酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱的制备方法

摘要

本发明公开了一种酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱的制备方法，该方法依次将酚类环境雌激素分子印迹聚合物100-500mg与传统固相萃取填料100-500mg分别与5-20mL纯有机溶剂混合均匀，依次移入固相萃取空柱中，并用筛板封堵两端，装填均匀后用酸性有机溶剂上柱清洗，然后用纯有机溶剂冲洗，并用惰性气体吹扫除去残余有机溶剂，干燥即得。本发明制备方法简单，具有与酚类环境雌激素分子印迹聚合物本身匹配的特殊性，所制备的固相萃取柱对酚类环境雌激素具有很高的选择性和回收率，并且可以明显降低基质效应。

说明书

技术领域

本发明涉及一种固相萃取柱的制备方法，尤其涉及一种酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱的制备方法。

背景技术

酚类环境雌激素作为制备环氧树脂和聚碳酸酯塑料的添加剂，进入生物体内可造成内分泌失调，危害生物体生殖机能或引发恶性肿瘤，提高与激素相关的癌症并发率，其生物雌激素效应与环境毒性已引起国内外研究者的广泛关注。最新研究表明，0.1μg/L甚至更低量级的酚类环境雌激素可引起实验动物的生物效应，干扰生物体中内源性激素的分泌，其低剂量效应研究已成为当前酚类环境雌激素研究的一个重要方向。鉴于此，开展痕量酚类环境雌激素的富集净化与检测技术研究有益于促进卫生检验技术的进步。

由于酚类环境雌激素样品基质复杂、种类繁多、含量甚微（pg级），因此样品的富集净化技术成为其分析监测中的关键步骤。目前，酚类环境雌激素样品预处理的常用方法包括：液液萃取和固相萃取。固相萃取比液液萃取富集效率高、消耗有机溶剂少、操作简单和易于自动化等优点。然而，传统的固相萃取小柱多采用C₁₈、改性二氧化硅、三氧化二铝等颗粒作为填料，对酚类环境雌激素的富集效果及选择性较差。因此，设计对酚类环境雌激素具有高选择性和高富集倍数的固相萃取小柱对于其富集净化与检测技术的进步具有十分重要的现实意义。

分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymers，MIPs）主要是利用分子印迹技术制备的具有高亲和性和高选择性的可以识别和结合目标分子的特定受体。MIPs依靠形状、大小和化学功能基的分布对模板分子进行识别，具有专一选择性，因其制备方法多样、工艺相对容易控制、特异选择性强、具有结构和功能的可预期性、可调控性、可裁剪性而被广泛用于样品中酚类环境雌激素的分离富集。R. Zhu等报道了（R. Zhu, W. H. Zhao, M. J. Zhai, et al., Anal. Chim. Acta 2010, 658, 209.），以双酚A为模板分子、二氧化硅为载体的用于富集分离污水中双酚A的纳米级分子印迹聚合物。Y. S. Ji 等报道了（Y. S. Ji, J. J. Yin, Z. G. Xu, et al., Anal Bioanal Chem. 2009, 395, 1125.），以磁性纳米四氧化三铁为载体，以双酚A为模板分子，在外磁场作用下可以实现快速、有效的固液分离的纳米四氧化三铁磁性分子印迹聚合物。目前，关于酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱的制备方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱的制备方法。本发明制备工艺简单、专一选择性强、富集效率高；所制备的酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱对水样和食品样品中残留的痕量酚类环境雌激素具有很高的选择性和极强的富集能力，并且可以显著降低基质效应。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱的制备方法，该方法包括以下步骤：

（1）将100~500mg酚类环境雌激素分子印迹聚合物与5~20mL纯有机溶剂混合，振荡5~30min后，超声5~30min至混合均匀，移至聚丙烯等材质的固相萃取小柱中，装填均匀后，两端分别用筛板封堵。

（2）将100~500mg 传统固相萃取填料与5~20mL纯有机溶剂混合，振荡5~30min后，超声5~30min至混合均匀，移至步骤1的固相萃取小柱中，装填均匀后，顶端用筛板封堵，用5~20mL酸性有机溶剂上柱清洗，然后用5~20mL纯有机溶剂上柱清洗，以除去酸性物质。

（3）将步骤2的固相萃取小柱用惰性气体吹扫除去残留的有机溶剂，然后30~90℃真空干燥1~24小时，制得酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱。

本发明的有益效果是：本发明所制备的酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱，具有制备工艺简单、专一选择性强、富集效率高的优点，并将其应用于富集生活饮用水及食品中残留的痕量酚类环境雌激素，能达到较高的富集倍数并可有效的降低基质效应。

附图说明

图1是根据本发明实施例，得到6种酚类环境雌激素的多反应监测（MRM）色谱图，图中，（1）双酚A；（2）己烯雌酚；（3）己烷雌酚；（4）4-叔辛基酚；（5）戊酸雌二醇；（6）4-壬基酚。

具体实施方式

本发明酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱的制备方法，包括以下步骤：

1、将100~500 mg酚类环境雌激素分子印迹聚合物与5~20 mL纯有机溶剂混合，振荡5~30 min后，超声5~30 min至混合均匀，移至聚丙烯等材质的固相萃取小柱中，装填均匀后，两端分别用筛板封堵。

