一种用于蛋白质组学研究的液滴微系统

摘要

本发明属于蛋白质组学技术领域，具体为一种用于蛋白质组学研究的液滴微系统。该液滴微系统可与蛋白分离装置在线联用，将已分离的蛋白样品与蛋白酶溶液混合后，利用微体系液滴生成技术将蛋白样品和与之互不相溶的油相在微通道中形成油包水液滴。液滴反应既能短时间内达到常规蛋白质酶解的效率，又能避免记忆效应和交叉污染。微反应器末端设有喷头可直接进行电喷雾质谱检测，该反应器实现了蛋白质组学研究技术路线的快速化、自动化和集成化，从而提高效率、节省成本，为蛋白质组学研究提供更详细、更全面的蛋白信息。

说明书

技术领域  

本发明属于蛋白质组学技术领域，具体涉及一种液滴微反应体系。

背景技术  

蛋白质组学(proteomics)是研究在特定时间或环境下某个细胞或某种组织的基因组表达的全部蛋白质。蛋白质组学的真正含义在于：它不是按照传统的方式孤立地研究某种蛋白质分子的功能，而是应用各种蛋白质组学技术研究某种蛋白质在复杂的细胞环境中的功能。蛋白质组研究的技术已被用于生命科学领域，如生物学、神经生物学等。在研究对象上包括了各类从简单到复杂的生物体，以及各种生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等。在应用方面，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。在对癌症等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质组学也具有广泛的应用前景。

蛋白质组学研究主要依赖于蛋白质组学研究技术的发展。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难，不仅氨基酸残基种类远多于核苷酸残基，而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰，给分离和分析蛋白质带来很多困难。另外，蛋白质组学的研究是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的分离和分析，所以，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的努力方向。现如今蛋白质组学研究主要依赖的技术有蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术、蛋白质相互作用分析技术及生物信息学技术。蛋白质常用的分离技术有双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱、毛细管电泳等；蛋白质的鉴定技术有化学降解法（完全水解和Edman降解法）、质谱法。

在众多的蛋白质组学研究方案中，可以归纳为三种技术路线：Top-Down技术路线、Short-Gun技术路线、上述两种路线相结合的技术路线。Short-Gun技术又称为Bottom-Up技术，是首先把蛋白样品酶解成肽段，然后进行分离，再进行串级质谱分析和数据搜库来鉴定蛋白。尽管此方法提供了一个简单直接并高度自动化的蛋白质鉴定方法，但是大量酶解产物的分离不但对色谱提出了挑战性的要求，并且在分离过程中高丰度的肽段会掩盖低丰度蛋白的酶解肽段，从而造成重要信息的丢失。所以，研究表明在Bottom-Up 技术中对复杂蛋白样品先进行分离再依次酶解、鉴定非常必要。但是现有传统方法大多采用离线的方式对分离后的蛋白进行酶解，这不仅对蛋白样品造成污染和损失，也增加了工作负担，使工作效率大大降低。目前，蛋白质组学研究的任务还很艰巨，发展一种有效的蛋白在线分离、酶解、鉴定技术对提高蛋白组学的研究效率、降低研究成本将是蛋白质组学研究技术领域的一大挑战。其中限制在线技术发展的一大技术问题是如何将分离后的蛋白自动化、快速、无交叉污染地收集并快速酶解成可鉴定的肽段，并用于质谱的鉴定。

因此,本发明设计了一种液滴微反应器，可与分离技术和电喷雾质谱技术相联用，实现分离蛋白质的快速、高通量酶解,有效避免交叉污染,以实现蛋白质组学研究中在线蛋白质分离、酶解、鉴定技术方案的自动化和高通量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可与多种蛋白分离技术和电喷雾质谱相联用，实现分离蛋白质的快速、高通量酶解,而且避免交叉污染,从而实现蛋白质组学研究的自动化和高通量的液滴微系统。  

本发明提供的液滴微系统，包括蛋白分离装置、液滴微反应器、电喷雾喷头、温度控制装置和蛋白鉴定装置，其中，液滴微反应器与蛋白分离装置连接，使已分离的蛋白与蛋白酶溶液混合，并在微液滴反应器中反应，由温度控制装置来控制反应温度，电喷雾喷头进行酶解肽段的电喷雾质谱鉴定。

