一株红球菌及应用该菌株对三苯甲烷类染料进行降解脱色的方法

摘要

一株红球菌及应用该菌株对三苯甲烷类染料进行降解脱色的方法，属于微生物与发酵技术领域。本发明公开的菌株，命名为红球菌（Rhodococcussp.）JB301，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2012064。应用该菌株可对三苯甲烷类染料进行降解脱色，步骤为：1、斜面培养；2、种子培养；3、降解脱色：将培养好的种子离心收集菌体，将收集的菌体全部转移到脱色培养基中，在温度25~37℃、pH值6.0~9.0的条件下对三苯甲烷类染料（以结晶紫和孔雀石绿为典型代表）进行降解脱色。本发明首次将红球菌（Rhodococcussp.）JB301成功应用于三苯甲烷类染料的降解脱色当中，并对其工艺进行了优化，对于染料污染的治理以及人类健康的保障都有重要意义。

说明书

技术领域

一株红球菌及应用该菌株对三苯甲烷类染料进行降解脱色的方法，属于微生物与发酵技术领域。

背景技术

我国是染料生产大国，每年生产的染料达150万吨以上，在世界染料工业中占有重要地位。每年有10%-20%的染料随着废水被排放到环境中。由于纺织等工业的需要，实际应用的染料大多数为抗光照、抗氧化的难降解芳烃类化合物，这类物质不但对环境造成了危害，还由于其自身又是有毒且能致癌的物质，对人体健康也造成了威胁。

三苯甲烷类染料是继偶氮染料、蒽醌染料之后使用量第三大的染料，在纺织印染、造纸、制革等工业中被广泛地应用。三苯甲烷类染料对哺乳动物细胞具有毒害及致癌、致畸和致突变的作用，是对人类健康具有潜在危害的环境污染物，结晶紫和孔雀石绿是三苯甲烷类染料中的两种典型代表。对三苯甲烷类染料生物脱色降解进行研究，对于染料污染治理及人类健康都具有重要意义。

红球菌作为一种能够降解烃类化合物、氯化烃、芳香烃、硝基芳香化合物以及氯化多环芳香烃等化合物的菌种，在染料的生物降解脱色中有重要作用（① Gennaro PD, Rescalli E, Galli E. Characterization of Rhodococcus opacus R7, a strain able to degrade naphthalene and oxylene isolated from a polycyclic aromatic hydrocarbon contaminated soil [J]. Res Microbiol, 2001, 152(9):641-651；② 沈锡辉, 刘志培, 王保军, 等. 苯酚降解菌红球菌PNAN5菌株 (Rhodococcus sp. strain) PNAN5 的分离鉴定、降解特性及其开环双加氧酶性质研究[J].环境科学学报, 2004, 24(3):482-486.；③ 李俊, 舒为群, 陈济安, 等. 降解DBP菌株CQ0302 的分离鉴定及其降解特性 [J] 中国环境科学, 2005, 25(1)：47-51.）。

然而，关于红球菌在三苯甲烷类染料降解脱色中的应用则尚未见报道。本发明旨在提供一株对三苯甲烷类染料具有明显降解脱色效果的菌株，及其相关的降解脱色工艺，对于治理染料污染、保障人类健康都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株对三苯甲烷类染料具有明显脱色能力的红球菌，以及应用该菌株对三苯甲烷类染料进行降解脱色的方法。

本发明的技术方案：一株对三苯甲烷类染料具有降解脱色作用的红球菌，命名为红球菌（Rhodococcus sp.）JB301，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2012064。

本发明所述的红球菌CCTCC NO：M 2012064，在三苯甲烷类染料降解脱色中的应用，通过以下步骤实现：

步骤一、斜面培养，将红球菌（Rhodococcus sp.）JB301 CCTCC NO：M 2012064，接种到斜面培养基上，在30℃条件下培养48小时；

步骤二、种子培养，将在斜面培养基上长好的红球菌接种到新鲜的种子培养基中，在30℃培养24小时，摇床转速150转/分钟；

步骤三、降解脱色，取一定体积的培养好的种子，离心收集菌体，将离心收集的全部菌体转移到等量体积的脱色培养基中，在25~37℃、pH 6.0~9.0的条件下继续培养8小时。

