用增强代谢活性的丹参衍生物治疗肥胖和代谢综合症

摘要

本发明涉及用增强代谢活性的丹参衍生物治疗肥胖和代谢综合症，所述组合物含有作为有效成分的丹参酮衍生物，更具体地，所述组合物含有在提高代谢活性中表现出较高活性的作为有效成分的丹参酮衍生物。

说明书

本申请为国际申请PCT/KR2004/003546于2006年6月29日进入 中国国家阶段、申请号为200480039408.4、发明名称为“用增强代谢 活性的丹参衍生物治疗肥胖和代谢综合症”的分案申请。

技术领域

本发明涉及预防和治疗代谢综合症的组合物，所述组合物含有作 为有效组分的丹参酮衍生物。更具体地，本发明涉及预防和治疗代谢 综合症的组合物，含有作为有效成分，在提高代谢活性中表现出优良 活性的丹参酮衍生物。

背景技术

代谢综合症是指包括健康危险因子，例如高甘油三酯血症，高血 压，糖代谢紊乱，血凝紊乱和肥胖的综合症。代谢综合症本是并不是 致命的，但却指示了对诸如糖尿病和缺血性心血管疾病的严重疾病的 倾向，并演变成了现代人群众最具威胁性的疾病。由于缺乏对这种综 合症的病因的了解，代谢综合症一度是通过包括综合症X的多种其他 名称为人所知的，通过由WHO和NIH国立心脏，肺和血液研究所实 施的成年治疗计划III(Adult Treatment Plan ATP III)，现将其正式地称为 代谢综合症或抗胰岛素综合症。

由国立胆固醇教育计划(NCEP)专家委员会对成年人中高血液胆固 醇(成年治疗委员会III)的测定、评估和治疗的第三次报告在2001年公 开的建议标准，是最近和最广泛地用于诊断所述代谢综合症的标准。 根据所述ATP III的标准，可通过以下三种或更多种成分的存在诊断个 体患有代谢综合症：1)男人的腰围为40英寸(102cm)或更多，女人的腰 围为35英寸(88cm)或更多(通过腰部周长测定中度肥胖)，2)甘油三酸酯 水平高于150mg/dl，3)高密度脂蛋白水平(HDL)低于40mg/dl(男人)或 50mg/dl(女人)，4)血压130/85mm Hg或更高和5)快速血液葡萄糖(糖) 水平高于110mg/dl。对东方人而言，可将中度肥胖的标准略微调节成 男人的腰围为90cm或更多，而女人的腰围为80cm或更多。近来的研 究表明，在这些条件下，大约25％的韩国人都患有代谢综合症。胰岛 素耐受是指这样的现象，其中即使胰岛素正常体内分泌，胰岛素也不 能诱导对细胞的足量葡萄糖供给。因此，血液中的葡萄糖不能进入细 胞，由此引起了高血糖症，细胞由于缺乏葡萄糖不能行使正常功能， 导致了代谢综合症的出现。

目前，还没有可用的药物治疗代谢综合症。已使用过治疗糖尿病、 高血脂症和高血压的药物进行过治疗代谢综合症的尝试，但这些药物 在治疗代谢综合症中的药物作用有限。作为目前可用的药物，可用于 治疗糖尿病的二甲双胍，属于TZD(噻唑烷二酮类)家族的药物，葡萄糖 苷酶抑制剂，双PPARγ/α激动剂和DDP(二肽基肽酶)IV抑制剂，其受 到了作为最有希望治疗代谢综合症药物的极大关注。此外，还有大量 的关注致力于作为抗血压药和抗高血脂症药，以及CETP(旦固醇酯转 运蛋白)抑制剂的靶的apo A-I及其相关肽的异构体。

公知的直接或间接与代谢综合症的病因和治疗相关的因素包括物 理锻炼，饮食习惯和类型，体重，血液葡萄糖，甘油三酸酯水平，胆 固醇水平，胰岛素耐受，adiponectin，瘦蛋白，AMPK活性，诸如雌激 素的性激素，遗传因素和体内丙二酰CoA浓度。

