海姆泊芬的异构体

摘要

本发明属于光动力治疗领域，尤其涉及光动力治疗的光敏剂。本发明提供了两种海姆泊芬的IX位单一异构体：8-(1-甲氧基乙基)-3-(1-羟乙基)次卟啉IX和3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羟乙基)次卟啉IX，该异构体是采取反相纯化方法分离获得的。动物试验表明，两种异构体作为光敏剂封闭新生血管同样有效。本发明提供的单一异构体，可用于制备分子结构单一，性质更稳定的药物。

说明书

本发明是申请号为CN200610030185.6的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及光动力治疗领域，更具体的，本发明涉及一种光动力治疗的光 敏剂。

背景技术

光动力治疗(PDT)是给患者施以光活性化合物，光敏剂在新生血管部位 富集，再以低强度激光照射，激发光敏剂使之产生光化学反应，在发生光化学 反应的部位产生自由基，可杀伤该部位的组织细胞，主要通过直接细胞毒作用 及其封闭病灶部位血管产生治疗效果。

用于光动力治疗的光敏剂有血卟啉衍生物(HPD)、苯并卟啉衍生物(BPD)、 二氢卟吩e6单天冬氨酸酰胺(Npe6)、磺酸铝酞菁(CASPc)、中介四(间羟基苯 基)-二氢卟吩(mTHPC)、锡乙基初紫红素(SnEt2)、5-氨基乙酰丙酸(ALA)等， 用于肿瘤、皮肤病的光动力治疗。

3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羟乙基)次卟啉IX是一种有效的新 型光动力治疗药物，对某些癌症和鲜红斑痣有良好的治疗作用(许德余、陈文 晖、沈念慈：光动力治癌新药3-或8-3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1- 羟乙基)次卟啉IX，中国激光医学杂志，1993，2：1；顾瑛、刘凡光、王开等， 血啉甲醚用于光动力疗法治疗鲜红斑痣的临床研究，中国激光医学杂志2000， 9(3)：185)。

目前用于光动力治疗的光敏剂，大部分是复杂的混合物，组成不确定，结 构尚有争议，影响了药物制备、治疗效果的稳定性。目前使用的光动力治疗药 物3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羟乙基)次卟啉IX(海姆泊芬)作为单 一的化合物，具有明确的化学结构，但仍然包含2种位置异构体，其具有的缺 点是性质不够稳定，从而影响到效果的可靠性。为了获得分子结构单一，性质 更稳定的药物，有必要进一步分离2种位置异构体，用于更有效地对患者进行 光动力治疗。

对海姆泊芬位置异构体的拆分仍然是现有技术中的难点，需要综合考虑所 应采取的拆分方法、拆分条件(包括pH值、温度、时间等)、拆分试剂等大量 因素。目前现有技术中至今还没有获得分离的、分子结构单一且性质更稳定的 该类药物。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种海姆泊芬的异构体8-(1-甲氧基乙基)- 3-(1-羟乙基)次卟啉IX(海姆泊芬异构体A)，其具有式(I)所示的结构，该 异构体是采用包括如下步骤的方法从3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羟乙基)次卟啉 IX和8-(1-甲氧基乙基)-3-(1-羟乙基)次卟啉IX混合物中分离出来的：

(1)将3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羟乙基)次卟啉IX和8-(1-甲氧基乙基) -3-(1-羟乙基)次卟啉IX混合物上载到反相硅胶柱；

(2)用含有缓冲液的甲醇溶液，pH4～5作为流动相洗脱；

(3)在395nm处检测，收集流出峰；

(4)其中，所述的反相硅胶选自：C8硅胶。

本发明的另一目的是提供一种海姆泊芬的异构体3-(1-甲氧基乙基)- 8-(1-羟乙基)次卟啉IX(海姆泊芬异构体B)，其具有式(II)所示的结构，该 异构体是采用包括如下步骤的方法从3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羟乙基)次卟啉 IX和8-(1-甲氧基乙基)-3-(1-羟乙基)次卟啉IX混合物中分离出来的：

(1)将3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羟乙基)次卟啉IX和8-(1-甲氧基乙基) -3-(1-羟乙基)次卟啉IX混合物上载到反相硅胶柱；

