3,8-双-(5-甲基-2-噻吩基)-1,10-菲罗啉及其制法和在锌离子荧光传感与细胞成像中的应用

摘要

一种1,10-菲罗啉衍生物，它是3,8-双-（5-甲基-2-噻吩基）-1,10-菲罗啉(PHT1)，具有如下结构式：

说明书

技术领域

本发明涉及1,10-菲罗啉3,8位扩展双-5-甲基噻吩化合物及其在高灵敏锌离子荧光传感与细胞成像等方面的应用。

 

背景技术

一些重要的阳离子，特别是重金属离子，如Hg²⁺离子，在自然界可转化为具有神经毒性的甲基汞，通过生物积累造成环境污染和对人畜细胞代谢和神经组织的破坏。再如Cd²⁺离子，也具有很强的毒性，能够伤害肺，肾脏，脾脏等器官组织；Pb²⁺离子可导致贫血、肌肉麻痹和智力缺陷；Cu²⁺离子既可以参与很多生物体内重要的基本生理过程，同时过量的Cu²⁺离子的存在又会对生物体产生毒性；Zn²⁺离子既可以参与许多重要的细胞活动，如神经传递、信号传导和基因表达等，但过多的锌离子又会造成农业和食品的污染。所以，对这些离子的重金属的检测显得格外重要。

传统的检测方法，如滴定，原子吸收光谱(AAS)，气相或液相色谱等方法，不仅耗时耗力，而且难以做到实时检测乃至于活体检测。因而人们迫切地需要发展出更加简便、准确且能运用于实时、体内和体外的检测方法。为了更方便地监测样品中各种离子浓度，更好地研究这些离子的生理作用，科学家转而开发新型的化学传感器，特别是光化学离子传感器，如紫外-可见光吸收和荧光传感器。这些新型的传感器的显著优点是：灵敏，选择性高，实时，快速响应，成本低，检测限低，无毒无害，甚至可以进行活体内的检测。2000年以后，这方面的研究逐渐成为一个热点，越来越多的金属离子传感器被陆续发明出来，性质越来越好，并逐步向实用化迈进。

在已有的研究与报道中，很大一部分金属离子传感器都是基于有机小分子配体的体系。通过改造原有的一些染料分子或者构建全新的分子骨架，科学家通过在溶液中这些分子对特定金属离子的选择性配位识别，产生明显的光谱变化，继而转化为光信号或电信号，实现化学传感器的作用。一些典型的金属离子传感器如下所示：

1,10-菲罗啉具有大的共轭平面以及强的螯合能力，常被用做双齿螯合配体和金属离子作用形成配合物，受到广泛研究。然而，把1,10-菲罗啉衍生物应用到过渡金属离子传感，并且用于活体细胞成像的案例目前研究的很少，而且多为1:1的金属配合物，具体参见下面两篇相关文献：Y. Li, L. Shi, L. Qin and Y. Long, Chem. Commun. 2011, 47, 4361-4361.和H. Chen, W. Gao, M. Zhu and Y. Li, Chem. Commun. 2010, 46, 8389-8391.

发明内容

本发明人在已有工作基础上（(a) B. Hu, S. Fu, F. Xu, T. Tao, H. Zhu, K. Cao, W. Huang and X. You, J. Org. Chem. 2011, 76, 4444-4456; (b) K. Araki, H. Endo, G. Masuda and T. Ogawa, Chem. Eur. J. 2004, 10, 3331-3340; (c) W. Huang, H. Tanaka and T. Ogawa, J. Phys. Chem. C 2008, 112, 11513-11526; (d) W. Huang, L. Wang, H. Tanaka and T. Ogawa, Eur. J. Inorg. Chem. 2009, 1321-1330.），设计并合成了一种以1,10-菲罗啉衍生物为基的锌离子荧光传感器，具体技术方案如下：

一种1,10-菲罗啉衍生物，它是3,8-双-（5-甲基-2-噻吩基）-1,10-菲罗啉(PHT1)，具有如下结构式：

。

 

一种制备上述3,8-双-（5-甲基-2-噻吩基）-1,10-菲罗啉的方法，它包括以下步骤：

步骤1. 向100 mL干燥的三颈瓶中加入 0.71 g (29.21 mmol)活化的镁屑、5 mL无水四氢呋喃和催化量的碘，在室温和氩气保护的条件不断的搅拌；将1.7 mL(15.10 mmol)2-溴-5-甲基噻吩溶于5 mL无水四氢呋喃中配成溶液，然后缓慢滴入约10%的2-溴-5-甲基噻吩溶液到上述三颈瓶中，等反应引发后继续滴入剩余的溶液，并保持反应体系处于微沸，滴完后，加热回流30 min；