目前，对抗与代谢综合症相关病症的最有效方法是多作锻炼，减 肥和饮食控制。目前所有对抗代谢综合症方法的共同之处在于促进能 量代谢，由此导致体内多余能量的最大消耗从而阻止能量积累。由于 从加工食品和快餐中摄取的高卡路里，与不充分的锻炼相比，多余能 量以脂肪的形式进行了累积，并由此变成了包括代谢紊乱的多种疾病 的根本原因。有效的消除这些多余能量可考虑作为治疗代谢紊乱的方 法。提高代谢活性对有效地消除多余能量至关重要。出于这一目的， 一般认为必须抑制脂肪合成，抑制糖原异生，协助葡萄糖消耗，协助 脂肪氧化，协助能量代谢中心细胞器线粒体的生物发生，以及活化参 与代谢活化的因子。与促进代谢相连的活化因子包括，例如，AMP-活 化的蛋白激酶(AMPK)，过氧物酶体扩增子活化受体γ共活化剂 1α(PGC-1α)，葡萄糖转运蛋白1和4(GLUT 1和4)，肉毒碱棕榈酰基转 移酶I(CPT I)，解偶联蛋白1，2和3(UCP-1，2和3)，以及乙酰-CoA羧 化酶I和II(ACC I和II)，其在能量代谢中具有重要作用。

这些因子在与代谢紊乱的能量代谢中具有以下主要功能。

1、糖代谢

在肌肉组织和心肌组织中，AMPK促进肌肉收缩并因此协助葡萄 糖的摄取，其依次活化了GLUT 1，或诱导GLUT 4向质膜的迁移，而 不考虑胰岛素的作用，从而导致了葡萄糖向细胞的输送增加(Arch. Biochem.Biophys.380，347-352，2000，J.Appl.Physiol.91，1073-1083， 2001)。在葡萄糖摄入增加之后，AMPK可激活已糖激酶，由此增加糖 代谢处理的流量并同时抑制糖原合成。众所周知在缺血性条件下，在 心肌组织中，AMPK能通过磷酸化过程活化6-磷酸果糖-2-激酶 (PFK-2)，由此导致代谢级联的激活从而增加了糖代谢的流量(Curr.Biol. 10，1247-1255，2000)。此外，在肝脏中AMPK的活化抑制了葡萄糖从肝 细胞中的释放。与此同时，现已确定用作糖异生用酶的磷酸烯醇丙酮 酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶可被AMPK所抑制(Diabetes 49， 896-903，2000)，说明无论是否存在胰岛素，AMPK都可独立地抑制葡 萄糖从肝脏中的释放，由此参与血糖水平的调控。

2、线粒体的生物生成

线粒体的一个重要功能是进行氧化磷酸化，其可将从诸如葡萄糖 和脂肪酸的燃料代谢物产生的能量转化成ATP。功能性的线粒体变化 会影响到与衰老相关的退行性疾病，例如糖尿病，心血管疾病，帕金 森氏症和老年性痴呆的发病机制(Curr.Opin.Cell Biol.15，706-716， 2003)。Peterson等人(Science 300，1140-1142，2003)报道了线粒体的氧 化磷酸化功能在老年人中降低了约40％，暗示了线粒体功能的削弱很 可能是胰岛素耐受综合症的致病原因。Lee等人(Diabetes Res.CLin. Pract.42，161-167，1998)证实了在外周血中线粒体DNA含量的降低发 生在糖尿病之前。公知在肌肉中线粒体的生物生成可由适应反应得以 提高，其中肌肉细胞中氧化磷酸化的代谢活性是由持续的能量消耗和 锻炼提高的。

同时，公知过氧物酶体扩增子活化的受体γ共活化剂1α(PGC-1α) 是促进核DNA转录的共活化剂，并且在葡萄糖代谢，线粒体生物生成， 肌肉纤维特化和适应性生热作用中具有重要功能。已知PGC-1α的较高 表达促进线粒体DNA拷贝数的升高和线粒体增殖(Cell，98，115-124， 1999)。

需要注意的是在小鼠模型中UCP-2和UCP-3的过量表达导致了脂 肪细胞数量的降低，代谢率升高和氧气消耗的升高，因此UCP-2和 UCP-3在能量代谢和肥胖控制中具有重要的作用(Nutrition，20，139-144， 2004)。

3、脂肪代谢的控制

在涉及AMPK参与的脂肪代谢的机理中，公知AMPK能够诱导乙 酰-CoA羧化酶的磷酸化，结果抑制脂肪酸的合成，因此导致作为脂肪 酸合成过程中的中间体和作为肉毒碱棕榈酰基转移酶I(CPT I)抑制剂 的丙二酰Co-A在细胞内的浓度降低，从而增强了脂肪酸氧化。CPT I 是在脂肪酸进入线粒体和被氧化过程中的关键酶，并公知受到丙二酰 Co-A细胞内浓度的调控。此外，公知AMPK能够通过磷酸化对参与胆 固醇和三酰甘油合成过程中的HMG-CoA还原酶和甘油磷酸酰基转移 酶(GPAT)的活性进行抑制(J.Biol.Chem.277，32571-32577，2002，J. Appl.Physiol.92，2475-2482，2002)。与此同时，还发现在肝脏中AMPK 的活化通过糖反应元件结合蛋白(ChREBP)的磷酸化抑制了丙酮酸激 酶、脂肪酸合成酶和ACC的活性(J.Biol.Chem.277，3829-3835，2002)。