本发明中，所述的液滴微反应器可以是一种微流控芯片，该微流控芯片上设有微反应通道，并具有油相入口、蛋白溶液进口、蛋白酶溶液进口、pH值调节口和电喷雾喷头连接口。由蛋白分离装置分离的蛋白溶液通过蛋白溶液进口，蛋白酶溶液通过蛋白酶溶液进口，进入微反应通道，利用十字聚焦技术在芯片的十字交叉口处，2者的混合液与从油相入口进入的油相形成微液滴，并在微流控芯片的微反应通道内反应；温度控制装置控制反应温度，使液滴酶解反应顺利进行，在芯片的出口处通过电喷雾喷头连接口接入电喷雾喷头，直接进行酶解肽段的电喷雾质谱鉴定。

本发明中，所述蛋白分离装置可以是液相色谱，也可以是毛细管电泳，但不限于这几种。

本发明中，所述电喷雾喷头可以直接集成在微流控芯片上，也可以通过管路将液滴引出后进行喷雾。 

本发明中，所述温度控制装置可以是红外，或导热陶瓷，但不限于这几种。

本发明中，所述液滴微反应器装置可以由聚二甲基硅氧烷(PDMS)，玻璃，聚对苯二甲酸乙二醇酯材料所制，并且不限于这几种。 

本发明中，所述液滴微反应器装置可以是微流控芯片，毛细管，但不限于这几种。

本发明中，所述液滴生成方法可以是十字聚焦法，但不限于这种生成方法。

本发明中，所述用于形成液滴的油相可以是十六烷，石蜡，油酸，全氟萘烷等与水不互溶的液体，但不限于这几种。 

本发明中，所述电喷雾喷头可以采用毛细管、不锈钢等材质制作，但不限于这几种。

本发明中，所述油相中可以添加span 80等表面活性剂；微反应通道可以进行十七氟癸基三乙氧基硅烷化修饰，以便能更好的生成液滴。

在某些具体的实施方式中，本发明还涉及：1）微流控芯片的设计：液体进入的方式，液滴形成的方式，微通道的尺寸，修饰方法以及溶液的出口检测；2）微流控芯片的制作，包括选择芯片的材质，电喷雾喷嘴的材质；3）温度控制装置的选择；4）系统的集成，液滴微反应体系与分离体系和质谱鉴定体系相联进行在线的蛋白质组学研究。

附图说明

图1一种用于蛋白质组学研究技术的液滴微系统示意图。

图2 微流控芯片液滴反应器示意图。

图中标号，1 为玻璃基底 2 为聚二甲基硅氧烷(PDMS)盖片， 3 为油相入口，4为分离蛋白溶液入口，5为蛋白酶溶液入口，6为微反应通道，7为pH调解口，8为电喷雾喷头，9为温度控制装置。

具体实施方式

利用AutoCAD软件绘制微芯片的图形，用高分辨率激光照排机在照相底片上绘得光刻掩膜。然后，在硅片上甩一层SU-8光刻负胶，并对其进行高温固化处理，之后盖上掩膜，在光刻机上对固化后的SU-8负胶进行曝光。最后，在用SU-8负胶显影液显影，定影后制作成微流控芯片模具。聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚体和PDMS固化剂按比例10：1混合均匀，抽气后将其浇注在制作好的模具上，在80℃的烘箱中放置2-3小时进行固化。将固化好的PDMS取下后在进样口和流出口处打孔，再与干净的玻璃片1同时放在等离子体环境下1-2分钟，取出后将带有图案的PDMS芯片2与玻璃片1封接。芯片粘合后，在通道表面等离子体存在的情况下，立即在芯片通道中通入十七氟癸基三乙氧基硅烷化试剂，使芯片表面硅烷化处理，从而有良好的疏水性，可以有效避免有机试剂的浸润。在微芯片十字交叉部分的尺寸分别为50μm和100μm,反应部分微通道的尺寸为250μm,在芯片的出口端集成了尺寸为外径200μm.内径100μm的不锈钢喷针，可以用来加高电压进行电喷雾。

液相色谱使用C4反相色谱柱子进行蛋白分离，流速为2μL/min，将色谱流出的溶液接入入口4，入口5用注射泵通入与蛋白比例为1:20的trypsin蛋白酶溶液（60mmolNH₄HCO₃溶解）流速也为2μL/min，入口3选择使用全氟萘烷，流速为300μL/h，在十字交叉部位形成液滴。利用红外加热装置控制芯片温度在37℃左右，液滴经过微通道在pH调解口7处与50%乙腈, 1%甲酸溶液混合，调解液滴的pH为4左右，在电喷雾喷头8处进行电喷雾质谱检测，所得的质谱数据经过数据库搜索即可得出相应的蛋白质组学数据。