(2)用含有缓冲液的甲醇溶液，pH4～5作为流动相洗脱；

(3)在395nm处检测，收集流出峰；

其中，所述的反相硅胶选自：C8硅胶。

所说的反相硅胶粒径为10～150μm，优选粒径30～70μm；反相硅胶的孔 径60～200A，优选孔径60A。

其中缓冲溶液为1.5M乙酸--乙酸铵缓冲液，甲醇与乙酸--乙酸铵缓冲液 的体积比为65∶35，pH 4.76。

分离系统采用Flash150M，内置预装C₈层析柱150mm ID×30cm，由Biotage 公司生产，硅胶粒径为35～70μm，孔径为60A；

样品准备：取3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羟乙基)次卟啉IX纯 品30克，用四氢呋喃溶解过滤，加入C8反相硅胶100克，减压浓缩，蒸干， 加入上样柱SIM中，以备上样；

上样及收集：以pH 4.76甲醇-1.5M乙酸--乙酸胺缓冲液为流动相，将上 述样品通过上样柱SIM，带入层析柱中加以分离，流速控制在200ml/min，检 测器波长395nm，收集海姆泊芬异构体A流分8-(1-甲氧基乙基)-3-(1-羟乙基) 次卟啉IX和海姆泊芬异构体B流分3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羟乙基)次卟啉 IX。

附图说明

图1为3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羟乙基)次卟啉IX的HPLC 图谱。

图2A为纯化后3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羟乙基)次卟啉IX纯品HPLC图 谱。

图2B为纯化后8-(1-甲氧基乙基)-3-(1-羟乙基)次卟啉IX纯品HPLC图谱。

图3A为给药后5分钟肝组织两种异构体含量。

图3B为给药后30分钟肝组织两种异构体含量。

图3C为给药后8小时肝组织两种异构体含量。

具体实施方式

本发明人经过大量工作，首次从3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1- 羟乙基)次卟啉IX中分离出2种位置异构体，获得了分子结构单一，性质更稳 定的药物。

并且，本发明人发现，海姆泊芬的异构体A代谢较快，肝脏蓄积少，单独 应用比混合体具有更低的肝毒性，可减少该类不良反应；而海姆泊芬的异构体 B在肝脏浓度更高，停留时间长，更有利于以肝脏为靶向的光动力治疗作用， 如肝癌的光动力治疗。

光活性化合物

两种异构体的化学结构确证采用一维NOE差谱(1D-NOEDIFF)技术，结果 如下：

异构体A：氢谱的化学位移大致可分为三个部分：δ10-11ppm为芳香质 子信号；δ2-7ppm为脂肪族质子信号；δ-3.98ppm为环内NH质子信号，这 是由于受芳香环流正屏蔽的影响而出现在异常的高场。在前述海姆泊芬核磁共 振分析测试报告的基础上，对异构体A进行谱线归属：δ10.78(H-5)；δ 10.54(H-10)；δ10.28(H-15)；δ10.23(H-20)；δ6.54(CHOH)；δ 6.15(CH-OCH₃)；δ4.35(C₂₅H₂，C₂₇H₂)；δ3.73(C₂-CH₃)；δ3.69(C₇-CH₃)；δ 3.64(C₁₂-CH₃)；δ3.62(C₁₈-CH₃)；δ3.56(OCH₃)；δ3.22(C₂₆H₂，C₂₈H₂)；δ 2.16(CHCH₃)；δ-3，98(NH)。

异构体A一维NOE差谱的实验结果：辐照δ10.78，则δ6.54、δ3.69、 δ2.16产生NOE增益；辐照δ10.54，则δ6.15、δ3.64、δ3.56、δ2.16产 生NOE增益；辐照δ10.28，则δ4.35、δ3.22产生NOE增益；辐照δ10.23， 则δ3.73、δ3.62产生NOE增益.这些数据证明异构体A取代基CHOHCH₃连在 C-8位上，CH-(OCH₃)CH₃连在C-3位上。分别辐照δ6.65、δ6.15、δ4.35、δ 3.56、δ3.22及δ2.16，亦得到如上的实验结果。

可以确定所说的异构体A是8-(1-甲氧基乙基)-3-(1-羟乙基)次卟啉IX， 为分子结构为下式：

海姆泊芬异构体A

异构体B：氢谱的化学位移大致可分为三个部分：δ10-11ppm为芳香质 子信号；δ2-7ppm为脂肪族质子信号；δ-3.98ppm为环内NH质子信号，这 是由于受芳香环流正屏蔽的影响而出现在异常的高场。在前述海姆泊芬核磁共 振分析测试报告的基础上，异构体B的谱线归属：δ10.70(H-5)；δ 10.57(H-10)；δ10.28(H-15)；δ10.25(H-20)；δ6.13(CHOH)；

