一种吸烟者尿液样品中烟碱及其代谢物的检测方法

摘要

一种吸烟者尿液样品中烟碱及其代谢物的检测方法，其特征在于：取吸烟者尿液样品加入烟碱-d

说明书

技术领域

本发明涉及吸烟者尿液样品中烟碱及其代谢物的检测方法。该方法采用同位素内标作为 标记物，采用GC-MS对吸烟者尿液中烟碱及其代谢物进行检测。

背景技术

烟碱是烟草中的主要生物碱，约占烟草总生物碱量的90％以上。卷烟抽吸时，烟草中的 烟碱约有40％直接转移到卷烟主流烟气和侧流烟气中。人体吸入烟气后，烟碱经口腔、喉部、 气管以及肺泡的细胞壁进入血液循环系统，再经肝脏代谢，形成多种代谢产物，之后通过尿 液、唾液、汗液等分泌物排出体外[Hukkanen J，Jacob P III，Benowitz N L. Metabolism  and Disposition Kinetics of Nicotine[J].Pharmacol Rev，2005，57(1)：79-115]。

研究烟碱的体内代谢途径，了解各代谢产物在体内的存在浓度和衰减规律，对明确与吸 烟状态相关的生物标记物，建立生物标记物的体内浓度与烟气暴露程度的相关性，有着重要 意义。目前，烟碱及其代谢物作为评价暴露烟草烟气程度的生物标记物，受到了生物医学研 究、烟草与健康研究的广泛重视[Scherer G.Biomonitoring of inhaled complex  mixtures-Ambient air，diesel exhaust and cigarette smoke[J].Exp Toxicol Pathol， 2005，57(1)：75-110]，所以需要建立准确检测尿液中烟碱及其代谢物的检测方法。尿液样 品由于组成复杂，其中烟碱及其代谢物等目标组分含量较低，选择合适的样品前处理方法和 有效的检测方法是保证检测结果准确可靠的重要环节。

烟碱在体内可代谢成多种物质，其中烟碱本身、可替宁和反3′-羟基可替宁、降可替宁 都可作为烟气暴露的有效生物标记物，其中可替宁是使用最多的生物标记物，已成为评估吸 烟量的特异性生物标记物。但研究表明烟碱及其多个代谢物的总剂量比单个代谢物更能准确 表征个体烟气暴露的状态[Boswell C，Curvall M，Elswick R Jr，et al.Modeling nicotine  intake in smokers and snuff users using biological fluid nicotine metabolites[J]. Biomarkers，2000，5：341-345]。

文献报道有关吸烟者尿液中烟碱及其代谢物的检测方法很多，其中包括巴比妥酸法，免 疫法^[89-104]，气液色谱法(GLC)^[105-110]，气相色谱法(GC)^[111-114]或气质联用法(GC-MS)^[115-123]， 高效液相色谱法(HPLC)^[124-131]和液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)^{[80，132-140]}。相比其它方法， LC-MS法虽然检出限低，分离能力强，但是价格昂贵，同时在检测尿液样品时还存在基质效 应的干扰[Meger M，Meger-Kossien I，Schuler-Metz A，et al.Simultaneous determination  of nicotine and eight nicotine metabolites in urine of smokers using liquid  chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed  Life Sci，2002，778(1-2)：251-261]，所以很多研究者采用GC-MS法检测吸烟者尿液中 的烟碱及其代谢物，但这些方法只检测了烟碱在尿液中的1-2种代谢物，前处理方法大多也 采用液液萃取，容易出现乳化现象和溶剂浪费[Shin H S，Kim J G，Shin Y J，et al.Sensitive  and simple method for the determination of nicotine and cotinine in human urine， plasma and saliva by gas chromatography-mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt  Technol Biomed Life Sci，2002，769(1)：177-183]。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种吸烟者尿液复杂基质中烟碱及 其代谢物的检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种吸烟者尿液样品中烟碱及其代谢物的检测方法，所述步骤为：取吸烟者尿液样品加入混 合内标溶液，采用固相萃取小柱进行净化，洗脱液吹干后进行BSTFA衍生化，冷却至室温进 行GC-MS检测。

