利用电化学手段测试抗菌不锈钢耐微生物腐蚀性能的方法

摘要

本发明涉及材料科学和微生物科学两个领域，属于交叉学科范畴，具体为一种利用电化学手段测试抗菌不锈钢耐微生物腐蚀性能的方法。利用电化学手段测试抗菌不锈钢与细菌作用不同时间后的耐微生物腐蚀情况，可用于评价抗菌不锈钢的耐微生物腐蚀性能。本发明利用电化学手段测试奥氏体抗菌不锈钢与细菌作用不同时间后的开路电位、电化学阻抗以及极化曲线，从而评价抗菌不锈钢的耐微生物腐蚀性能。本发明可解决在干燥、深海等环境中无法对抗菌不锈钢耐微生物腐蚀性能进行测试等问题，旨在更加可靠和便捷地检测抗菌不锈钢的耐微生物腐蚀性能。

说明书

技术领域

本发明涉及材料科学和微生物科学两个领域，属于交叉学科范畴，具体为一 种利用电化学手段测试抗菌不锈钢耐微生物腐蚀性能的方法，是利用电化学手段 测试抗菌不锈钢与细菌作用不同时间后的开路电位、电化学阻抗以及极化曲线的 变化，进而评价抗菌不锈钢耐微生物腐蚀性能的方法。

背景技术

不锈钢由于具有优异的机械性能、耐蚀性能和加工性能，广泛应用于各种海 洋工程中。当环境中的氧化性足够强时，不锈钢的表面不仅能生成钝化膜，而且 钝化膜的任何破损都能迅速自身修复。由于海水中溶有氧，为不锈钢建立钝化状 态提供了氧化条件，但海水中存在的大量微生物对钝化膜的破坏也是十分强烈的， 这就决定了大多数不锈钢在海水中只能建立不稳定的钝化状态。有研究表明，尽 管不锈钢表面存在着一层钝化膜，但并不能免于微生物腐蚀。随着不锈钢在工业 中的广泛应用，其微生物腐蚀越来越受到广泛关注。特别是20世纪80年代，英 美等国相继成立了专门的微生物腐蚀研究机构，研究的材料除碳钢外还扩大到不 锈钢等材料。不锈钢由于具有良好的耐蚀性能及综合机械性能而常用于一些重要 部件，但在微生物的影响下，其焊接焊缝及热影响区常会发生腐蚀破坏，从而影 响了其广泛应用。

随着人们对健康及环保意识的增强，具有强烈、持久和广谱杀菌作用的含铜 抗菌不锈钢已引起了人们愈来愈多的关注。由于抗菌不锈钢兼具结构材料和抗菌 功能材料的双重特点，因而研究和探讨抗菌不锈钢的耐微生物腐蚀性能具有重要 的应用和理论价值。

《2006年全国腐蚀电化学及测试方法学术会议论文集》提及的抗菌处理含铜 铁素体不锈钢耐微生物腐蚀性能的研究(秦丽雁等)，采用稳态阳极极化曲线、恒 电位开路衰减响应等多种电化学测试技术以及微生物学方法研究了抗菌处理含铜 铁素体不锈钢在含有培养基的嗜氧菌溶液中的耐蚀性能。研究结果表明，不锈钢 的腐蚀电位E_corr随嗜氧菌的新陈代谢呈现规律性地变化，随时间的增加而负移。 在菌液中抗菌不锈钢的点蚀击穿电位E_b比普通不锈钢正170mV。不锈钢恒电位 开路衰减的测量结果也表明，抗菌处理使不锈钢在菌液中钝化膜的稳定性得到改 善，抗菌不锈钢比普通不锈钢更耐微生物腐蚀。其不足之处在于：该研究的测试 数据没有表明细菌是在最适宜的培养条件(培养温度35～37℃)下进行电化学性 能测试，没有反应出细菌的最佳生长状态，不能客观准确地对比两种不锈钢的耐 腐蚀性能。另外，研究中如果采用电化学阻抗测试的方法，就能够保证待测样品 的表面不受破坏，更能真实地反应出细菌生物膜随不同时间在样品表面上的变化 情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用电化学手段测试抗菌不锈钢耐微生物腐蚀性 能的方法，解决在干燥、深海等环境中无法对抗菌不锈钢耐微生物腐蚀性能进行 测试等问题，旨在更加可靠和便捷地检测抗菌不锈钢的耐微生物腐蚀性能。