δ6.55(CH-OCH₃)；δ4.35(C₂₅H、C₂₇H₂)；δ3.58-3.75(C₇-CH₃、C₂-CH₃、 C₁₈-CH₃)；δ3.56、3.53(C₁₂-CH₃)；δ3.38(OCH₃)；δ3.21(C₂₆H₂、C₂₈H₂)；δ 2.16(CHCH₃)；δ-3.95(NH)。

异构体B一维差谱的实验结果：辐照δ10.70，则δ6.55、δ3.64、δ3.62、 δ3.38产生NOE增益；辐照δ10.57，则δ6.13、δ3.71、δ3.68产生NOE增 益；辐照δ10.28和δ10.25，则δ4.35、δ3.71、δ3.68、δ3.64、δ3.62 产生NOE增益；辐照δ6.55，则δ10.7、δ3.71、δ3.68、δ3.38、δ2.16产 生NOE增益；辐照δ6.13，则δ10.57、δ3.71、δ3.68、δ3.56、δ3.53产 生NOE增益。分别辐照δ4.35、δ3.69、δ3.60、δ3.53、δ3.21及δ2.16， 亦得到如上的实验结果。

可以确定所说的异构体B是3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羟乙基)次卟啉IX， 分子结构为下式：

海姆泊芬异构体B

治疗机理

本发明涉及用光动力治疗因有害的新生血管形成而导致的疾病，光动力学 治疗方案使得有害的新血管形成缩减。

在本发明的方法中，给需要治疗的患者服用适合的光活性化合物，其量足 以使患者病灶内的光活性化合物达到有效浓度。服用后经过一段时间，使有效 浓度的化合物聚集在病灶后，用被该光活性化合物吸收的光照射该区域。光活 性化合物被光激发，产生活性氧和自由基，引起病变区域细胞光化学损伤，封 闭病变部位的新生血管，从而治疗因有害血管形成而导致的各种疾病。

给药和剂量

光活性化合物可以各种途径给药，如口服、非肠道给药或直肠给药，以非 肠道给药为宜，如静脉内、肌肉内或皮下注射。以静脉注射为最好。

光活性化合物的剂量可以根据给药方式、制剂类型、是否偶联靶向配体而 有很大的变化。一般认为，在光活性剂的制剂、给药方式和剂量水平之间有关 联。通常，3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羟乙基)次卟啉IX或8-(1-甲氧基乙基) -3-(1-羟乙基)次卟啉IX的典型剂量范围为0.1-100mg/kg，较佳的剂量范围 为0.5-50mg/kg，更佳的剂量范围为1-10mg/kg。本领域技术人员也可以通过 实验确定合适的剂量。

在本发明中用于有效、选择性光动力学治疗的各种参数是相互关联的。因 此，可以相对于其他参数(例如光动力学治疗中所使用的光通量、光照度、持 续时间和剂量、给药与光照射之间的时间间隔等)而调整剂量。使用这些参数 都应调整到能显著提高视力而不产生正常眼组织的明显损害为宜。本领域技术 人员能够通过实验确定合适的参数。

换言之，当光活性化合物的剂量降低时，封闭脉络膜新生血管组织的光通 量有增加的趋势；反之需要降低光通量，则需要增加光活性化合物的剂量或增 加靶向性促进增加病变部位光活性化合物的富集程度。

光治疗方法

光治疗参数有关的某些术语在不同的作者和出版物中有所不同。比如光通 量，也称光剂量、光能量密度；光照度，也称功率强度、功率密度。这些术语 是本领域的技术人员使用并理解的，在此加以说明。

在光活性化合物给药后，将眼的靶组织在被选择的药物吸收波长下进行照 射。对于血卟啉单甲醚，所选的波长范围一般在630±20nm左右，更佳地为在 630±10nm左右，该范围波长在机体组织内的穿透力比较好。

照射的结果导致光活性化合物处于激发状态，并与其他化合物相互作用， 形成单线态氧(Singlet Oxygen)和其他自由基，引起血管上皮细胞结构破坏。 单线态氧和其他自由基主要损伤细胞膜结构，包括细胞膜、线粒体膜、溶酶体 膜和核膜。血管上皮细胞损伤引发后续的血小板凝聚、脱颗粒和血栓形成，造 成血管的堵塞和封闭。

