医用对比剂及含有荧光金纳米团簇的微胞的制造方法

摘要

本发明提供一种医用对比剂，其是由多个含有荧光金纳米团簇的微胞所构成，每个微胞具有壳层与核心。微胞的壳层含有荧光金纳米团簇-白蛋白复合物，微胞的核心含有空气或碳氟化物。本发明还提供一种含有荧光金纳米团簇的微胞的制造方法。

说明书

技术领域

本发明是有关于一种诊断药剂，且特别是有关于一种应用于生医影像检查 的对比剂或医用对比剂。

背景技术

医用对比剂为在影像检查时，用来增强身体内流体结构对比的一种物质。 微胞对比剂(microbubbles contrast agents)是用来协助超音波显影。微胞是由一 层蛋白质、脂肪或聚合物包围少量的空气、氮气或全氟碳化物(perfluorocarbon) 而组成。在微胞内的气体与周遭流体界面的密度差异，会强烈地散射及反射超 音波，而让探针接收到强烈的讯号，形成最后的超音波影像。

目前美国食品药物检查局(Food and Drug Administration；FDA)通过两种微 胞对比剂。一种为白蛋白的壳层围绕八氟丙烷(octafluoropropane)的核心，另一 种为脂肪/半乳糖的壳层围绕空气的核心。

发明内容

因此，本发明的目的在于尝试修饰上述现有技术的微胞，合成出多功能对 比剂，以提供多种生医影像检查之用。

根据上述，本发明的一个方面是在于提供一种医用对比剂，其是由多个含 有荧光金纳米团簇的微胞所构成，每个微胞具有壳层与核心。每个微胞的壳层 包含多个荧光金纳米团簇-白蛋白复合物，每个复合物的结构为一层第一白蛋 白围绕荧光金纳米团簇。每个微胞的核心填充有空气或碳氟化物。

上述的荧光金纳米团簇-白蛋白复合物的结构包含一层第一白蛋白围绕荧 光金纳米团簇。此外，上述的荧光金纳米团簇-白蛋白复合物的结构还可包含 一层保护配位体，位于上述的第一白蛋白层与荧光金纳米团簇之间。

依据一实施例，上述的微胞的壳层还可以包含一种第二白蛋白，以稀释上 述的荧光金纳米团簇-白蛋白复合物的浓度。

依据一实施例，上述的第一白蛋白及第二白蛋白可分别为血清白蛋白、卵 白蛋白或储存白蛋白。

依据一实施例，上述保护配位体为一非白蛋白分子，例如可为二氢硫辛酸、 谷胱甘肽、硫普罗宁、间-2，3-二巯基丁二酸、苯基乙基硫醇盐、十二烷硫醇、 或巯基十一烷醇。

本发明的另一方面是在于提供一种含有荧光金纳米团簇的微胞的制备方 法。

依据一实施例，先混合Au³⁺溶液与第一白蛋白溶液以形成一混合溶液， 再加入碱至混合溶液中，以还原Au³⁺而形成荧光金纳米团簇-白蛋白复合物。 上述的荧光金纳米团簇是被上述第一白蛋白层所保护。接着，分散荧光金纳米 团簇-白蛋白复合物于水或磷酸盐缓冲溶液中，以形成分散溶液。然后，超音 波震荡上述的分散溶液，以形成微胞。超音波震荡的功率为11-24瓦，震荡 时间为1-3分钟。

依据另一实施例，先合成荧光金纳米团簇-配位体复合物，其结构为上述 的荧光金纳米团簇由上述配位体层所保护。再混合上述荧光金纳米团簇-配位 体复合物的溶液与第一白蛋白的溶液以形成荧光金纳米团簇-白蛋白复合物， 其结构为该第一白蛋白环绕上述荧光金纳米团簇-配位体复合物。然后，分散 荧光金纳米团簇-白蛋白复合物于水或磷酸盐缓冲溶液中，以形成一分散溶液。 接着，超音波震荡上述的分散溶液，以形成微胞。超音波震荡的功率为11-24 瓦，震荡时间为1-3分钟。

本发明的优点在于：本发明将可以放射荧光的荧光金纳米团簇整合在微胞 的结构中，使含有荧光金纳米团簇的微胞可被直接用来做为超音波显影的对比 剂以及血管造影(angiography)的荧光剂(fluorescein)。