如上所述，与代谢相关的活化剂公知地在体外和体内葡萄糖、蛋 白和脂肪能量代谢中具有中心的作用。Neil等人(Nature drug discovery， 3(April)，340，2004)证实了AMPK和丙二酰Co-A是治疗代谢综合症和 治疗患有具有胰岛素耐受、肥胖、高血压、血脂异常、胰腺β细胞功 能紊乱，II型糖尿病和动脉硬化表现的代谢综合症的患者的靶点。可假 定与多种异常相连的共有特征是AMPK/丙二酰CoA燃料感应和信号网 络的调控异常。一般认为这样的调控异常导致了细胞脂肪酸代谢的改 变，其随后引起了异常的脂肪积累、细胞功能紊乱和最终的疾病。已 有证据表明，活化AMPK和/或降低丙二酰CoA水平的因子能够逆转 这些异常和综合症，或预防它们发生。

Genevieve等人(J.Biol.Chem.279，20767-74，2004)报道了AMPK 的活化抑制了iNOS酶的活性，其是在慢性炎症病症或包括与肥胖相关 的糖尿病的内毒素休克中的炎症介质，并因此可有效地用来开发具有 提高胰岛素敏感性的机理的新药。此外，他们还报道了对iNOS活性的 抑制是由AMPK的活化造成的，因此这一发现对诸如败血病、多发性 硬化、心肌梗塞、炎性肠病和胰腺β-细胞功能紊乱的疾病具有临床应 用性。Zing-ping等人(FEBS Letters 443，285-289，1999)报道了AMPK通 过磷酸化，在存在Ca-调钙蛋白的大鼠肌肉细胞和心肌细胞中活化了内 皮NO合成酶。这说明AMPK与包括心绞痛的心脏疾病相关。Alan D 等人(Nature genetics，34(3)，244，2003)证明了肌肉线粒体呼吸代谢是 由衰老或糖尿病降低的，由此导致了在所述氧化磷酸化过程中所涉及 到的基因表达的协同改变，同时他们还报道了PGC-1α主导了基因表达 的这种改变。Mary等人(PNAS 100，8466，2003)报道了PGC-1α较低水 平的表达是糖尿病患者中胰岛素耐受和代谢失调的主要原因。Isabella 等人(Am.J.Physiol.Cell Physiol.284，c1669，2003)报道了PGC-1α是刺 激线粒体适应于由甲状腺激素、T3和肌肉收缩引起的环境改变的主要 因素。Kim等人(The Korean Journal of Biochemistry & Molecular Biology， 11，16，2004)报道了通过葡萄糖/脂肪酸代谢中的偶然关联，线粒体数量 和质量的异常诱导了胰岛素耐受，不仅如此，其还是代谢综合症的主 要原因。

基于能够活化代谢的物质都可有效地用于治疗代谢综合症疾病这 一假设，本发明人对代谢活化药物进行了深入研究，结果证明了丹参 酮衍生物是有效的治疗剂成分。

发明内容

因此，本发明旨在解决上述问题，以及之前希望解决的技术问题。

本发明人进行了多种广泛和深入的研究和实验。作为这些广泛研 究的结果，本发明人发现，从丹参(Salivia miltiorrhiza)提取的丹参酮衍 生物能够有效的激活细胞和组织中的代谢，本发明人还进一步发现， 当对用丹参酮衍生物治疗ob/ob小鼠、由降低的瘦蛋白分泌引起的肥胖 模型，db/db小鼠、肥胖/糖尿病模型，以及由高脂肪膳食导致的DIO(善 食诱导的肥胖)小鼠时，这些材料可有效地预防和治疗包括肥胖和糖尿 病的代谢综合症。基于这些发现完成了本发明。

因此，本发明的目的是提供预防和治疗代谢综合症的组合物，其 包括在成肌细胞C2C12和脂肪细胞以及动物疾病模型中，通过激活代 谢活化剂，对这样的代谢综合症具有预防和治疗效果的作为有效成分 的丹参酮衍生物。

发明的详细描述

如本发明的一个方面，可通过提供包括有来自丹参(Salivia  miltiorrhiza)提取物的治疗和/或预防有效量的丹参酮衍生物作为有效 成分的预防或治疗肥胖和代谢综合症疾病的组合物来实现以上和其他 目的。

