选育耐温型生产 菌株不仅利于调控发酵过程，而且节能环保。

中国专利200610088356.0公开了一株生产威兰胶的菌株，即产碱杆菌NXG-3 (CGMCC No.1737)，该菌株的发酵生产威兰胶的温度为25～35℃，最适温度为30℃， 培养时间为36～72小时，最高发酵产量为27g/L。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是在中国专利200610088356.0的基础上，提供一株耐 温型产碱杆菌。

本发明还有解决的技术问题是提供上述产碱杆菌在制备威兰胶中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株耐温型产碱杆菌，其分类命名为产碱杆菌(Alcaligenes sp.)HT-1，已保藏于中国 典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；邮编430072；保藏号CCTCC NO： M 2012062。保藏日期是：2012年3月7日。以此菌作为生产菌株。

本发明的耐温型产碱杆菌是由产碱杆菌CGMCC No.1737(ZL200610088356.0)诱 变筛选得到。具体的诱变筛选步骤如下：

①.产碱杆菌CGMCC No.1737菌悬液的制备：

将产碱杆菌CGMCC No.1737接种于无菌的种子培养基中，在25～32℃的条件下， 振荡培养8-12小时，将种子液多次离心并用缓冲液洗涤后制成菌悬液，其中种子培养 基中各组分用量按各组分与培养基重量体积百分比计为：葡萄糖1～2％，蛋白胨 0.1～0.5％，酵母膏0.2～0.8％，其余为水。

②.等离子体诱变及温度梯度筛选：

将菌悬液放在等离子体下照射1-10分钟，照射剂量为1-10SLM，温度为20-25℃， 处理过的菌悬液多次离心洗涤后稀释涂布于平板上，分布置于36-40℃培养箱中，每2℃ 设一个梯度，培养2-3天。

③.摇瓶筛选：

挑取生长较快，健壮饱满湿润的大菌落进行摇瓶发酵复筛。发酵培养基中各组分用 量按各组分与培养基重量体积百分比计为：碳源用量为培养基的2～6％，氮源用量为培 养基的0.1～1％，无机盐用量为培养基的0.01～1％，其余为水。

经多次传代后挑选粘度较高，耐温性好，菌苔丰满，湿润，有光泽，无不规则菌苔 生成的菌落，分离出上述产碱杆菌。

本发明得到的耐温型产碱杆菌CCTCC NO：M 2012062菌株具有下述性质：

(1)菌落形态学特征：

在营养琼脂上，36℃培养20-22h出现黄色小菌落，菌落呈圆形，表面光滑，粘状， 中央凸起，不透明。适当延长培养，菌落颜色加深，细胞的尺寸和形状变化很小。

(2)生理与生化特性：

a.培养温度：36～40℃，最适温度为37℃；

b.在pH5～10范围内生长；

c.色素产生：产黄色素；

d.耐NaCl浓度：在5％浓度可以生长。

(3)抗生素敏感性试验：

HT-1菌株对以下抗生素的最小抑菌浓度如下：

(4)营养特征：

产碱杆菌HT-1的培养基中不需要添加生长因子，可以利用多种化合物作为碳源， 这些物质既可以单独使用，也可以适当的比例复配充当碳源。有机氮或无机氮都可以作 为氮源使用。培养基中各组分用量配比按各组分与培养基重量体积百分比计为：碳源用 量为培养基的2～7％(即每100ml培养基中含有碳源2-7克，下同)，氮源用量为培养基 的0.1～1％，无机盐用量为培养基的0.01～1％，其余为水。碳源一般采用葡萄糖、蔗糖、 果糖、可溶性淀粉、糖蜜、淀粉水解液中的一种或多种；氮源为蛋白胨、酵母膏、玉米 浆、豆粕粉、棉籽饼粉、尿素、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl中的一种或多种；无机盐为钾盐、 镁盐、磷酸盐、硫酸盐等常用的无机盐类。