上述发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容 具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指 出本发明实施例的重要/关键元件或界定本发明的范围。在参阅下文实施方式 后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及 其它发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施态样。

附图说明

为让本发明的上述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附 附图的说明如下：

图1A-1B为荧光金纳米团簇-白蛋白复合物的剖面结构示意图；

图1C-1D为依照本发明实施例的微胞的剖面结构示意图；

图2为依照本发明一实施方式的一种微胞的制备流程图；

图3A为两层结构的AuNCAb复合物的制备流程图；

图3B为三层结构AuNCLg_Ab复合物的一制备流程图；

图3C为三层结构AuNCLg_Ab复合物的另一制备流程图；

图4为微胞的合成步骤流程图。

其中，主要元件符号说明：

100a：具有两层结构的荧光金纳米团簇-白蛋白复合物

100b：具有三层结构的荧光金纳米团簇-白蛋白复合物

110：金纳米团簇             120：配位体

130：白蛋白                 140a、140b：微胞

150：核心                   210、220、230：步骤

310a、320a、330a：步骤

310b、320b、330a、340b、350b：步骤

310c、320c、330c、340c、350c、360c：步骤

410、420、430：步骤。

具体实施方式

依据上述，提供一种含有荧光金纳米团簇的微胞及其制备方法。在下面的 叙述中，将会介绍上述的含有荧光金纳米团簇的微胞的例示结构与其例示的制 造方法。为了容易了解所述实施例之故，下面将会提供不少技术细节。当然， 并不是所有的实施例都需要这些技术细节。同时，一些广为人知的结构或元件， 仅会以示意的方式在图式中绘出，以适当地简化图式内容。

微胞的结构

依据本发明一实施方式，微胞的壳层主要是由多个荧光金纳米团簇-白蛋 白复合物(fluorescent Au nanocluster-albumin complex)所组成，而且还可以再 加入一些白蛋白至壳层中。微胞的核心可填充空气或碳氟化物(fluorocarbons)， 例如可为八氟丙烷(octafluoropropane)。微胞的直径约为0.5-20μm。若考虑适 于用在人体医药用途的话，微胞的直径较佳为0.5-6μm。

图1A-1B为荧光金纳米团簇-白蛋白复合物的剖面结构示意图。荧光金纳 米团簇-白蛋白复合物可为如图1A所示的两层结构，或是如图1B所示的三层 结构。在图1A中，具有两层结构的荧光金纳米团簇-白蛋白复合物100a为金 纳米团簇(Au nanocluster；缩写为AuNC)110被一层白蛋白(albumin；缩写为 Ab)130所围绕，后面以「AuNCAb」的代号记载之。在图1B中，具有三层 结构的荧光金纳米团簇-白蛋白复合物100b的核心为金纳米团簇110，中间层 为具有至少一硫醇基的保护配位体(ligand；缩写为Lg)120，以及最外层为白 蛋白130，后面以「AuNCLg_Ab」的代号记载之。上述的金纳米团簇110 的直径约为1.9±0.8nm，所以金纳米团簇110可以放射波长约为640±90nm 的荧光。

在图1A中的白蛋白130以及图1B的配位体120通常使用-SH官能基来 包住金纳米团簇。而在图1B中的最外层的白蛋白130与中间层的配位体120 之间则通常是靠静电作用力(例如氢键或离子键)来互相结合。

上述白蛋白一般可为任何水溶性蛋白质，例如可为血清白蛋白(serum  albumin)、蛋白中的卵白蛋白(serum albumin)、或在一些植物种子中的储存白 蛋白(storage albumins)。上述的血清白蛋白例如可为人类血清白蛋白(human  serum albumin；HSA)、或牛血清白蛋白(bovine serum albumin；BSA)。较佳为使 用人类血清白蛋白，以免在人体中使用微胞时引发过敏反应。上述配位体为一 非白蛋白分子，例如可为二氢硫辛酸(dihydrolipoic acid；DHLA)、谷胱甘肽 (glutathione)、硫普罗宁(tiopronin)、间-2，3-二巯基丁二酸 (meso-2，3-dimercaptosuccinic acid)、苯基乙基硫醇盐(phenylethylthiolate)、十二 烷硫醇(dodecanethiol)、或巯基十一烷醇(mercaptoundecanol)。