菌种来源：红球菌（Rhodococcus sp. JB301）CCTCC NO：M 2012064的菌种来源、筛选、分离及鉴定详见实施例1。

本发明所采用的斜面培养基组成（单位克/升）：蛋白胨 10，酵母提取物 5，氯化钠 5，琼脂 15，以去离子水配制，pH 7.0，121℃灭菌15分钟。

本发明所采用的种子培养基组成（单位克/升）：蛋白胨 10，酵母提取物 5，氯化钠 5，以去离子水配制，pH 7.0，每个250毫升三角瓶中100毫升装新鲜的种子培养基，121℃灭菌15分钟。

本发明所采用的脱色培养基组成（单位克/升）：葡萄糖 5，硫酸铵 3，磷酸氢二钾 1，硫酸镁 0.5，氯化钾 0.5，及相应的染料，以去离子水配制，pH 6.0~9.0。每个100毫升三角瓶装40毫升新鲜的脱色培养基，121℃灭菌15分钟。

选用结晶紫或孔雀石绿作为三苯甲烷类染料的典型代表。

降解脱色培养体系中的结晶紫的起始浓度5-15毫克/升；降解脱色培养体系中的孔雀石绿的起始浓度25-50毫克/升。

如使用的为结晶紫，在单批次脱色应用时，在降解脱色培养体系中浓度为15毫克/升，在连续培养脱色应用时，在降解脱色培养体系中浓度为5毫克/升；如使用的为孔雀石绿，则在单批次脱色应用时，在降解脱色培养体系中浓度为50毫克/升，在连续培养脱色应用时，在降解脱色培养体系中浓度为25毫克/升。

本发明在步骤三中所述的降解脱色率的测算具体按照以下方法：

（1）结晶紫降解脱色率的测定：取脱色培养液按体积比1:2的比例加入无水乙醇，混匀，8000转/分钟离心10分钟，取清液。用分光光度计在染料的最大吸收峰处测定上清液中剩余染料的浓度，并以条件相同的不接种的脱色培养基作为对照组来测定染料的降解脱色率。每组实验三个平行，降解脱色率按以下公式来计算：

其中I为对照组在最大吸收峰处的吸光值，F为样品在最大吸收峰处的吸光值。

（2）孔雀石绿降解脱色率的测定：取脱色培养液按体积比2:1的比例加入无水乙醇，混匀，8000转/分钟离心10分钟，取清液。用分光光度计在染料的最大吸收峰处测定上清液中剩余染料的浓度，并以条件相同的不接种的脱色培养基作为对照组来测定染料的降解脱色率。每组实验三个平行，降解脱色率按以下公式来计算：

其中I为对照组在最大吸收峰处的吸光值，F为样品在最大吸收峰处的吸光值。

本发明有益效果：本发明提供的菌株及相应的降解脱色工艺对三苯甲烷类染料的典型代表结晶紫或孔雀石绿均有很好的脱色效果，具体地说，对于15毫克/升的结晶紫，经8小时的脱色培养，最佳降解脱色率可达到93.3%；对于50毫克/升的孔雀石绿，最佳的脱色效果可达到96.3%；这对于染料污染治理及人类健康都具有重要意义。

生物材料样品保藏：一株可高效降解三苯甲烷类染料的红球菌（Rhodococcus sp.）JB301，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址中国  武汉  武汉大学，保藏日期2012年3月7日，保藏编号CCTCC NO：M 2012064。

具体实施方式

在下面所述的所有具体实施例中，斜面培养基、种子培养基、脱色培养基组成均如上所述，其他如无特殊说明，均为本领域常用方法。

实施例1 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301筛选分离与鉴定

一、红球菌（Rhodococcus sp.）JB301是从南通市通州区三余镇合兴村木材加工个体经营户取得的木屑中分离而来的。取5克木屑到含有10粒小玻璃珠的250毫升灭菌三角瓶中，加入100毫升无菌生理盐水，在30℃摇床上150转/分钟振荡培养20分钟，静置2小时；取上述菌悬液，将其稀释10^-5，10^-6，10^-7倍，取100微升涂布在水溶苯胺蓝平板（水溶苯胺蓝平板组成，单位克/升：蛋白胨 10，酵母提取物 5，氯化钠 5，苯胺蓝 2，琼脂 15，pH 7.0，121℃灭菌15分钟），每个浓度重复三次，30℃培养48小时，挑选透明圈较大的单个菌落多次纯化，将纯化后的菌株接种到斜面培养基上，30℃培养48小时后放于4℃冰箱保存待用。