步骤2. 将步骤1的反应液冷却至室温，倒入50 mL的滴液漏斗中，然后将其缓慢滴入装有2.01 g (5.95 mmol) 3,8-二溴-1,10-菲罗啉、0.09 g(0.17 mmol) Ni(dppp)Cl₂ 和 50 mL干燥四氢呋喃的三颈瓶中，滴完后在室温下搅拌2 h，然后加热回流12 h，冷却至室温，加入大量的饱和NH₄Cl溶液淬灭，用CHCl₃萃取，有机层用饱和食盐水充分洗涤之后用硅胶柱分离（洗脱剂，氯仿：石油醚 = 1:1），旋干溶剂后得到亮黄色的产品3,8-双-（5-甲基-2-噻吩基）-1,10-菲罗啉。

 

PHT1为一新化合物，在乙醇-水混合溶液中，PHT1能选择性螯合游离锌离子，形成化学计量比2：1的锌离子配合物([Zn(PHT1)₂]²⁺)，配合物稳定常数高达3.4 × 10¹² M^-1，且在蓝光区域（455 ～ 490 nm）产生51倍的荧光增强。这种荧光增强既不受碱金属离子（如Na⁺, K⁺），碱土金属离子（如Ca²⁺, Mg²⁺）以及大部分过渡金属离子（如Hg²⁺, Pb²⁺, Ag⁺）等影响，也不受pH影响，表明PHT1具有高的选择性以及pH稳定性。PHT1对游离锌离子的检测限可以达到5 ppb，远低于世界卫生组织饮用水中的锌含量(3 mg/L)。HL-60细胞、HepG-2细胞的成像实验表明PHT1具有良好的细胞渗透性以及低的细胞毒性，而且能够标记细胞器中痕量的锌离子。上述结果表明PHT1是一种具有高选择性以及高灵敏度的锌离子传感器。

 

附图说明

    图1为化合物PHT1的¹H NMR (a), ¹³C NMR (b)核磁共振波谱和正离子电喷雾质谱(c)图。

图2为PHT1·C₂H₅OH化合物的X-射线衍射分析的晶体结构图。

图3为PHT1螯合游离锌离子，形成化学计量比2:1的锌离子配合物([Zn(PHT1)₂]²⁺)示意图及荧光增强照片。

图4为四个1,10-菲罗啉类化合物（10 μM）与1当量Zn²⁺化合物的荧光激发(a)与发射(b)谱图，其中Phen为1,10-菲罗啉，PHT0为3,8-双-（2-噻吩基）-1,10-菲罗啉，PHT2为3,8-双-（3-甲基-2-噻吩基）1,10-菲罗啉。

图5为PHT1（10 μM）溶液[CH₃CH₂OH/H₂O (9:1, v/v)]中连续滴加Zn²⁺离子的荧光发射谱图。

图6为Zn²⁺ 对于其它金属离子的竞争性实验谱图（Mix1 = Na⁺, K⁺, Li⁺; Mix2 = Mg²⁺, Ca²⁺. Red bars: 10 μM PHT1 + 10 μM metal ions of interest; Dark bars: 10 μM PHT1 + 10 μM metal ions of interest + 10 μM Zn²⁺, λ_ex = 405 nm）。

图7为HL-60细胞中不加（左边）入和加入（右边）50 μM Zn²⁺离子溶液在37 ℃下共同孵育30分钟的激光共聚焦扫描显微镜照片比较。

具体实施方式

实施例1. 3,8-双-（5-甲基-2-噻吩基）-1,10-菲罗啉的合成

向100 mL干燥的三颈瓶中加入 0.71 g (29.21 mmol)活化的镁屑、5 mL无水四氢呋喃和催化量的碘，在室温和氩气保护的条件不断的搅拌。将1.7 mL(15.10 mmol)2-溴-5-甲基噻吩溶于5 mL无水四氢呋喃中配成溶液，然后缓慢滴入约10% 溶液到上述三颈瓶中，等反应引发后继续滴入剩余的溶液，并保持反应体系处于微沸。滴完后，加热回流30 min。将反应液冷却至室温，倒入50 mL的滴液漏斗中，然后缓慢滴入装有2.01 g (5.95 mmol) 3,8-二溴-1,10-菲罗啉、0.09 g(0.17 mmol) Ni(dppp)Cl₂ 和 50 mL干燥四氢呋喃的三颈瓶中，滴完后在室温下搅拌2 h，然后加热回流12 h，冷却至室温，加入大量的饱和NH₄Cl溶液淬灭，用CHCl₃萃取，有机层用饱和食盐水充分洗涤之后用硅胶柱分离（洗脱剂，氯仿：石油醚 

X－射线单晶结构分析表面，噻吩和邻菲咯啉环的二面角很小（图2a），而且分子间的堆积结构显示很强的π－π堆积作用，邻近芳环的质心质心间距在3.6～3.8 ?之间（图2b）。与Phen，PHT0和PHT2的相比：随着推电子噻吩衍生物基团以及推电子甲基基团的引入，综合考虑电子效应和位阻效应，PHT1具有最好的共轭性能和荧光传感性能，具体波谱讨论如下所述。