酚类环境雌激素分子印迹聚合物优选为粉末状。

酚类环境雌激素分子印迹聚合物可以通过以下步骤制备得到：

（1）、制备高磁含量单分散的四氧化三铁/聚合物复合微球：采用化学共沉淀法制备得到纳米四氧化三铁微粒，并以油酸进行表面修饰，然后采用悬浮聚合法制备得到高磁含量单分散的四氧化三铁/聚合物复合微球； 

（2）、制备模板分子与氨基功能试剂的复合反应液：在60℃条件下，在甲醇体系中，模板分子与功能基经氢键作用力相互结合，形成模板分子与氨基功能基团的复合反应液；

（3）、制备氨基化纳米四氧化三铁磁性分子印迹复合材料：步骤（1）和步骤（2）所得产物经开环反应对材料进行表面功能化修饰，最终得到具有核壳结构的氨基化纳米四氧化三铁磁性分子印迹复合材料。

纯有机溶剂可以是甲醇、乙醇、乙腈和丙酮中的至少一种，进一步优选为甲醇。

2、将100~500mg 传统固相萃取填料与5~20mL纯有机溶剂混合，振荡5~30min后，超声5~30min至混合均匀，移至步骤（1）的固相萃取小柱中，装填均匀后，顶端用筛板封堵，用5~20mL酸性有机溶剂上柱清洗，然后用5~20mL纯有机溶剂上柱清洗，以除去酸性物质。

传统固相萃取填料可以是C₁₈、改性二氧化硅、三氧化二铝和PSA中的至少一种，进一步优选为粉末状C₁₈。酚类环境雌激素分子印迹聚合物与传统固相萃取填料的质量比为1:1-1:5。

酸性有机溶剂可以是甲酸、乙酸和三氟乙酸中的至少一种与甲醇的混合溶液，进一步优选为甲酸与甲醇的混合溶液；甲酸与甲醇的体积比为1:5-1:20。

纯有机溶剂可以是甲醇、乙醇、乙腈和丙酮中的至少一种，进一步优选为甲醇。

3、将步骤2的固相萃取小柱用惰性气体吹扫除去残留的有机溶剂，然后30~90℃真空干燥1~12小时，制得酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱。

本发明所制得酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱的性能评价：通过对实际样品的检测对酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱的性能进行评价。采用不同比例的甲醇-水溶液和甲酸-甲醇溶液对固相萃取柱进行清洗，分别对淋洗和洗脱条件进行优化，并与普通SPE柱富集净化效果进行比较。结果表明：本发明所制得酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱对目标分析物的富集倍数为50-500倍，酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱在使用15次之后，对样品中残留的痕量酚类环境雌激素仍具有高的选择性和富集能力，其回收率大于92.5%。

下面结合附图及具体实施例对本发明的内容做进一步说明，使本发明的优势和有益效果更加突出，但本发明不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱的制备：

（1）将100mg酚类环境雌激素分子印迹聚合物与10mL纯有机溶剂混合，振荡10min后超声10min至混合均匀，移至聚丙烯等材质的固相萃取小柱中，两端分别用筛板封堵；

（2）将500mg 传统固相萃取填料与10mL纯有机溶剂混合，振荡10min后超声10min 至混合均匀，移至步骤（1）所得固相萃取小柱中，装填均匀后顶端用筛板封堵，用10mL酸性有机溶剂上柱清洗，然后用10mL纯有机溶剂上柱清洗，以除去酸性物质；

（3）将步骤（2）所得固相萃取用惰性气体吹扫除去残留的有机溶剂，30℃真空干燥12小时，制得酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱。

酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱的性能评价：

（1）先后用5mL水和甲醇对酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱进行活化，之后将500mL河水过滤后上样，流速为1.0mL/min，用6mL甲醇与水（1:10 V/V）的混合溶液淋洗，再用10mL甲醇与甲酸（1:10 V/V）的混合溶液进行洗脱，洗脱液经氮气吹至近干，用甲醇溶解并定容至1mL，采用超快速液相色谱-串联质谱仪（UFLC-MS/MS）进行分析。

（2）先后用5mL水和甲醇对酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱进行活化，之后将5mL经蛋白沉淀的全血样品上样，流速为1.0mL/min，用6mL甲醇与水（1:10 V/V）的混合溶液淋洗，再用10mL甲醇与甲酸（1:10 V/V）的混合溶液进行洗脱，洗脱液经氮气吹至近干，用甲醇溶解并定容至100μL，采用超快速液相色谱-串联质谱仪（UFLC-MS/MS）进行分析。