根据组织的类型、靶组织深度和其上流体或血液的量，照射的光通量可有 很大变动。但较佳的为50-200焦耳/cm²。

光照度一般变化于50-800mW/cm²，以约100-600mW/cm²为佳。然而，选 择使用较高的光照度，可以缩短治疗时间而达到同样的效果。

光活性化合物给药后至光治疗之间的最适时间间隔也根据给药方式、给药 形式和制剂类型而不同。光敏剂给药后的时间间隔从1分钟到2小时，较佳的 为5-30分钟，更佳的为10-25分钟。

可治疗的疾病

本发明提供的3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羟乙基)次卟啉IX或8-(1-甲氧 基乙基)-3-(1-羟乙基)次卟啉IX，用于制备治疗因有害的新生血管形成而导 致的疾病的药物，该药物作为光动力治疗因有害的新生血管形成而导致的疾病 的光敏剂。

因有害的新生血管形成而导致的疾病包括：皮肤疾病，如鲜红斑痣；也包 括眼科疾病，如黄斑变性。

治疗的评价

光动力治疗的效果在动物模型上可用组织学切片观察内皮细胞的损伤和 病灶部位新生血管的封闭情况。典型的，新生血管的破坏表现为血管内皮细胞 胞浆内出现空泡，细胞核皱缩异常，血管腔内可见血小板聚集和血凝块的形成。

位于皮肤的血管封闭可以直接观察效果；位于组织深层的血管封闭，例如 眼部脉络膜，可用血管造影技术观察新血管减少。

不同异构体的分布

肝脏是海姆泊芬主要的分布器官，大部分药物经肝脏从胆汁中排出体外。 同时，卟啉类药物主要的不良反应是可能引起肝功能异常，可表现为转氨酶升 高。本发明人发现，海姆泊芬的异构体A代谢较快，肝脏蓄积少，单独应用比 混合体具有更低的肝毒性，可减少该类不良反应。

同时，海姆泊芬的异构体B在肝脏浓度更高，停留时间长，提示更有利于 以肝脏为靶向的光动力治疗作用，如肝癌的光动力治疗。

因此，在具体实施治疗时，可根据患者的状况来选择使用海姆泊芬的异构 体A或异构体B，以达到最佳的治疗效果。

本发明的主要优点在于：

(1)首次提供了一种分离3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羟乙基) 次卟啉IX(海姆泊芬)位置异构体的方法，该方法即可方便的获得分子结构单 一，性质更稳定的海姆泊芬药物。

(2)首次发现海姆泊芬的异构体A代谢较快，肝脏积蓄少，单独应用比 混合体具有更低的肝毒性；而海姆泊芬的异构体B在肝脏浓度更高，停留时间 长，提示更有利于以肝脏为靶向的光动力治疗作用。从而在具体实施治疗时， 可根据患者的状况来选择使用海姆泊芬的异构体A或异构体B。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：海姆泊芬的制备

1.3(8)-(1-甲氧基乙基)-8(3)-(1-羟乙基)次卟啉IX粗品的制备

在50L耐酸搪玻璃反应锅中加入体积比为3∶1的甲醇/水混合液30L，搅拌 下由液体滴加器缓缓滴入，按中国专利01105208.2说明书实施例1记载的方 法制备得到的3，8-二-(1-溴乙基)-次卟啉IX氢溴酸盐冰醋酸饱和溶液10L，控 制滴加速度使反应混合物温度保持在10～20℃。滴加完毕，反应液继续搅拌 2h，放置4h。然后于搅拌下滴加10N NaOH水溶液至反应液呈强碱性(PH13左 右)，放置10h以上，加醋酸中和至PH4～5，加5倍体积的水稀释，放置过夜， 沉淀物自然沉淀，倾去上清液后，吸滤收集沉淀，用水充分洗涤，抽干，置真 空干燥器中用P₂O₅真空干燥。得深褐色的含3(8)-(1-甲氧基乙基)-8(3)-(1-羟 乙基)次卟啉IX(53.3％HPLC)、3，8-二-(1-甲氧基乙基)-次卟啉IX(19.5％HPLC) 和3，8-二-(1-羟乙基)-次卟啉IX(27.1％HPLC)的粗品160克，收率80％。

