磷酸西他列汀在制备防治热性惊厥药物中的应用

摘要

本发明属于医药技术领域，涉及一种化合物磷酸西他列汀在制备防治热性惊厥症药物中的应用。目前临床治疗热性惊厥药物效果明显，但是可产生多种严重副作用对儿童造成损伤，久用可产生耐受性及成瘾性。本发明涉及的产品，有效成分明确，成本较低，易于实施。

说明书

 

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种化合物磷酸西他列汀在制备防治热性惊厥药物中的应用。

背景技术

热性惊厥是小儿时期最常见的中枢神经系统功能异常的紧急症状，在婴幼儿中尤为多见，其总发病率约为2%～4%，欧美为2%～5%，日本为6%～9%，某些地区甚至高达14%。热性惊厥可导致神经系统的后遗症，回顾性研究表明，40%有复杂型热性惊厥发病史的病人会产生海马硬化和颞叶癫痫，同时流行病学调查结果显示患儿发生癫痫的相对危险性是一般儿童的10倍。因此，对热性惊厥疾病的预防和治疗就显得极为重要。

目前临床治疗热性惊厥的方法主要是口服苯巴比妥、水合氯醛灌肠、或安定肌注、或鲁米钠肌注等。虽然以上治疗方法效果明显，但是可产生多种副作用对人体造成损伤。例如出现头晕，困倦等后遗效应，久用可产生耐受性及成瘾性。多次连用应警惕蓄积中毒，长期用于治疗癫痫时不可突然停药，以免引起癫痫发作，甚至出现癫痫持续状态。一般应用５—10倍催眠量时,可引起中度毒,10—15倍则引起重度中毒,血药浓度高于８—10mg／100ml时,就有生命危险。急性中毒症状为昏睡,进而呼吸浅表,通气量大减,最后因呼吸衰竭而死亡。对严重肺功能不全（如肺气肿）,支气管哮喘及颅脑损伤呼吸中枢受抑制者慎用或禁用。肝肾功能不良者慎用,肝硬变或肝功能严重障碍者禁用。

磷酸西他列汀是目前治疗2型糖尿病药物的主要成分之一。磷酸西他列汀片(Januvia)是临床首个获批准用于治疗2型糖尿病的DPP-4抑制剂，于2006年在墨西哥及美国上市，2007年也获得欧盟批准用于治疗2型糖尿病。目前磷酸西他列汀片已成为美国口服糖尿病药物的第二大药物。

目前没有应用磷酸西他列汀应用于治疗热性惊厥的相关报道。

 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种化合物磷酸西他列汀在制备防治热性惊厥疾病的药物中的应用。

为了验证上述用途，本发明采用了以下技术措施：

A、首先，通过脑电图检测热性惊厥发作。为了证明磷酸西他列汀在热性惊厥中的作用，利用药理学实验方法，侧脑室注射磷酸西他列汀，通过脑电图检测手段，判断热性惊厥发作持续时间及发作次数。通过实验发现，磷酸西他列汀可以有效抑制热性惊厥发作。

B、其次，检测了磷酸西他列汀对热性惊厥大鼠的学习记忆功能的影响。有关文献表明，热性惊厥可以损伤大鼠的学习记忆功能。上述实验表明磷酸西他列汀可以有效抑制热性惊厥发作。随后我们进行经典的Morris 水迷宫实验检测大鼠的学习记忆功能。实验表明，磷酸西他列汀可以有效改善热性惊厥大鼠的学习记忆功能。

C、大鼠脑部海马组织神经元及星形胶质细胞检测。由于各种因素导致的大脑神经元及星形胶质细胞功能异常，同时星形胶质细胞活性增强可引起热性惊厥疾病的发生。因此神经元及星形胶质细胞在热性惊厥疾病发展过程中起到非常重要的作用。我们通过尼氏染色法检测大鼠海马区域神经元状态，利用免疫组化方法检测大鼠海马区域星形胶质细胞表面特异性活性标记物—胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，GFAP表达的强弱及多少反映了星形胶质细胞活性的强弱。实验结果表明，磷酸西他列汀对神经元起到一种保护作用，同时，可以有效抑制星形胶质细胞的活性即GFAP的表达。

本发明还提供了防治热性惊厥疾病的药物，其中含有有效剂量的磷酸西他列汀和辅料，其制备方法按现有医药技术即可。

本发明涉及的产品，有效成分明确，成本较低，易于实施。目前临床治疗热性惊厥的药物效果明显，但是可产生多种严重副作用对儿童造成损伤，久用可产生耐受性及成瘾性。

 