实施例2~8操作步骤同实施例1，实施例1~8原料物质、原料配方及制备条件参数见表1。

表1：本发明实施例1~10原料组分及制备参数

 本发明应用酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱对水中双酚A、己烯雌酚、己烷雌酚、4-叔辛基酚、戊酸雌二醇和4-壬基酚进行富集净化。分别准确称取各酚类环境雌激素标准品10.0mg于6个10mL容量瓶中，用少量甲醇溶解后，用甲醇定容至刻度，制成1.0g/L的标准储备液，在4℃冰箱中保存备用。采用上述各酚类环境雌激素标准储备液配置浓度为0.05μg/L的混合标准溶液50~500mL，流速为1.0mL/min，用6mL甲醇与水（1:10, V/V）的混合溶液淋洗，再用10mL甲醇与甲酸（1:10, V/V）的混合溶液进行洗脱，洗脱液经氮气吹至近干，用甲醇溶解并定容至1mL，采用超快速液相色谱-串联质谱仪（UFLC-MS/MS）进行分析，结果如图1所示。结果表明：采用本发明制备的酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱，其对上述酚类环境雌激素的富集倍数为50~500倍，是有效富集水样中酚类环境雌激素的潜在固相萃取柱。

色谱条件：

色谱柱：X-Bridge C₁₈柱（150mm×2.1mm i.d., 5μm）；流速：0.4mL/min；进样量：5.0μL ；流动相：A相：内含0.08%氨水，B相：内含0.08%氨水甲醇。梯度洗脱程序：0~5.00min，60.0%A~30.0%A；5.00~5.20min，30%A~10%A；5.20~7.00min，10%A；7.00~7.01min，10.0% A~60.0% A；7.01~10.00min，60.0% A。

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；定量检测方式：多反应监测模式（MRM）；电喷雾电压（IS）：4500V；雾化气压力（GS1）：344.8kPa（50.0psi）；辅助气流速（GS2）：344.8kPa（50.0psi）；气帘气压力（CUR）：275.9kPa（40.0psi）；碰撞气（CAD）：41.4kPa（6.0psi）；离子源温度（TEM）：650^oC；扫描时间：20mS；碰撞室出口电压（CXP）：10.0V；碰撞室入口电压（EP）：10.0V；Q1/Q3离子对、碰撞能量（CE）及去簇电压（DP）见表2。

表2：6种酚类环境雌激素的Q1/Q3离子对、去簇电压、碰撞能量及其保留时间

注：*定量离子。.

本发明所述酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱，通过实验证明：该发明制备工艺简单，成本低廉，得到的酚类环境雌激素分子印迹固相萃取柱分布均匀，性质稳定；对水及生物样品中残留的痕量双酚A、己烯雌酚、己烷雌酚、4-叔辛基酚、戊酸雌二醇和4-壬基酚具有良好的富集作用。

实施例9：制备酚类环境雌激素分子印迹聚合物

1、分别称取5.56g FeSO₄?7H₂O和10.58g FeCl₃?6H₂O，溶解于200.0mL超纯水中，超声分散5.0分钟，加热升温至60℃，搅拌速度为300转/分钟，加入过量氨水至pH为11.0，恒温恒速反应1.0小时，磁分离，先后用超纯水和乙醇洗涤数次至pH为6-8，60℃真空干燥12小时，制得纳米四氧化三铁微粒。

2、称取2.0 g步骤1制备的纳米四氧化三铁微粒，并将其加入到200.0mL乙醇溶液中，超声分散5.0分钟，在60℃下恒温搅拌反应，搅拌速度为300转/分钟，10分钟内匀速滴加20.0mL油酸，反应1.0小时后，磁分离，用乙醇洗涤数次至pH为6-8，60℃真空干燥12小时，制得表面油酸修饰的纳米四氧化三铁微粒。

3、称取2.0g 聚乙烯醇217于500.0mL超纯水中，加热溶解，以此作为分散剂；将1.5 g步骤（1）制备的油酸修饰的纳米四氧化三铁微粒加入到上述配置的分散剂中，超声分散5.0 分钟，将聚合单体甲基丙烯酸甲酯 （4.0mL）、功能化单体甲基丙烯酸缩水甘油酯 （4.0mL）、交联剂二乙烯基苯 （2.0mL），在搅拌下依次滴加到反应体系中，60℃下超声分散5.0分钟，使反应体系分散均匀。将1.0g过甲氧基苯甲酰引发剂溶解在20.0mL热乙醇溶液中，在80℃、800转/分钟的转速下，滴加到上述反应体系中，恒温恒速反应3.0小时，磁分离，先后用超纯水和乙醇洗涤数次，60℃真空干燥12小时，制得环氧基功能化纳米四氧化三铁磁性复合微球。

4、 分别称取2.0g模板分子和10.0mL氨基功能试剂，并将其加入到100.0mL甲醇反应介质中，超声分散2.0分钟，在60℃条件下，搅拌速度为400转/分钟，恒温磁力搅拌反应3.0小时，制的模板分子与氨基功能基团的复合反应液；

5、称取2.0g步骤3所制得环氧基功能化纳米四氧化三铁磁性复合微球，加入到步骤4所制得模板分子与氨基功能基团的复合微乳液体系中，在步骤4的反应条件下，继续反应8.0小时后，磁分离，用超纯水洗涤数次至pH为6-8，再用甲醇超声洗涤数次至模板分子不被检出，60℃真空干燥12小时，制得酚类环境雌激素分子印迹聚合物。

本发明的上述实施方案是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。