该方法包括以下步骤：

①吸烟者尿液样品的收集：采集吸烟者24h尿样；

②配制混合内标溶液：以同位素标记物烟碱-d₃、可替宁-d₃、反3′-羟基可替宁-d₃作为 内标物，配制浓度均为10μg/mL的混合内标乙酸乙酯溶液；

③配制混合标准溶液：准确称取烟碱、可替宁、降可替宁和反3′-羟基可替宁各10mg， 配制浓度均为10μg/mL的混合标准溶液；

④标准曲线的绘制：取50μL混合内标乙酸乙酯溶液和250μL BSTFA，然后加入系列 烟碱及其代谢物的混合标准溶液配制成浓度(ng/mL)为2.0，5.0，10.0，50.0，100.0，500.0， 1000.0，5000.0的标准溶液，旋涡混合后在70℃水浴中衍生化40min，吸入样品瓶，冷却 至室温，进行GC-MS检测；然后以被测物的峰面积与其内标的峰面积的比值(Y)对稀释后 的空白尿液中被测物的浓度(X)进行线性回归，求得各种代谢物的标准曲线；

⑤样品前处理：取1mL尿液，加入50μL混合内标乙酸乙酯溶液，按照10000r/min 离心5min后取上清液上样至活化过的HLB固相萃取小柱，分别采用1mL甲醇和水进行活化， 然后用5％甲醇淋洗柱子；接着用氮气吹干HLB小柱，再1ml甲醇洗脱；收集吹脱液于10mL 的试管中；在氮吹仪上于45℃吹干上述洗脱液，分别加入250μL乙酸乙酯和250μLBSTFA， 密封，旋涡混合后在70℃水浴中衍生化40min，吸入样品瓶，冷却至室温，进行GC-MS检 测；

⑥数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。

所述步骤④和⑤中的烟碱-d₃、反3′-羟基可替宁-d₃分别为烟碱和反3′-羟基可替宁的 内标物，可替宁-d₃为可替宁、降可替宁的内标物。

所述步骤④和⑤中的色谱条件如下：

色谱柱：DB-5MS石英毛细管柱，规格为30m×0.25mm i.d.×0.25μm d.f； GC进样方式：采用不分流进样，进样量为1μl；

溶剂延迟：5min

进样口温度：250℃；

载气为He，流速为1.2mL/min；

程序升温方法：

所述步骤④和⑤中的质谱条件如下：

电离方式：EI；

传输线温度：290℃；

离子化能：70eV；

离子源温度：230℃；

四极杆温度：150℃；

每种目标检测物及其内标特征离子：

烟碱：定性离子162m/z、定量离子84m/z；

可替宁：定性离子176m/z、定量离子98m/z；

反3′-羟基可替宁：定性离子249m/z、定量离子144m/z；

降可替宁：定性离子234m/z、定量离子219m/z；

烟碱-d₃：定性离子165m/z、定量离子87m/z；

可替宁-d₃：定性离子179m/z、定量离子101m/z；

反3′-羟基可替宁-d₃：定性离子252m/z、定量离子147m/z。

所述尿液收集时晨尿弃去，以后每次尿液都收集于清洁容器中，直至收集了第二天晨尿。 每种目标检测物及其内标特征离子：

  检测物   定性离子(m/z)   定量离子(m/z)   烟碱   162   84   可替宁   176   98   反3′-羟基可替宁   249   144   降可替宁   234   219

  烟碱-d₃  165   87   可替宁-d₃  179   101   反3′-羟基可替宁-d₃  252   147

本发明依据的测试原理在于：烟碱和可替宁选定GC-MS条件下分离较好且灵敏度较高， 由于反3′-羟基可替宁和降可替等其它烟碱代谢物存在极性基团，所以在选定条件下响应 很弱或没有响应。而反3′-羟基可替宁和降可替的分子中都存在活泼氢，所以可通过衍生 化来提高其在质谱中的响应强度。本发明采用BSTFA对反3′-羟基可替宁和降可替进行硅 烷化，然后进行GC-MS检测。

本发明的有益效果是：采集吸烟者24h尿样，能更为真实的反应吸烟者的烟碱感受量； 可同时检测吸烟者尿液中的烟碱及其3种代谢物。本发明能够有效的消除尿液的基体干扰， 具有较低的检出限和较高的精密度，能够对吸烟者尿液中烟碱及其3种代谢物进行准确定量 检测。

附图说明

图1为本发明的标准样品色谱图；

图2为本发明的典型样品色谱图。

具体实施方式

本发明结合以下实施例做进一步描述，但并不限制本发明。

实施例1：采集10名吸烟者24h尿样：晨尿弃去，以后每次尿液都收集于清洁容器中， 直至收集了第二天晨尿，收集后保存于-20℃下。

HLB小柱净化：取1mL尿液，加入50μL混合内标水溶液(烟碱-d₃、可替宁-d₃和反3′- 羟基可替宁-d₃的浓度为10μg/mL)，离心5min(10000r/min)后上样至活化过的HLB固 相萃取小柱(分别采用1mL甲醇和水进行活化)，然后用5％甲醇淋洗柱子。接着用氮气吹干 HLB小柱，再1ml甲醇洗脱。收集吹脱液于10mL的试管中。