本发明的技术方案是：

一种利用电化学手段测试抗菌不锈钢耐微生物腐蚀性能的方法，利用电化学 手段获得抗菌不锈钢与细菌作用不同时间后的开路电位、电化学阻抗以及极化曲 线，进而评价抗菌不锈钢材料的耐微生物腐蚀性能。需要指出的是，在电化学测 试过程中，材料的开路电位、腐蚀电位以及极化电阻的数值越高，其耐微生物腐 蚀性能越强。

1、实验材料的制备

用线切割方法分别制备出尺寸为10×10×3mm的抗菌不锈钢和普通不锈钢样 品，洗净、去脂，用铜导线一端固定在样品表面，然后用环氧树脂冷镶，另一端 导线露出。待环氧树脂干燥后，样品经打磨、抛光后露出另一端表面，用丙酮溶 液超声清洗，放置于紫外灯下灭菌20～40分钟，备用。

2、菌悬液的制备

用装有新鲜斜面的试管将细菌培养至对数生长期后，加入4～6ml的8～9wt‰ 的生理盐水溶液，用接种环刮下斜面细菌，采用比浊法将菌悬液逐级稀释成4～6 ×10⁶cfu/ml的菌液。

采用的细菌为大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。

3、抗菌不锈钢与细菌的作用

将制备好的不锈钢样品放置于装有4～6×10⁶cfu/ml菌液的烧杯中，并浸没其 中，铜导线的另一端露在烧杯外，将烧杯密封好，放置于35～37℃的水浴中，培 养2～14天。

4、作用后的开路电位

将工作电极(不锈钢样品)、对电极(Pt电极)以及参比电极(KCl饱和甘汞 电极)接好后，开通电化学设备电源，打开V3-Studio软件，选择开路电位的测 试步骤，开路电位的测试时间定为0.5～2小时。

5、作用后的电化学阻抗

选择恒电位(potentiostatic)的测定模式，阻抗的范围设为0.01～100000Hz， 获得阻抗的Nyquist曲线。

6、作用后的极化曲线

选择动电位-极化曲线的测定模式，腐蚀电位的范围设为-0.4～0.6mV，扫描速 率为0.4～0.6mV/秒。

本发明的有益效果是：

1、本发明采用电化学手段，通过测试抗菌不锈钢与细菌作用不同时间后的开 路电位、电化学阻抗和极化曲线结合使用的方式，进而评价被测材料的耐微生物 腐蚀性能。需要特别说明的是，采用电化学阻抗测试，主要在于其能够利用小幅 信号并且在最低限度地影响被测样品属性的前提下，客观和准确地获得样品表面 细菌生物膜的变化规律，为发展耐微生物腐蚀的不锈钢新材料提供更加可靠和便 捷的检测新方法。

2、本发明提供了一种利用电化学手段测试抗菌不锈钢耐微生物腐蚀性能的方 法，该方法测定灵敏度高，可以对不同材料或者与同一材料作用的不同菌株进行 测试。该方法具有操作简便、快捷等特点。

附图说明

图1(a)-(b)为实施例1中抗菌不锈钢和普通不锈钢与大肠杆菌作用不同 时间后的开路电位曲线，其中，图1(a)为2天；图1(b)为14天。

图2(a)-(b)为实施例1中抗菌不锈钢和普通不锈钢与大肠杆菌作用不同 时间后的电化学阻抗曲线，其中，图2(a)为2天；图2(b)为14天。

图3(a)-(b)为实施例1中抗菌不锈钢和普通不锈钢与大肠杆菌作用不同 时间后的极化曲线，其中，图3(a)为2天；图3(b)为14天。

图4为实施例2中抗菌不锈钢和普通不锈钢与大肠杆菌作用14天后的开路电 位曲线。

图5为实施例2中抗菌不锈钢和普通不锈钢与大肠杆菌作用14天后的电化学 阻抗曲线。

图6为实施例2中抗菌不锈钢和普通不锈钢与大肠杆菌作用14天后的极化曲 线。

具体实施方式

实施例1：

本发明选用大肠杆菌(ATCC25922)作为菌种代表，材料选用中国科学院金 属研究所研制的含铜奥氏体抗菌不锈钢和普通304奥氏体不锈钢(对照不锈钢)。 通过不锈钢与细菌接触不同时间后的开路电位、电化学阻抗以及极化曲线的情况 来评价抗菌不锈钢耐微生物腐蚀性能，抗菌不锈钢和对照不锈钢的化学分析成分 见表1。