2.3(8)-(1-甲氧基乙基)-8(3)-(1-羟乙基)次卟啉IX的色谱分离纯化

取60×600mm玻璃层析柱10根，分别加入200g经活化的硅胶，仔细敲实。 取上一步制备的3(8)-(1-甲氧基乙基)-8(3)-(1-羟乙基)次卟啉IX粗品6g与 30g硅胶H研匀后加于硅胶柱上层，并在其上另加硅胶H 20g，同前敲实。加 展开剂(甲醇-氯仿-甲酸(10∶1∶0.1))进行层析分离，分段收集流分，先以薄 层层析检测，当TLC检测显示所需组分为单一斑点时，即进行HPLC检测，合 并HPLC分析保留时间3.43min的相对峰面积≥95％的流分，水洗，有机相减压 蒸干，即得，3(8)-(1-甲氧基乙基)-8(3)-(1-羟乙基)次卟啉IX(海姆泊芬)纯 品约10g(收率16.7％)。

实施例2：海姆泊芬位置异构体的HPLC分离

仪器：Agilent 1100型高效液相色谱仪；DAD检测器，检测波长：395nm

流动相：甲醇-1.5M乙酸--乙酸胺缓冲液(pH 4.76)(65∶35V/V)

色谱柱：MOS-Hypersil(C₈)，10×250mm

流速：2mL/min

柱压：125Bar

取上述实施例1制备的海姆泊芬样品100毫克，以HPLC流动相溶解，配 制成5mg/mL浓度的样品溶液，进样前过滤。每次进样上述溶液400微升，进 样后，根据HPLC色谱图(见图1)分别收集流分A，保留时间为11.94分和流 分B保留时间为14.35分。累计40次，共收集流分A 136ml，流分B 133ml。 收集液倒入乙酸乙酯(或乙醚)--蒸馏水二相溶液中，振摇，分取有机相，以蒸 馏水洗涤有机相3次，有机相于40℃下减压蒸除溶剂至干，置真空干燥器中， 以五氧化二磷真空干燥过夜。

结果，分别得海姆泊芬位置异构体A36.2毫克，异构体B 35.0毫克。

纯化后3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羟乙基)次卟啉IX(海姆泊芬异构体B)纯 品的HPLC图谱见图2A。

纯化后8-(1-甲氧基乙基)-3-(1-羟乙基)次卟啉IX(海姆泊芬异构体A)纯 品的HPLC图谱图2B。

实施例3：海姆泊芬位置异构体的制备级分离

分离系统采用Flash150M，内置预装C₈层析柱(150mm ID×30cm)，由 Biotage公司(美国)生产，硅胶粒径为35～70μm，孔径为60A。

样品准备：取实施例1制备的3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羟乙 基)次卟啉IX纯品(含量＞95％)30克，用四氢呋喃溶解过滤，加入C8反相硅胶 100克，减压浓缩，蒸干，加入上样柱SIM中，以备上样。

上样及收集：以甲醇-1.5M乙酸--乙酸胺缓冲液(pH 4.76)(65∶35V/V) 为流动相，将上述样品通过上样柱SIM，带入层析柱中加以分离，流速控制在 200ml/min，检测器波长395nm，收集海姆泊芬异构体-A流分[8-(1-甲氧基乙 基)-3-(1-羟乙基)次卟啉IX]和海姆泊芬异构体-B流分[3-(1-甲氧基乙 基)-8-(1-羟乙基)次卟啉IX]。

后处理：流分收集液用乙酸乙酯萃取，再将有机相减压浓缩、蒸干，减压 干燥，即得样品，海姆泊芬位置异构体A  11.8克，异构体B 11.3克。

实施例4：海姆泊芬异构体A和异构体B的结构确证(核磁共振谱)

1.仪器与方法

仪器：Varian UNITY Inova 600核磁共振仪

溶剂：DMSO-d6

内标：TMS

2.解析

海姆泊芬异构体A和异构体B从化学结构上看，仅是C-3和C-8位上二个 取代基互换的差异所致。本项研究采用一维NOE差谱技术(1D-NOEDIFF)对这两 个异构体进行结构鉴定。

2.1.氢谱的化学位移大致可分为三个部分：δ10-11ppm为芳香质子信号； δ2-7ppm为脂肪族质子信号；δ-3.98ppm为环内NH质子信号，这是由于受 芳香环流正屏蔽的影响而出现在异常的高场。