如图4a所示，四种1,10-菲罗啉化合物的Zn²⁺配合物的最大激发波长分别为：Phen 385 nm，PHT0 381 nm，PHT1 405 nm，PHT2 375 nm。分别以最大激发波长来进行激发，所得荧光发射光谱如图4b所示，Phen-Zn²⁺配合物没有荧光，然而PHT0，PHT1以及PHT2的Zn²⁺配合物分别在440 nm，449 nm，461 nm有强的荧光发射，其中PHT1的荧光量子产率最大。

PHT1乙醇-水溶液的荧光滴定光谱如图5所示，随着Zn²⁺含量的增加，溶液在461 nm处的荧光发射强度呈线性增强，当Zn²⁺含量达到0.8当量时，荧光强度达到最大值，通过线性拟合得到方程：I_461 nm = 7.41[Zn²⁺] + 4.83, r = 0.999, n = 11。从图5推算PHT1对溶液中游离Zn²⁺的检测限为5 ppb，[Zn(PHT1)₂]²⁺配合物的配合常数K_ass = 3.4 × 10¹² M^-2。

不同金属离子的竞争性实验如图6所示，研究对象分别为生命体重常见的碱金属离子（Na⁺, K⁺, Li⁺），碱土金属离子（Mg²⁺, Ca²⁺）以及部分过渡金属离子（Zn²⁺，Cd²⁺，Cu²⁺等）。红色栏表示10 μM PHT1溶液对于1当量不同金属离子的荧光响应，结果表明只有Zn²⁺和Cd²⁺导致荧光增强，其中Zn²⁺的荧光增强最明显。黑色栏表示向已经存在10 μM PHT1以及10 μM Zn²⁺的溶液中滴加1当量杂离子时荧光响应，结果表明只有Cu²⁺导致了溶液的荧光猝灭，而其他金属离子没有任何影响。竞争性实验的结果证明了PHT1对Zn²⁺有良好的选择性。

 

 实施例2. HL-60细胞成像

HL-60（人类急性白血病细胞）悬浮液采用DMEM培养基，外加10% FBS（小牛血清）、青霉素（100 μg·mL^-1）、链霉素（100 μg·mL^-1），于37 ℃和5% CO₂气氛下培养。实验中先离心悬浮液并使用Hank's平衡盐溶液（HBSS）清洗，之后用HBSS重新悬浮，与50 μM PHT1在37 ℃下孵育45 min。孵育完毕之后用HBSS洗去剩余PHT1，将其分装在两个培养瓶中，每瓶1 mL细胞悬浮液。其中一瓶加入Zn²⁺溶液（[Zn²⁺] = 50 μM），之后两瓶悬浮液再在37 ℃下共同孵育20 min。使用激光共聚焦扫描显微镜（TCS SP5, Leica, Germany）分别对两瓶悬浮液进行细胞成像：405 nm激光二极管用于激发光光源，450 nm-500 nm滤光片用于发射光采集。

图7中的两幅图表示的是经过PHT1染色后的HL-60细胞在405 nm激发下的激光共聚焦扫描显微镜照片，微弱的蓝色荧光是由于细胞中含有的痕量Zn²⁺所导致的。下面两幅图表示的是HL-60细胞经过PHT1染色后，再加入50 μM Zn²⁺离子溶液孵育30分钟后的激光共聚焦扫描显微镜照片，荧光相对增强表明外加Zn2+透过细胞膜后与细胞内的PHT1结合生成了[Zn(PHT1)₂]²⁺配合物。HL-60细胞的成像实验表明PHT1具有良好的细胞渗透性以及低的细胞毒性，而且能够标记细胞器中痕量的锌离子。

 

实施例3. HepG-2细胞成像

HepG-2（人肝癌细胞）悬浮液采用DMEM培养基，外加10% FBS（小牛血清）、青霉素（100 μg·mL^-1）、链霉素（100 μg·mL^-1），于37 ℃和5% CO₂气氛下培养。染色之前先用DMEM培养基洗两次，再用10 μM PHT1溶液重新悬浮，室温下孵育30 min。孵育完毕之后用DMEM洗去剩余PHT1，将其分装在两个培养瓶中，每瓶1 mL细胞悬浮液。其中一瓶加入Zn²⁺溶液（[Zn²⁺] = 10 μM），室温下孵育30 min。最后再用锌离子螯合剂（TPEN）处理HepG-2细胞。使用激光共聚焦扫描显微镜进行细胞成像：405 nm激光二极管用于激发光光源，450 nm-500 nm滤光片用于发射光采集。

HepG-2细胞成像的实验结果和结论和HL-60细胞成像的结果类似。