BSTFA衍生化与GC-MS检测：在氮吹仪上于45℃吹干上述洗脱液，分别加入250μL乙 酸乙酯和250μLBSTFA，密封，旋涡混合后在70℃水浴中衍生化40min，吸入样品瓶，冷 却至室温，进行GC-MS检测。GC-MS检测条件见表1。

表1GC-MS检测条件

标准曲线制作：分别称取标准品各10.0mg，用甲醇溶解后转移至10ml棕色容量瓶中， 用甲醇定容，于-40℃保藏。取一定量的各目标物(内标除外)贮备液混合后用水定容至10mL 即可得到10μg/mL的混合工作液。各取一定量的烟碱-d₃、可替宁-d₃、反3′-羟基可替宁 -d₃贮备液混合后用乙酸乙酯定容至10mL即可得到内标的混合工作液(10μg/mL)。取干 净衍生化小瓶，加入50μL混合内标乙酸乙酯溶液(烟碱-d₃、可替宁-d₃和反3′-羟基可 替宁-d₃的浓度为10μg/mL)和250μL BSTFA，然后加入系列烟碱及其代谢物混合工作液 配制成浓度(ng/mL)为2.0，5.0，10.0，50.0，100.0，500.0，1000.0，5000.0的标准溶 液，再进行GC-MS检测。以被测物的峰面积与其内标的峰面积的比值(Y)对稀释后的空白 尿液中被测物的浓度(X)进行线性回归，求得各种代谢物的标准曲线，见表2。

表2各检测物的线性方程、线性范围、相关系数、检测限

注：①烟碱及其糖苷以烟碱-d₃作内标，可替宁及其糖苷、降烟碱、降可替宁、可替宁 氮氧化物、烟碱氮氧化物以可替宁-d₃做为内标，反3′-羟基可替宁及其糖苷的内标为反3′ -羟基可替宁-d₃；

检测限：以信噪比S/N＝3对应浓度确定检出限，结果如表2所示；

精密度与回收率：取空白尿液加入检测物的标准溶液，制备高、中、低3种不同浓度的 质控样品，其中烟碱、可替宁和反3′-羟基可替宁的3种浓度约为1000、150、10ng/mL， 降可替宁的3种浓度约为500、150、10ng/mL。按照上述方法进行前处理操作。高、中、低 3个浓度的质控样品，每个浓度6份样品同日内检测，得回收率和日内相对标准偏差。每日 每个浓度检测6份样品，连续测定3d，得日间相对标准偏差(表4.4)。由此看出，检测物 高、中、低3个水平的精密度(RSD)在5.8％-9.6％之间，回收率在89.9％-103.5％之间。

稳定性实验：取空白尿液，配制低、中、高这3种浓度(10、250、1000ng/mL)的质控 样品。分别于室温和-40℃放置24h，然后按上文的条件进行前处理和衍生化，进样检测， 评价室温下的稳定性。同样，配制上述3种浓度的尿样，按上文的条件对其进行前处理和衍 生化后在室温下放置24h，然后进行GC-MS检测，评价室温状态下衍生物的稳定性。测定结 果显示，24h内烟碱及其代谢物在室温和-40℃都很稳定；室温下降可替宁和反3′-羟基可 替宁的衍生物在24h内也很稳定。

测定结果：将样品测定的检测物实际面积与内标峰面积比，与相应得线性回归方程进行 拟各，计算出检测物的含量见表3。

表3  10名吸烟者尿液中的烟碱及其3种代谢物的浓度

  尿样   烟碱(ng/mL)   可替宁(ng/mL)   反3′-羟基可替宁(ng/mL)   降可替宁(ng/mL)   1#   248.0   300.1   452.0   28.2   2#   354.8   950.2   3040.0   102.8   3#   746.0   701.5   1072.0   80.8   4#   544.0   1092.2   1236.0   76.4   5#   238.0   114.9   164.0   23.1   6#   464.0   839.2   2348.0   75.6   7#   836.0   1491.8   5840.0   102.4   8#   1276.0   595.0   1428.0   53.6   9#   580.0   1274.3   880.0   17.2   10#   187.2   131.3   366.4   18.3