附图说明

图1脑电图监测分析

A图为整体动物实验流程，分为给药前后、热水浴处理及脑电监测，

B图、C图分别为生理盐水组及实验（磷酸西他列汀）组脑电图发作结果。

图2脑电图发作时间及发作次数统计分析结果

A图、B图分别为将两组脑电发作时间及发作次数的统计结果，**p<0.01。

图3 Morris 水迷宫检测大鼠学习记忆功能

A图为三组之间潜伏期统计分析结果,**p<0.01,***p<0.001，

B图为三组分别在目标象限游泳的时间，**p<0.01。

图4尼氏染色检测神经元

A、B图为正常对照组尼氏染色，

C、D图为实验组尼氏染色，

E、F图为生理盐水组尼氏染色。

图5免疫组化检测大鼠海马区GFAP表达

A、B图为正常组海马区GFAP表达，

C、D图为实验组海马区GFAP表达，

E、F图为生理盐水组海马区GFAP表达。

 

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的保护范围。

实施例1磷酸西他列汀对热性惊厥疾病的抑制作用

（1）        大鼠侧脑室及海马定位实验：选取30只15日龄SD大鼠随机分为2组即生理盐水组、实验组，进行侧脑室及海马定位。将大鼠固定于立体定位仪上，75%的酒精消毒处理，沿头顶部正中线切开头皮。参照Paxinos及Watson鼠脑图谱，借助立体定位仪，用微型电动颅钻钻孔，将外径为0.5 mm的不锈钢引导管插入右侧脑室(AP:1.5mm，R:1.5mm，  H:3.5mm)，同时将电极插入大脑两侧海马位置（2.5mm, 2.5mm, 2.5mm）,用牙科水泥固定于颅骨表面。

（2）        大鼠侧脑室药物注射实验：在引导管内插入外径为 0.3mm的不锈钢内管，其尖端比引导管长 1mm，另一端和微量注射器相连，用以注射微量药液。在微量注射器内抽入5ul药物，使5ul药物在 5min内缓慢匀速地注射完毕，留置 3min后退出注射针。然后，全层缝合头皮。生理盐水组仅在右侧侧脑室注射相同剂量的生理盐水。为保持脑室容量恒定，每次注射前皆先放出等量脑脊液

（3）    热性惊厥模型建立及脑电监测实验

A：热性惊厥模型建立：将大鼠放入一个透明的玻璃筒中(直径6cm，高20cm)，此玻璃筒下部有多个小孔与外部相通。将筒竖立于46℃恒温水浴箱中，通过向玻璃筒底垫放塑料垫片以调节筒中水的深度，以大鼠沿筒壁站立时仅能露出头部为准，整个水浴过程持续4min。

B：脑电监测实验

热水浴诱导惊厥的过程中，将前面埋置的电极与生物机能记录仪相连接描记大鼠脑电活动，通过脑电活动判断热性惊厥的发作程度。

以上实验结果经统计学分析显示，从脑电发作时间及发作次数上实验组显著低于生理盐水组，证明磷酸西他列汀可以在一定程度上抑制热性惊厥发生。结果见图1及图2。

 

实施例2磷酸西他列汀对大鼠学习记忆功能和空间认知功能检测实验

（1）选取60只（雄鼠）15日龄SPF级SD大鼠，随机分为3组（每组20只）实验（磷酸西他列汀抑制剂）组、生理盐水组、正常组。通过Morris水迷宫方法检测实验组和生理盐水组及正常组学习记忆功能和空间认知功能。实验用水槽为镀锌圆槽，直径150cm，高50cm，池内水深25cm，水温22—23℃，水中加入墨汁，使水池不透明。将水池划分为四个象限，在某个象限中点距池边25cm处放置一高23.5cm、直径8cm的平台，隐于水面下1.5cm。

实验分为两部分：

（1）定位航行实验：主要是检测动物学习记忆功能。

实验前一天下午让大鼠在水槽中自由游泳2min，以熟悉环境。实验共进行4天，每天上、下午各进行4次试验（每只大鼠随机从每个象限的中点面壁式入水1次），大鼠入水后尽力逃避水患，当发现站台后则栖身其上，图像采集及分析系统( EthoVision 3.0)自动记录保存大鼠的运动轨迹、找到站台的潜伏期（大鼠从入水至攀上平台的时间）、游泳时间、游泳速度、游泳距离及寻找站台的搜索战略等信息。若120秒仍未找到站台，由操作者将大鼠引上站台上休息4秒钟并将潜伏期记为120秒。

（2）空间探索实验：主要是检测动物空间认知能力。

第4日下午完成4次定位航行之后将站台撤除，进行空间探索试验。选定和站台区域相对的象限中点为入水点，大鼠以面壁方式入水，记录大鼠120秒内搜索站台穿过原站台区域的次数。