2.2.异构体A的结构论证

在海姆泊芬核磁共振分析测试报告的基础上，对异构体A进行谱线归属： δ10.78(H-5)；δ10.54(H-10)；δ10.28(H-15)；δ10.23(H-20)；δ 6.54(CHOH)；δ6.15(CH-OCH₃)；δ4.35(C₂₅H₂，C₂₇H₂)；δ3.73(C₂-CH₃)；δ 3.69(C₇-CH₃)；δ3.64(C₁₂-CH₃)；δ3.62(C₁₈-CH₃)；δ3.56(OCH₃)；δ3.22(C₂₆H₂， C₂₈H₂)；δ2.16(CHCH₃)；δ-3，98(NH)。

2.3.异构体A的一维NOE差谱

辐照δ10.78，则δ6.54、δ3.69、δ2.16产生NOE增益；辐照δ10.54， 则δ6.15、δ3.64、δ3.56、δ2.16产生NOE增益；辐照δ10.28，则δ 4.35、δ3.22产生NOE增益；辐照δ10.23，则δ3.73、δ3.62产生NOE增 益。这些数据证明异构体A取代基CH-(OCH₃)CH₃连在C-8位上，CHOHCH₃连在 C-3位上。分别辐照δ6.65、δ6.15、δ4.35、δ3.56、δ3.22及δ2.16，亦 得到如上的实验结果。

2.4.异构体B的谱线归属

δ10.70(H-5)；δ10.57(H-10)；δ10.28(H-15)；δ10.25(H-20)；δ 6.13(CHOH)；δ6.55(CH-OCH₃)；δ4.35(C₂₅H、C₂₇H₂)；δ3.58-3.75(C₇-CH₃、 C₂-CH₃、C₁₈-CH₃)；δ3.56、3.53(C₁₂-CH₃)；δ3.38(OCH₃)；δ3.21(C₂₆H₂、C₂₈H₂)； δ2.16(CHCH₃)；δ-3.95(NH)。

2.5.异构体B一维NOE差谱

辐照δ10.70，则δ6.55、δ3.64、δ3.62、δ3.38产生NOE增益；辐照 δ10.57，则δ6.13、δ3.71、δ3.68产生NOE增益；辐照δ10.28和δ10.25， 则δ4.35、δ3.71、δ3.68、δ3.64、δ3.62产生NOE增益；辐照δ6.55，则 δ10.7、δ3.71、δ3.68、δ3.38、δ2.16产生NOE增益；辐照δ6.13，则δ 10.57、δ3.71、δ3.68、δ3.56、δ3.53产生NOE增益。这些NOE数据证明 异构体B取代基CHOHCH₃连在C-8位上，CH-(OCH₃)CH₃连在C-3位上。分别辐 照δ4.35、δ3.69、δ3.60、δ3.53、δ3.21及δ2.16，亦得到如上的实验 结果。

3.结论

3.1.海姆泊芬异构体A的化学结构式鉴定为下式，即，3-(1-羟基乙 基)-8-(1-甲氧基乙基)-次卟啉IX。

3.2.海姆泊芬异构体B的化学结构式鉴定为下式，即，3-(1-甲氧基乙 基)-8-(1-羟基乙基)-次卟啉IX。

实施例5：海姆泊芬及其位置异构体对血管内皮细胞的光动力杀伤试验

取生长状态良好的鼠肺血管内皮细胞(RPMVEC，简称EC，按下述文献方法 制备：Chen SF，Fei X，Li SH.A new simple method for isolation of  microvascular endothelial cells avoiding both chemical and mechanical  injuries.Microvas Res，1995，50：119)，用0.3％胰酶消化后，吹打成单细胞 悬液，用含5％血清的DMEM培养液将细胞密度调整为5.0×10⁴个/ml，并将之接 种于96孔细胞培养板上，每孔加入200μl，置于孵箱中孵育18h后，吸出各 孔中的培养液。将上述实施例1、实施例2制备的海姆泊芬、异构体A、异构 体B，三种光敏剂用不含血清的DMEM培养液配制成浓度分别为0.75μg/ml、 0.625μg/ml、0.5μg/ml、0.375μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.05μ g/ml的溶液，在避光条件下，每孔加入200μl，每个浓度点6孔，孵育时间 为4h。利用铜蒸气激光进行照射，功率密度为20mw/cm²，时间为1000秒，能 量密度为20J/cm²。其后置于孵箱中孵育24h，再在每孔中加入20μl的MTT(用 PBS溶液配制成5mg/ml)，于孵箱孵育4h后，小心的吸出培养液及MTT，每孔 加入150μl的DMSO，置于孵箱中孵育12h后，于酶标仪测定前振荡5分钟， 设定酶标仪的参数，选择595nm作为测量波长，655nm作为参考波长，测定各 孔的光密度(OD)值，打印结果，求其平均值。实验重复三次。