举例来说，图1C-1D为依照本发明实施例的微胞的剖面结构示意图。在 图1C中，微胞140a的壳层主要是由图1A的两层结构的荧光金纳米团簇-白 蛋白复合物100a所构成。在图1D中，微胞140b的壳层主要是由图1B的三 层结构的荧光金纳米团簇-白蛋白复合物100b所构成。在图1C-1D中，核心 150可填充空气或碳氟化物。

依据上述，荧光金纳米团簇可以放射荧光并可被整合在微胞的结构中。因 此，含有荧光金纳米团簇的微胞可被直接用来做为超音波显影的对比剂以及血 管造影(angiography)的荧光剂(fluorescein)。

微胞的制备方法

图2为依照本发明一实施方式的一种微胞的制备流程图。在图2中，微胞 可依照下述步骤来制备之。首先，合成荧光金纳米团簇-白蛋白复合物(步骤 210)。然后，合成微胞(步骤220)以及纯化微胞(步骤230)。在步骤210中，荧 光金纳米团簇-白蛋白复合物可为AuNCAb复合物或AuNCLg_Ab复合物。 下面将详述上述制备步骤的细节。

在图2的步骤210中，先合成荧光金纳米团簇-白蛋白复合物。图3A为两 层结构的AuNCAb复合物的制备流程图。在步骤310a中，等体积的Au³⁺溶液与白蛋白溶液混合在一起，并剧烈搅拌一段时间，以形成混合溶液。

上述的Au³⁺溶液例如可为HAuCl₄的水溶液。依照本发明一实施方式，Au³⁺的浓度可为0.1-10mM。举例来说，Au³⁺的浓度可为1-10mM，或5-10mM。 更具体而言，Au³⁺的浓度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM。

上述白蛋白已经定义如上，因此省略其细节描述。依照本发明一实施方式， 白蛋白的浓度例如可为0.0758-0.7576mM。举例来说，白蛋白的浓度可为 0.1263-0.7576mM，或0.4000-0.7576mM。更具体而言，白蛋白的浓度可为 0.4、0.5、0.6、0.65、0.7或0.75mM。

在图3A的步骤320a中，加入还原剂(例如碱)至上述混合溶液中，形成还 原溶液，以获得两层结构的AuNCAb复合物。为了减少pH值变动对混合溶 液的冲击，碱溶液的体积较佳为少于上述混合溶液总体积的5％。不然，就需 要pH缓冲剂。接着，上述还原溶液经过剧烈搅拌一段时间(例如12小时)后， Au³⁺可被还原成荧光金纳米团簇，而形成AuNCAb复合物。

上述的碱例如可为NaOH或KOH。碱的浓度例如可为1N。当上述Au³⁺溶液与白蛋白溶液的体积皆为5mL时，加入的碱溶液体积例如可为0.5mL。 若希望能较易进行后续纯化步骤以及减少对人体冲击的话，NaOH将为较佳选 择。

在图3A的步骤330a中，纯化两层结构的AuNCAb复合物。纯化的方 法例如可为使用具有100kDa孔洞的滤膜来进行过滤，或使用半透膜来进行透 析(dialysis)，以移除未反应的Au³⁺。接着，使用冷冻干燥来获得AuNCAb 复合物。

图3B为三层结构AuNCLg_Ab复合物的一制备流程图。除了图3A的 白蛋白被配位体取代以及可以使用其它适用的还原剂(而不是碱)之外，图3B 中的步骤310b、320b、330b与图3A中的步骤310a、320a、330a类似。因此， 省略与步骤310b、320b、330b的相关细节与考虑。

接着，在图3B的步骤340b中，在水或磷酸盐缓冲液中混合步骤330b所 得的AuNCLg复合物与白蛋白，以形成三层结构的AuNCLg_Ab复合物。

依照本发明一实施方式，在最终溶液中，AuNCLg复合物的浓度可为1 -22μM。举例来说，AuNCLg复合物的浓度可为6-22μM，或12-22μM。 更具体而言，AuNCLg复合物的浓度可为12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21或22μM。

依照本发明一实施方式，在最终溶液中，白蛋白的浓度可为0.1516- 0.9090mM。举例来说，白蛋白的浓度可为0.3030-0.9090mM，或0.6060- 0.9090mM。更具体而言，白蛋白的浓度可为0.6060、0.7578、0.8333或0.9090 mM。