表1抗菌不锈钢和普通不锈钢的化学分析成分(w.t.％)

本发明采用的细菌为大肠杆菌，由中国普通微生物菌种保藏中心提供。

1、样品的制备

用线切割方法分别制备出尺寸为10mm×10mm×3mm的抗菌不锈钢和普通不 锈钢样品，洗净、去脂，用铜导线一端固定在样品表面，然后用环氧树脂冷镶， 另一端导线露出，待环氧树脂干燥后，样品经打磨、抛光后露出另一端表面，用 丙酮溶液超声清洗，放置于紫外灯下灭菌30分钟，共6组样品，备用。

2、菌悬液的制备

用装有新鲜斜面的试管将细菌培养至对数生长期后，加入5ml的8.5wt‰的生 理盐水溶液，用接种环刮下斜面细菌，采用比浊法将菌悬液逐级稀释成5× 10⁶cfu/ml的菌液。

3、抗菌不锈钢与细菌的作用

将制备好的不锈钢样品放置于装有5×10⁶cfu/ml菌液的烧杯中，并浸没其中， 铜导线的另一端露在烧杯外，将烧杯密封好，放置于37℃的水浴中，培养2～14 天。

4、作用后的开路电位

将工作电极(不锈钢样品)、对电极(Pt电极)以及参比电极(KCl饱和甘汞 电极)接好后，开通电化学设备电源，打开V3-Studio软件，选择开路电位的测 试步骤，开路电位的测试时间定为1小时。图1(a)-(b)为抗菌不锈钢和普通 不锈钢与大肠杆菌作用不同时间后的开路电位。从图1(a)-(b)可以看出，抗 菌不锈钢与细菌作用2～14天后的开路电位变动范围为-0.17～-0.15V，明显高于普 通不锈钢的开路电位变动范围-0.24～-0.47V，表明普通不锈钢表面的钝化膜更容易 被细菌腐蚀。

5、作用后的电化学阻抗

选择potentiostatic的测定模式，电化学阻抗的测试范围设为0.01～100000Hz。 图2(a)-(b)为抗菌不锈钢和普通不锈钢与大肠杆菌作用不同时间后的Nyquist 曲线。从图2(a)-(b)可以看出，抗菌不锈钢与细菌作用2～14天后的极化电 阻变动范围为43～152kΩ，而普通不锈钢极化电阻的变动范围为14～60kΩ，表明 普通不锈钢表面的钝化膜更容易发生点蚀现象。

6、作用后的极化曲线

选择动电位-极化曲线的测定模式，腐蚀电位的范围设为-0.4～0.6mV，腐蚀速 率为0.5mV/秒。图3(a)-(b)为抗菌不锈钢和普通不锈钢与大肠杆菌作用不 同时间后的极化曲线。从图3(a)-(b)可以看出，抗菌不锈钢与细菌作用2～14 天后的腐蚀电位变动范围为-0.32～-0.23V，而普通不锈钢的腐蚀电位变动范围为 -0.51～-0.29V，表明抗菌不锈钢比普通不锈钢具有更加优异的耐细菌腐蚀性能。

以上电化学测试结果表明，抗菌不锈钢与大肠杆菌作用2～14天后，开路电 位变动范围为-0.17～-0.15V，极化电阻的变动范围为43～152kΩ，腐蚀电位的变动 范围为-0.32-0.23V，均明显高于普通不锈钢，耐微生物腐蚀能力比普通不锈钢显 著增强，表明抗菌不锈钢具有优异的耐微生物腐蚀性能。