将4℃冰箱保存待用的菌株接种到种子培养基中，30℃培养24小时后，取40毫升种子离心收集全部菌体，将全部菌体转接入40毫升脱色培养基中，测定培养过程中菌株对染料的降解脱色率，从中筛选出一株具有高效降解脱色能力的菌株，定名为JB301。

二、红球菌（Rhodococcus sp.）JB301的鉴定

（1）形态特征

在斜面培养基上培养48小时后其直径约为1mm，菌落呈椭圆形突起，湿润，边缘规则；在种子培养中，菌株生长24小时达到对数期；30℃下生长情况最好，37℃几乎不生长。

（2）16S rDNA测定

将目的菌株在斜面培养基上培养24小时，利用PCR技术扩增该菌株的16S rDNA，所用上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，其序列见SEQ ID NO: 1。将测序结果与GeneBank中已知的16S rDNA序列进行同源性比较，发现与Rhodococcus qingshengii djl-6（GenBank accession No. NR_043535.1）的同源性最高，高达99%。其16S rDNA为SEQ ID NO：1。

（3）生理生化鉴定

根据相关报道，对菌株JB301进行生理生化鉴定（见下表），其生理生化特征与红球菌属相吻合（Xu JL, He J, Wang ZC, et al.Rhodococcus qingshengii sp. nov., a carbendazimdegrading bacterium [J]. Int J Syst Evol Microbiol 2007, 57:2754-2757.）。

表1 菌株JB301生理生化特征

特征JB301特征JB301菌体形态杆状菌落颜色橘黄形成芽孢-甲基丙酮酸盐-运动性-木糖醇-α-羟基丁酸-D-甘露醇-好氧生长+D-甘露糖+革兰氏染色+海藻糖-邻苯二酚+尿素酶+肌醇-DNA G+ C ( mol%)61

注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应

结合分子16S rDNA鉴定和传统生理生化鉴定，确定该菌株为红球菌属，将此菌株命名为JB301，已于2012年3月7日在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号CCTCC NO：M 2012064。

实施例2 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色结晶紫

（1）斜面培养：将红球菌（Rhodococcus sp.）JB301接种于斜面培养基上，在30℃下培养48小时。所用斜面培养基的组成为（单位克/升）：蛋白胨 10，酵母提取物 5，氯化钠 5，琼脂 15，pH值7.0，121℃灭菌15分钟。

（2）种子培养：将在斜面培养基上长好的菌种用接种环取一环接入种子培养基中，30℃培养24小时，摇床转速150转/分钟。种子培养所用种子培养基组成为（单位克/升）：蛋白胨 10，酵母提取物 5，氯化钠 5，pH 7.0，每个250毫升三角瓶装100毫升种子培养基，121℃灭菌15分钟。

（3）降解脱色培养：取培养好的种子40毫升，装在两个50毫升的无菌离心管中，每个离心管中装20毫升，8000转/分钟条件下离心10分钟，弃清液，收集全部菌体，将收集到的菌体全部转移到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含有结晶紫的脱色培养基，结晶紫浓度为15毫克/升，脱色培养基pH 7.0；摇床转速150转/分钟，在30℃下继续培养8小时，降解脱色率达到81.4%。结晶紫的降解脱色率的测算具体按照以下方法进行：

取含结晶紫的脱色培养液，按1:2的比例（体积比）加入无水乙醇，混匀，8000转/分钟离心10分钟，取清液。用分光光度计在染料的最大吸收峰处测定上清液中剩余染料的浓度，并以条件相同不接种的脱色培养基作为对照组来测定染料的降解脱色率。每组实验三个平行，降解脱色率按以下公式来计算：

其中I为对照组在最大吸收峰处的吸光值，F为样品在最大吸收峰处的吸光值。

实施例3 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色结晶紫

取培养好的种子40毫升，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含结晶紫的脱色培养基，脱色培养基pH 8.0，其他条件同实施例2所述，在35℃条件下继续培养8小时，结晶紫的降解脱色率达到74.2%。

实施例4 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色结晶紫

取培养好的种子40毫升，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含结晶紫的脱色培养基，脱色培养基pH 7.0，其他条件同实施例2所述。在35℃条件下继续培养8小时，结晶紫的降解脱色率达到93.3%。