在图3B的步骤350b中，纯化三层结构的AuNCLg_Ab复合物。纯化的 方法例如可为使用具有100kDa孔洞的滤膜来进行过滤，或使用半透膜来进行 透析，以移除未反应的Au³⁺。接着，使用冷冻干燥来获得AuNCLg_Ab复合 物。

图3C为三层结构AuNCLg_Ab复合物的另一制备流程图。在步骤310c 中，先加入还原剂还原溶液中的Au³⁺，而得到金纳米微粒。依照本发明一实 施方式，Au³⁺的浓度可为0.25-25mM。举例来说，Au³⁺的浓度可为0.25-25 mM，或20-25mM。更具体而言，Au³⁺的浓度可为0.25、0.5、0.75、1、5、 10、15、20、21、22、23、24或25mM。

在步骤320c中，在溶液中再加入Au³⁺，蚀刻金纳米微粒，以获得金纳米 团簇。加入的Au³⁺溶液的Au³⁺浓度例如可为0.25-25mM。举例来说，上述 Au³⁺的浓度可为0.25-25mM，或20-25mM。更具体而言，上述Au³⁺的浓 度可为0.25、0.5、0.75、1、5、10、15、20、21、22、23、24或25mM。

在步骤330c中，在金纳米团簇的溶液中加入配位体，以获得AuNCLg 复合物。配位体已在上面定义之，因此不再重复记载之。接着，由于图3C的 步骤340c、350c、360c与图3B的步骤330b、340b、350类似，因此不再赘述 其相关细节。

接着，在图2的步骤220中，进行合成微胞的步骤。图4为微胞的合成步 骤流程图。在图4的步骤410中，将图3A-3C所获得的任一种荧光金纳米团 簇-白蛋白复合物分散在水中或磷酸盐缓冲溶液中，形成分散溶液。依照本发 明一实施方式，分散溶液中的荧光金纳米团簇-白蛋白复合物的浓度例如可为 40-60mg/mL。举例来说，分散溶液中的荧光金纳米团簇-白蛋白复合物的浓 度例如可为50-60mg/mL，或55-60mg/mL。更具体而言，分散溶液中的荧 光金纳米团簇-白蛋白复合物的浓度例如可为40、42、44、46、48、50、51、 52、53、57、55、56、57、58、59或60mg/mL

在图4的步骤420中，可在分散溶液中再选择性地加入白蛋白，在此加入 的白蛋白的种类可与前面的白蛋白为相同或不同种类。当荧光金纳米团簇-白 蛋白复合物为两层的AuNCAb复合物时，白蛋白/AuNCAb复合物的最后 摩尔比例如可为1-4、2-4、或3-4。当荧光金纳米团簇-白蛋白复合物为三 层的AuNCLg_Ab复合物时，白蛋白/AuNCLg_Ab复合物的最后摩尔比例 如可为1、1/2或1/3。

在图4的步骤430中，以超音波震荡所得的分散液，以形成微胞。接着， 让微胞分散液静置1-3分钟来稳定微胞分散液。静置后的微胞分散液约略可 分成三层。下层主要包含自由的荧光金纳米团簇-白蛋白复合物，中间层主要 包含微胞，上层主要包含较大的微胞。

依照本发明一实施方式，上述的超音波震荡所用的功率强度例如可为11- 24瓦，所获得的微胞直径约为0.5-20μm。举例来说，超音波震荡所用的功 率强度例如可为21-24瓦。更具体而言，超音波震荡所用的功率强度例如可 为11、13、15、17、19、20、21、22、23或24瓦。超音波震荡的时间只要1 -3分钟即已足够。举例来说，超音波震荡的时间可为1、1.5、2、2.5或3分 钟。

最后，在图2的步骤230中，进行纯化微胞的步骤。取出静置后的微胞分 散液的中层与下层，进行离心，离心时的相对离心力(relative centrifugal force； RCF)约为350。离心后，微胞将位于上层分散液中，因此只要取出上层分散液 即可得到微胞。