上述耐温型产碱杆菌CCTCC NO：M 2012062在威兰胶生产中的应用。

具体方法为：将保藏号为CCTCC NO：M 2012062的菌株接种于含碳源、氮源、无 机盐和水的无菌发酵培养基中，在合适生长的条件下进行通风、搅拌培养，生成的威兰 胶发酵液经提取得到威兰胶。

其中，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、糖蜜和淀粉水解液中的任 意一种或几种的混合物，浓度为20～70g/L；所述的氮源为蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆 粕粉、棉籽饼粉、尿素、(NH₄)₂SO₄和NH₄Cl中的任意一种或几种的混合物，浓度为 1～10g/L；所述的无机盐为钾盐、镁盐、磷酸盐、和硫酸盐中的任意一种或几种，浓度 为0.1～10g/L。

其中，所述的合适生长的条件是：初始pH为6.5～8.0、培养温度为36～40℃、培养 时间为30～35小时。

其中，从威兰胶发酵液中提取威兰胶的方法为本领域公知技术，具体可参考专利 ZL200610088356.0中描述的提取方法。

具体地说：

本发明提供的利用耐温性产碱杆菌HT-1制备威兰胶的方法，是将CCTCC NO：M 2012062号菌株斜面活化一天后(斜面培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基)，在含有碳源、 氮源和无机盐的培养基上培养30～35小时，可以生成40～45g/L的威兰胶发酵液，通常 发酵条件还包括：培养基为：葡萄糖或玉米淀粉水解液1～6％，蛋白胨或豆粕粉0.1～1％， MgSO₄0.01～0.5％，K₂HPO₄0.01～0.5％，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml， 以下同。发酵温度36～40℃，较佳的为37℃；培养基的初始pH范围为6.5～8.0，较佳的 为6.8～7.2；转速100-200r/min。这样的发酵条件既适用于摇瓶发酵，也可以放大至100 L的发酵罐中使用。

本发明制备的威兰胶具有如下的理化性质：

(1)产品易溶于水，1％的威兰胶水溶液粘度可达2500-3500cp(测定条件：NDJ-1型 粘度计，4号转子，60rpm)，威兰胶不溶于乙醇、异丙醇等有机溶剂。

(2)产品具有很好的温度耐受性，在150℃下处理半小时，粘度不变；在pH2～13 的范围内，性质稳定。

(3)产品经4mol/L硫酸水解、糖腈乙酸酯衍生化处理后，气相色谱检测得威兰胶的 单糖组分为：葡萄糖、甘露糖、鼠李糖；化学法测得该产品中还含有葡萄糖醛酸。结构 式如下：

(4)采用高碘酸氧化法，鉴定了本品的糖苷键类型主要为1→4键和1→3键。

本发明的优点：

(1)本发明筛选到一株耐温型威兰胶生产菌，该菌能在36-40℃条件下生产威兰胶， 发酵时间显著缩短，节能环保。

(2)可以使用粗淀粉水解糖液(替代葡萄糖或蔗糖)和豆粕粉(替代酵母膏或蛋 白胨)作为威兰胶发酵培养基的碳源和氮源，使发酵原料成本大幅下降。

(3)菌株的发酵产量大幅度的提高，达到40～45g/L威兰胶产量，适应于工业化生 产。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的 本发明。

实施例1：耐温型威兰胶生产菌株的选育

①.产碱杆菌菌悬液的制备：

将产碱杆菌CGMCC No.1737接种于种子培养基中，在25～32℃的条件下，振荡培 养10小时，将种子液多次离心并用缓冲液洗涤后制成菌悬液，其中种子培养基：葡萄 糖20g/L，蛋白胨3g/L，酵母膏1g/L，K₂HPO₄2g/L，MgSO₄0.1g/L，pH7.2。

②.等离子体诱变与温度梯度选育：

将菌悬液放在等离子体下照射5分钟，照射剂量为10SLM，温度为25℃，处理过 的菌悬液多次离心洗涤后稀释涂布于平板上，30-40℃条件下，每2℃设置一个温度梯度， 培养2-3天。