上述实验结果表明，与正常对照组和磷酸西他列汀相比，生理盐水组大鼠在潜伏期与目标象限所在时间学习记忆功能和空间认知能力均造成显著性损伤。磷酸西他列汀组的记忆功能和认知能力与正常对照组无显著差异。结果见图3。

实施例3尼氏染色检测神经元状态实验

尼氏体是反映神经元状态的一个指标：在正常生理情况下，尼氏体大而数量多，反映神经细胞合成蛋白质的功能较强，在神经元受损时，尼氏体的数量可减少甚至消失。

实验步骤如下：

(1) 组织切片:实验组、生理盐水组、正常组大鼠分别于脑电图实验结束后立即灌注取材。用戊巴比妥(400mg/kg)腹腔注射麻醉后,按常规方法4%多聚甲醛左心室灌注固定取脑。具体方法:将大鼠仰卧固定于解剖板上，剑突下开胸暴露心脏，找到心尖部，直视下将磨钝的穿刺针经左心室插入升主动脉，在右心耳剪开一小口放血，同时打开输液器开关，先用100-2OOml冷生理盐水(NS)快速灌注，之后稍减慢灌速度冲洗至流出液清亮，随后换用4%多聚甲醛/PBS(PH7.4)约100mL迅速灌之后稍减慢灌注速度继续固定。在灌注过程中，可以观察到大鼠全身肌肉颤动，逐渐僵硬、强直，此时断头取脑，置入上述固定液中后固定24h，再移入25%蔗糖PBS中4℃浸泡至组织沉底。在大脑视交叉与视乳头之间冠状切取2-5mm³组织，断面可见白色纤维状物，即是海马。随后将组织包埋、快速冰冻，在冰冻切片上做连续冠状切片。切片厚度30um，封片晾干备用。

（2）每组取4张石蜡切片常规脱蜡下水预处理。

（3）将石蜡切片放入缓冲亚甲蓝染色液内染10min（不多于12min）。

（4）在0.2mol/L醋酸盐缓冲液（PH=4.6）中分化1-3秒，并在显微镜下观察，尼氏体清晰时进行下一步试验。

（5）用4wt%的钼酸铵水溶液处理切片3-5min。

（6）蒸馏水洗脱后常规脱水透明、中性树胶封片。

（7）光学显微镜(×200)观察海马CA1区尼氏体的变化。

（8）实验结果显示：实验组(图4-C、D)大鼠海马CA1区较正常对照组(图4-A、B)尼氏体无明显差异，神经元尼氏体层次较致密但不紊乱，细胞大而圆胞体形状良好。生理盐水组(图4-E、F)较正常对照组海马神经元尼氏体轻微减少，胞质稍有淡染, 海马分层稀疏紊乱。以上结果表明：生理盐水组大鼠的海马神经元严重受损，实验组大鼠海马神经元状态无明显受损。

 

实施例4免疫组化检测大鼠海马区星形胶质细胞活性

实验步骤如下：

（1）切片用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次5min(3×5min),室温干燥10-15min.

每张切片滴加50ul过氧化物酶阻断液，室温下孵育5min，以阻断内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗5min,加 50ul正常山羊血清，室温下孵育10min，以减少非特性背景。

（2）吸去多于血清，每张切片滴加100ul兔抗大鼠GFAP(神经胶质酸性蛋白)多抗，4℃过夜。

（3）PBS冲洗×5min)，滴加50林L二抗(z:400稀释)，室温下孵育lh。PBs冲洗 (3xsmin)。

（4）每张切片滴加50协L新鲜配置的nAB显色液，显微镜下观察smin。自来水冲洗，苏木素复染10一 15sec。乙醇梯度脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。所有配对样本均在相同时间、相同条件下完成。对照组设置:用PBS代替一抗作阴性对照，其他步骤相同。

（5）免疫组织化学染色结果的判断标准:采用Q550A高清晰度彩色病理图像分析系统进行图像分析，所有切片均在同一放大倍数下分析。每只大鼠随机取相同部位的4张切片，分别对大鼠海马CAI、CA3区和齿状回(DG)区阳性细胞进行测定。

（6）免疫组化结果显示：正常组（图5-A、B）与实验组(图5-C、D)大鼠在海马DG区仅有弱的GFAP免疫反应阳性的星形胶质细胞。生理盐水组(图5-E、F) DG区GFAP阳性表达明显升高，阳性反应的星形胶质细胞的数量明显增多，表现为胞浆呈棕褐色，细胞形如蜘蛛，周围有放射状突起，有的突起粗短，无分支，有的突起细长。

综上所述，磷酸西他列汀化合物可有效降低热性惊厥的发作次数及发作持续时间，且可有效的改善热性惊厥大鼠的学习记忆功能。对神经元起到一种保护作用，可以抑制大鼠海马区域星形胶质细胞的活性。