实施例1：合成AuNCBSA复合物与其微胞

在此实施例中，AuNCBSA复合物是以下述步骤合成的。

在5mL的50mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液中加入5mL的10mM HAuCl₄溶液，在37℃下剧烈搅拌2分钟。接着，在牛血清白蛋白及HAuCl₄的混合溶液中，加入0.5mL的1N NaOH溶液，在37℃下再剧烈搅拌12小 时，形成金纳米团簇，以获得AuNCBSA复合物。

AuNCBSA复合物的光致放光性质的相关数据列在下面的表1中。从表 1中可知，所有实验例的激发与放光数据皆相同。因此，可以得知牛血清白蛋 白及HAuCl₄的相对量并不会影响AuNCBSA复合物的光致放光性质。

表1：AuNCBSA复合物的光致放光性质

  HAuCl₄(mM)   BSA(mg/mL)   激发处(nm)   放光处(nm)   0.1   0.5   260-500   550-750   1   5   260-500   550-750   10   50   260-500   550-750

接着，在磷酸盐缓冲溶液中分散AuNCBSA复合物，形成AuNCBSA 复合物的分散溶液。然后，以超音波震荡AuNCBSA复合物的分散溶液，形 成AuNCBSA复合物的微胞。

AuNCBSA复合物微胞光致放光性质的相关数据列在下面的表2中。从 表2中可知，所有微胞实验例的放光数据与表1中的AuNCBSA复合物本身 的激发与放光数据皆相同。但是，超音波震荡的功率强度会影响微胞的直径大 小。除了纯BSA的微胞之外，其它AuNCBSA复合物的微胞直径与超音波 震荡的功率强度成正比。

表2：AuNCBSA复合物的微胞的光致放光性质

^*AuBSA与BSA的浓度为55mg/mL。

实施例2：合成AuNCDHLA_BSA复合物及其微胞

在此实施例中，AuNCDHLA_BSA复合物是以下述步骤合成的。

首先，在40mL小瓶中加入0.625mL的100mM癸酸(decanoic acid)，然 后搅拌之。接着，加入做为还原剂的1mL的25mM四丁基硼氢化铵 (tetrabutylammonium borohydride；TBAB)以及0.8mL的25mM AuCl₃/100mM 双十二烷基二甲基溴化铵(didodecyldimethylammonium bromide；DDAB)的溶 液。让反应进行约10分钟，以形成金纳米微粒。然后，在金纳米微粒的溶液 中再加入上述的AuCl₃的DDAB溶液，以蚀刻金纳米微粒而得到金纳米团簇。

后续，将金纳米团簇的溶液加入至等体积的200mM硫辛酸(lipoic acid)/50 mM TBAB的溶液中，再搅拌10分钟。在此反应中，硫辛酸被TBAB新鲜还 原成二氢硫辛酸(dihydrolipoic acid；DHLA)，形成AuNCDHLA复合物。

接下来，移除AuNCDHLA复合物溶液的上清液，再加入甲醇来再次溶 解AuNCDHLA复合物。在1mbar下进行减压干燥AuNCDHLA复合物的 甲醇溶液，再以氯仿(chloroform)清洗AuNCDHLA复合物的固体，移除有机 残余物。再使用甲醇溶解AuNCDHLA复合物，再移除甲醇，让AuNCDHLA 复合物溶解在pH9的硼酸钠/硼酸缓冲液中，在55℃下静置24小时。在超离 心(ultracentrifugation)之后，再分散所得的AuNCDHLA复合物于磷酸盐缓冲 液中。所得的AuNCDHLA复合物可被300-550nm的光激发，并放出580- 700nm的光。

接下来，在AuNCDHLA复合物的磷酸盐缓冲液中加入牛血清白蛋白 (BSA)，形成三层结构AuNCDHLA_BSA复合物。以超音波震荡 AuNCDHLA_BSA复合物的分散液以形成微胞，超音波的功率为20-24瓦。 AuNCDHLA_BSA复合物微胞的光致发光性质的相关数据列在下面表3中。 从表3可知，在形成微胞的前后，AuNCDHLA_BSA复合物的光致发光性质 是一样的。因此，微胞的形成对于AuNCDHLA_BSA复合物的光致发光性 质是没有影响的。

表3：AuNCDHLA_BSA复合物微胞的光致发光性质

^*AuDHLA_BSA与BSA的浓度为55mg/mL。

虽然本发明已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习 此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此 本发明的保护范围当视后附的权利要求书所界定的范围为准。