测得各孔的光密度值后，求其细胞存活率，公式如下：

细胞存活率(％)＝(实验组OD-本底组OD)/(完全空白组OD-本底组OD)× 100％

统计学处理采用Stata 6.0软件(美国Computer Resource Center研制)， 取三次实验的各浓度点细胞存活率的平均值作曲线拟合，从而计算出其IC₅₀。

实验证明这三种光敏剂对EC均无暗毒性。铜蒸汽激光照射下，海姆泊芬 异构体-A、海姆泊芬异构体-B与海姆泊芬对EC的半数致死量(IC₅₀)分别为 0.368μg/ml、0.412μg/ml、0.493μg/ml。海姆泊芬的两种异构体与海姆泊 芬所介导的对内皮细胞的光动力杀伤作用强度相似。

实施例6：两种异构体在肝脏的分布

取大鼠18只，体重210.0±4.8g，随机分成3组，每组6只，雌雄各 半。禁食但可自由饮水10小时后，静脉注射(iv)10mg/kg海姆泊芬，分别于 给药后5、30和480min，由股动脉放血处死动物。取血浆0.5ml，并立即分取 肝组织。称取组织约0.3g(精密称重)，加1.0ml三蒸水制成匀浆后，用3ml 乙腈沉淀蛋白(其中肝组织匀浆提取后，经稀释后进样)，于2500rpm离心5min， 取上清液0.5ml，于15000rpm离心10min，两次高速离心后，取160μl上清液于 自动进样瓶中，20μl进样。用HPLC法测定组织中两种异构体浓度。

大鼠给药后5、30和480min后肝组织样品的HPLC图谱分别如图3A、图3B 和图3C所示。由图可以看出，给药后肝组织中异构体B的含量高于异构体A， 给药8小时后肝组织中只检测到异构体B。因此两异构体在肝脏的分布有差异， 异构体B在肝脏分布量更高，因而对于治疗肝癌效果更佳。

实施例7：海姆泊芬及其位置异构体对鸡冠皮肤的光动力损伤试验

选取体重0.8～1.2kg、周龄12～16周的雄性莱亨鸡共30只，随机分为3 组。每组动物首先肌注麻保静(0.10～0.12mg/kg)麻醉，在避光条件下将浓度 为10mg/ml的海姆泊芬、异构体A、异构体B光敏剂按20mg/kg的剂量推注入 莱亨鸡静脉。固定鸡冠后，标记照光区，每只鸡冠设定4个照射区，每个照射 区直径为1cm。选择铜蒸气激光输出混合光由光纤输出垂直进行照射，功率密 度为100mw/cm²，照射时间为20分钟，不照光处适当遮盖。照光前后均使用功 率计检测输出功率，保证其波动范围在±5％之间。对照组及各实验组均在照光 后3天和14天时先行肉眼观察、记录处理部位鸡冠的颜色和表面情况，然后 剪下鸡冠照光区的组织立即置于10％甲醛液中固定，常规脱水、石蜡包埋切片、 HE染色，光镜下观察、记录其病理改变。

根据光动力作用后鸡冠皮肤形态学改变的划分标准，将鸡冠皮肤靶组织和 非靶组织对光动力的反应分成轻(L，light reaction)、中(M，middle  reaction)、重(S，sever reaction)三度。采用X²检验进行组间比较，设定P ＜0.05为差异显著。统计学处理采用Stata软件。

三种光敏剂对鸡冠皮肤靶组织和非靶组织光敏损伤大体改变的比较实验 结果见下表：

三种光敏剂对鸡冠皮肤光敏损伤大体改变特点的比较见表1。

表1

三组光敏剂的病理组织切片的光镜下观察的结果示：乳头层毛细血管网减 少，管腔小，可见新生毛细血管，表皮层和真皮深层无改变，网状层血管扩张， 对靶组织都能产生有效的损伤破坏作用，且都具有较为明确的选择性作用。

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