实施例5 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色结晶紫

取培养好的种子40毫升，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含结晶紫的脱色培养基，脱色培养基pH值为6.0，其他条件同实施例2所述。在25℃条件下继续培养8小时，结晶紫的降解脱色率为64.3%。

实施例6 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色结晶紫

取培养好的种子40毫升，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含结晶紫的脱色培养基，脱色培养基pH值为9.0，其他条件同实施例2所述。在25℃条件下继续培养8小时，测得结晶紫的降解脱色率达到85.6%。

实施例7 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色结晶紫

取培养好的种子40毫升，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含结晶紫的脱色培养基，脱色培养基pH值为6.0，其他条件同实施例2所述。在37℃条件下继续培养8小时，测得结晶紫的降解脱色率达到68.3%。

实施例8 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色结晶紫

取培养好的种子40毫升，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含结晶紫的脱色培养基，脱色培养基pH值为9.0，其他条件同实施例2所述。在37℃条件下继续培养8小时，测得结晶紫的降解脱色率达到88.3%。

实施例9 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色孔雀石绿

取培养好的种子40毫升，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含有孔雀石绿的脱色培养基，孔雀石绿的浓度为50毫克/升，脱色培养基pH值7.0；在摇床转速150转/分钟、温度30℃的条件下继续培养8小时，测得孔雀石绿的降解脱色率达到93.7%。孔雀石绿的降解脱色率的测算具体按照以下方法进行：

取含孔雀石绿的脱色培养液，按2:1的比例（体积比）加入无水乙醇，混匀，8000转/分钟离心10分钟，取清液。用分光光度计在染料的最大吸收峰处测定上清液中剩余染料的浓度，并以不接种的染料培养基作为对照来测定染料的降解脱色率。每组实验三个平行，降解脱色率按以下公式来计算：

其中I为对照组在最大吸收峰处的吸光值，F为样品在最大吸收峰处的吸光值。

本实施例其他条件同实施例2。

实施例10 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色孔雀石绿

取培养好的种子40毫升，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含孔雀石绿的脱色培养基，脱色培养基pH 8.0，其他条件同实施例9所述，在35℃条件下继续培养8小时，测得孔雀石绿的降解脱色率达到96.3%。

实施例11 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色孔雀石绿

取培养好的种子40毫升，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含孔雀石绿的脱色培养基，脱色培养基pH 7.0，其他条件同实施例9所述。在35℃条件下继续培养8小时，测得孔雀石绿的降解脱色率达到95.8%。

实施例12 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色孔雀石绿

取培养好的种子40毫升，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含孔雀石绿的脱色培养基，脱色培养基pH 6.0，其他条件同实施例9所述。在25℃条件下继续培养8小时，孔雀石绿的降解脱色率为86.5%。

实施例13 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色孔雀石绿

取培养好的种子40毫升，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含孔雀石绿的脱色培养基，脱色培养基pH 9.0，其他条件同实施例9所述。在25℃条件下继续培养8小时，测得孔雀石绿的降解脱色率达到92.3%。

实施例14 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色孔雀石绿

取培养好的种子40毫升，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含孔雀石绿的脱色培养基，脱色培养基pH值为6.0，其他条件同实施例9所述。在37℃条件下继续培养8小时，测得孔雀石绿的降解脱色率达到83.4%。

实施例15 红球菌（Rhodococcus sp.）JB301降解脱色孔雀石绿

取培养好的种子40毫升，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含孔雀石绿的脱色培养基，脱色培养基pH 9.0，其他条件同实施例9所述。在37℃条件下继续培养8小时，测得孔雀石绿的降解脱色率达到93.4%。

实施例16 对结晶紫的连续批次脱色培养

（1）第一批次，取培养好的种子40毫升，装在两个50毫升的离心管中，每个离心管装20毫升，8000转/分钟条件下离心10分钟，弃清液，收集全部菌体，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含有结晶紫的脱色培养基，结晶紫浓度为5毫克/升，脱色培养基pH 7.0，在摇床转速150转/分钟、温度35℃的条件下继续培养8小时；种子培养条件同实施例2；