另外，本发明方法可适用于中国发明专利申请(申请号：201010238697.8， 发明名称：一种抗菌不锈钢及其热处理方法和应用)中提到的抗菌不锈钢。

实施例2：

与实施例1不同之处在于：

本实施例中，抗菌不锈钢的主要成分为(wt)％：

C：0.04，Cr：15.30，Ni：1.18，Mn：10.78，Si：0.59，N：0.21，Cu：2.77， 其余为Fe。

上述抗菌不锈钢按常规方法制备如下：

(1)在真空冶炼炉中进行抗菌不锈钢冶炼，1480℃精炼20分钟后，进行磁 力搅拌后浇铸成铸锭；

(2)1150℃保温2小时均匀化退火后，将铸锭锻造成棒状或者块状试样。

上述抗菌不锈钢的热处理工艺为：

在1040℃保温0.5h，使钢中的铜能充分固溶于基体中，空冷至室温后，使钢 中的铜处于过饱和状态。然后在700℃保温6h，使过饱和的铜从钢中析出足够量 的富铜相，最后空冷至室温。

本发明采用的细菌为大肠杆菌，由中国普通微生物菌种保藏中心提供。

1、样品的制备

用线切割方法分别制备出尺寸为10mm×10mm×3mm的抗菌不锈钢和普通不 锈钢样品，洗净、去脂，用铜导线一端固定在样品表面，然后用环氧树脂冷镶， 另一端导线露出。待环氧树脂干燥后，样品经打磨、抛光后露出另一端表面，用 丙酮溶液超声清洗，放置于紫外灯下灭菌30分钟，共3组样品，备用。

2、菌悬液的制备

用装有新鲜斜面的试管将细菌培养至对数生长期后，加入5ml的8.5wt‰的生 理盐水溶液，用接种环刮下斜面细菌，采用比浊法将菌悬液逐级稀释成4× 10⁶cfu/ml的菌液。

3、抗菌不锈钢与细菌的作用

将制备好的不锈钢样品放置于装有4×10⁶cfu/ml菌液的烧杯中，并浸没其中， 铜导线的另一端露在烧杯外，将烧杯密封好，放置于35℃的水浴中，培养14天。

4、作用后的开路电位

将工作电极(抗菌不锈钢样品)、对电极(Pt电极)以及参比电极(KCl饱和 甘汞电极)接好后，开通电化学设备电源，打开V3-Studio软件，选择开路电位 的测试步骤，开路电位的测试时间定为1小时，测定抗菌不锈钢和普通不锈钢与 大肠杆菌作用不同时间后的开路电位。由图4可以看出，抗菌不锈钢与细菌作用 14天后的开路电位为-0.03V，明显高于普通不锈钢的开路电位为-0.06V，表明普 通不锈钢表面的钝化膜更容易被细菌腐蚀。

5、作用后的电化学阻抗

选择potentiostatic的测定模式，电化学阻抗的测试范围设为0.01～100000Hz， 测定抗菌不锈钢和普通不锈钢与大肠杆菌作用不同时间后的阻抗。由图5可以看 出，抗菌不锈钢与细菌作用14天后的极化电阻为328kΩ，而普通不锈钢极化电 阻为118kΩ，表明普通不锈钢表面的钝化膜更容易发生点蚀现象。

6、作用后的极化曲线

选择动电位-极化曲线的测定模式，腐蚀电位的范围设为-0.4～0.6mV，腐蚀速 率为0.5mV/秒。根据抗菌不锈钢和普通不锈钢与大肠杆菌作用不同时间后的极 化曲线可以看出，抗菌不锈钢与细菌作用14天后的腐蚀电位为-0.25V，而普通不 锈钢的腐蚀电位为-0.31V，表明抗菌不锈钢比普通不锈钢具有更加优异的耐细菌 腐蚀性能，如图6所示。

以上电化学测试结果表明，抗菌不锈钢与大肠杆菌作用14天后，开路电位为 -0.03V，极化电阻为328kΩ，腐蚀电位为-0.25V，均比普通不锈钢的对应值高， 耐微生物腐蚀能力明显比普通不锈钢增强，细菌在其表面大幅度减少，表明抗菌 不锈钢具有优异的耐微生物腐蚀性能。

实施例结果表明，本发明利用电化学手段测试奥氏体抗菌不锈钢与细菌作用 不同时间后的耐微生物腐蚀情况，进而判断出抗菌不锈钢材料的耐微生物腐蚀性 能。本发明利用电化学手段测试奥氏体抗菌不锈钢与细菌作用不同时间后的开路 电位、电化学阻抗以及极化曲线来评价抗菌不锈钢的耐微生物腐蚀性能，是一种 可靠、便捷的抗菌不锈钢耐微生物腐蚀性能检测方法。