③.摇瓶筛选：

挑选诱变后培养皿上健壮饱满、湿润的大菌落进行摇瓶发酵复筛，发酵摇瓶培养基： 葡萄糖40g/L，豆饼粉4g/L，蛋白胨1g/L，K₂HPO₄2g/L，MgSO₄0.1g/L，pH7.2。

经多次传代后挑选粘度较高，耐温性好，菌苔丰满，湿润，有光泽，无不规则菌苔 生成的菌落，得到本发明的节能耐温型产碱杆菌。

实施例2：

斜面培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.2。

发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母膏4g/L，蛋白胨1g/L，K₂HPO₄2g/L，MgSO₄0.1 g/L，pH7.2。250ml容积的三角瓶中装液量50ml，121℃灭菌15分钟。

将保藏号为CCTCC NO：M 2012062的Alcaligenes sp.HT-1在斜面培养基上37℃培 养48-72h，然后接一环此菌于发酵培养基中，37℃培养35h，摇瓶转速220r/min，最 后得到的发酵液中威兰胶的含量为34.5g/L。

实施例3：

斜面培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.2。

发酵培养基：葡萄糖60g/L，蛋白胨8g/L，K₂HPO₄2g/L，MgSO₄0.1g/L，pH7.2。 250ml容积的三角瓶中装液量50ml，121℃灭菌15分钟。将保藏号为CCTCC NO：M 2012062的Alcaligenes sp.HT-1在斜面培养基上37℃培养48-72h，然后接一环此菌于发 酵培养基中，37℃培养30h，摇瓶转速220r/min，最后得到的发酵液中威兰胶的含量为 40.2g/L。

实施例4：

将葡萄糖300g，豆饼粉40g/L，K₂HPO₄10g，MgSO₄0.5g，pH7.2，用水定容到 5.0L，配成发酵液，装入一个7.5升玻璃搅拌发酵罐中，121℃蒸汽灭菌15分钟。配制 种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏1g/L，K₂HPO₄2g/L，MgSO₄0.1 g/L，pH7.2。接Alcaligenes sp.HT-1两环于种子培养基中，37℃培养14h得种子液，将 种子液按发酵液体积5％(v/v)的接种量接入冷却后的发酵液中，37℃培养(通风量1vvm， 搅拌转速为600r/min)32h，发酵液中含威兰胶44.9g/L，发酵液粘度可达14000cp。

实施例4：

将1750克玉米淀粉与适量的水混合，加入适量的高温α-淀粉酶液，用水定容至35 L，装入50L机械搅拌发酵罐中，90℃保温液化10分钟，然后加入豆粕粉280g，K₂HPO₄70g，MgSO₄3.5g，pH7.2，再升温至121℃蒸汽灭菌10分钟。将种子液按发酵液体积 5％(v/v)的接种量接入冷却后的发酵液中，37℃培养35小时，发酵液中含威兰胶40g/L， 成熟的发酵液升温至80～90℃灭活15分钟，冷却后加入发酵液体积两倍的浓度为95％ 的乙醇，4℃保温过夜，离心去除上清液，沉淀物在100℃烘箱中烘1h至恒重，即得威 兰胶成品。

实施例5：

威兰胶的后提取工艺：

A.粗滤：取50mL按实施例2得到的成熟发酵液，用HCl调节pH为6.5～7.5， 进行粗滤，粗滤方式选用110目工业滤布，发酵液中加0.5g助滤剂(硅藻土)，抽滤。

B.超滤浓缩：将经过粗滤的威兰胶发酵液在超滤器内进行浓缩，超滤膜截流分子 量为10⁶道尔顿，操作压力为0.2MPa，控制温度50℃，膜面速度4m/s。

C.醇析：将超滤后的发酵液在不断搅拌下加入95％的工业乙醇，乙醇用量为威兰 胶超滤浓缩液体积的1.2倍，静置形成沉淀。

D.烘干和粉碎：将沉淀块搅碎，装入滤布中抽滤至无液体流出，沉淀物55℃真空 干烘干3小时，粉碎即为产品。