（2）第二批次，在第一批次脱色液中加入结晶紫，并使其终浓度在新的脱色培养体系中达到5毫克/升（经第一批次脱色后，脱色体系中剩余结晶紫降解速率极低，将其含量默认为零），继续在35℃，pH 7.0的条件下，继续培养8小时；

（3）第三批次，重复第二批次的操作。

以此类推，进行第四至第十批次的连续脱色培养，连续脱色培养的各个批次的结晶紫脱色效果见下表：

表2对结晶紫的连续批次脱色培养效果

批次降解脱色率（%）批次降解脱色率（%）193.3668.4281.4764.8377.9860.3474958.25721054

实施例17 对孔雀石绿的连续批次脱色培养

（1）第一批次，取培养好的种子40毫升，装在两个50毫升的离心管中，每个离心管装20毫升，8000转/分钟条件下离心10分钟，弃清夜，收集全部菌体，将收集到的菌体全部转接到100毫升三角瓶中，其中装有40毫升含有孔雀石绿的脱色培养基，孔雀石绿浓度为25毫克/升，脱色培养基pH 8.0，在摇床转速150转/分钟、温度35℃的条件下继续培养8小时；

（2）第二批次，在第一批次脱色液中加入孔雀石绿，并使其终浓度在新的脱色培养体系中达到25毫克/升（经第一批次脱色后，脱色体系中剩余孔雀石绿降解速率极低，可将其含量视为零），继续在35℃，pH 8.0的条件下培养8小时；

（3）第三批次，重复第二批次的操作。

以此类推，进行第四至第十批次的连续脱色培养，连续脱色培养各个批次的孔雀石绿的脱色效果见下表：

表3对孔雀石绿的连续批次脱色培养效果

批次降解脱色率（%）批次降解脱色率（%）196.3685.4293.6784.3390.5882.4488.9981.5586.81079.0

以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。

<210>  SEQ ID NO: 1

<211>  1544

<212>  DNA

<213>  红球菌（Rhodococcus sp.） JB301

 

<400>1     

 

16S rDNA 序列

1    aactcgtcct cggttcccgg cgatcctctg gagattagag tttgatcctg gctcaggacg

61   aacgctggcg gcgtgcttaa cacatgcaag tcgagcggta aggcctttcg gggtacacga

121  gcggcgaacg ggtgagtaac acgtgggtga tctgccctgc acttcgggat aagcctggga

181  aactgggtct aataccggat atgacctcct atcgcatggt gggtggtgaa agatttatcg

241  gtgcaggatg ggcccgcggc ctatcagctt gttggtgggg taatggccta ccaaggcgac

301  gacgggtagc cgacctgaga gggtgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact

361 cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat gcagcgacgc

421  cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta aacctctttc agcagggacg aagcgcaagt

481  gacggtacct gcagaagaag caccggctaa ctacgtgccg gcagccgcgg taatacgtag

541 ggtgcaagcg ttgtccggag ttactgggcg taaagagttc gtaggcggtt tgtcgcgtcg

601  tttgtgaaaa ccagcagctc aactgctggc ttgcaggcga tacgggcaga cttgagtact

661  gcaggggaga ctggaattcc tggtgtagcg gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc

721  ggtggcgaag gcgggtctct gggcagtaac tgacgctgag gaacgaaagc gtgggtagcg

781  aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacggt gggcgctagg tgtgggttcc

841  ttccacggaa tccgtgccgt agctaacgca ttaagcgccc cgcctgggga gtacggccgc

901  aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca tgtggattaa

961  ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg tttgacatat accggaaagc tgcagagatg

1021 tggcccccct tgtggtcggt atacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag

1081 atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccctatctt atgttgccag cacgttatgg

1141 tggggactcg taagagactg ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggacg acgtcaagtc

1201 atcatgcccc ttatgtccag ggcttcacac atgctacaat ggccagtaca gagggctgcg

1261 agaccgtgag gtggagcgaa tcccttaaag ctggtctcag ttcggatcgg ggtctgcaac

1321 tcgaccccgt gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca gcaacgctgc ggtgaatacg

1381 ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac gtcatgaaag tcggtaacac ccgaagccgg

1441 tggcttaacc ccttgtggga gggagccgtc gaaggtggga tcggcgattg ggacgaagtc

1501 gtaacaaggt aaccgaatcg tccacttgcc gtcatgctct tggc