迄今为止，已知的丹参酮衍生物生理活性如下。Toshiyuki等人 (Planta Med.2002.68，1103-1107)报道了丹参酮VI减弱了心肌细胞肥大 并且通过成心肌纤维细胞抑制了胶原的合成，由此阻碍了成心肌纤维 细胞的纤维化。Choi等人(Planta Med.2004，70，178-180)建议了通过抑 制肥大细胞脱颗粒来将丹参酮衍生物用作抗过敏剂的可能性。Ip等人 (Planta Med.2002.68，1077-1081)证明了二氢异丹参酮I在肝细胞中对 甲萘醌诱导的细胞毒性的护肝作用。Ren等人(Planta Med.2004，70， 201-204)证明了丹参酮衍生物抑制乙酰胆碱酯酶的酶活性。Kyoto等人 (Biochemical Pharmacolgy，64，745-750(2002))报道了丹参酮IIA磺酸盐 能够减弱由血管紧张素II诱导的心肌细胞肥大。Lee等人(Biosci. Biotechnol.Biochem.63(12)，2236-2239，1999)报道了丹参酮衍生物能 够产成过氧化物，并由此表现出抗菌活性。Kang等人 (Immunopharmacology，49，355-361，2000)报道了丹参酮衍生物能够在 免疫细胞中抑制IL-12和INF-γ的产生。Ko等人(Arch.Pharm.Res. 25，446-448，2002)报道了丹参酮衍生物能够抑制DGAT的酶活性。Zhou 等人(Biochemical Pharmacology，65，51-57，2003)报道了丹参酮IIA磺酸 盐促进线粒体中的电子传递反应。Wang等人(Antimicrobial Agent & Chemotherapy，June，1836-1841，2003)报道了丹参酮衍生物能够抑制氨 基葡糖苷诱导的自由基形成。Yun等人(Korean Patent Publication  Laid-open No.2000-0027306)证明了丹参酮衍生物可作为治疗乙型肝炎 的有效治疗剂。Sohn等人(Korean Patent Publication Laid-open No. 2004-0084482)公开了含有丹参酮I作为有效成分的治疗肝纤维化或肝 硬化的治疗组合物。然而，上述出版物和专利中并未公开或暗示如本 发明所述的通过提高AMPK的活性来预防和治疗肥胖和代谢综合症。

在本发明组合物中被用作有效成分的丹参衍生物，主要存在于被 用作诸如丹参(Salivia miltiorrhiza)和(Perovskia abrotanoides)的生药材 丹参中。丹参衍生物可广泛地分成四氢菲衍生物和菲衍生物。优选地， 如本发明所述的组合物包括选自上述衍生物及其混合物中的一种或多 种化合物。

优选地，四氢菲衍生物是选自隐丹参酮(通式1)和丹参酮IIA(通式 2)的一种或多种化合物。

通式1

通式2

优选地，菲衍生物是选自丹参酮I(通式3)和15，16-二氢丹参酮I(通 式4)的一种或多种化合物。

通式3

通式4

包含于丹参(丹参根)中的丹参衍生物由0.29％的丹参酮IIA，0.23％ 的隐丹参酮，0.11％的丹参酮I和0.054％的15，16-二氢丹参酮I组成。 作为丹参的主要成分，所述丹参衍生物是双萜o-醌化合物。这些化合 物的生物合成方法是通过从双萜进行隐丹参酮的生物合成，和通过诸 如隐丹参酮的脱甲基化或脱氢化的氧化方法对丹参的丹参酮衍生物， 例如丹参酮IIA，15，16-二氢丹参酮I和丹参酮I的生物合成实现的。

本发明发现这些丹参酮衍生物能激活代谢，因此促进了体内葡萄 糖、蛋白和脂类的代谢并抑制了体内脂肪的积累，由此能够治疗代谢 综合症。这些发现和事实都可通过以下实施例得以证明。特别地，本 发明人测定了丹参酮衍生物对代谢激活子活性的影响，成肌细胞 (C2C12)中蛋白和基因的表达，以及前成脂肪细胞(3T3-L1和F442A细 胞)细胞分化的抑制，作为结果，还验证了这些化合物表现出的极高的 代谢活化。正如通过丹参酮衍生物对蛋白和基因表达的影响所观察到 的，这些丹参酮化合物可单独或以其任意组合的方式表现出对代谢活 化的优良活性。与此同时，本发明人还证实了脂肪酸合成的抑制、脂 肪酸氧化和线粒体生物发生因子表达水平的促进都与丹参酮衍生物的 结构相关。

因此，如本发明所述的衍生物是由选自隐丹参酮、丹参酮IIA，丹 参酮I和15，16-二氢丹参酮I中的一种或多种丹参酮衍生物组成的。

这样的组合物包括以下所有情况：

(i)含有以隐丹参酮作为主要成分的组合物；

(ii)含有以丹参酮IIA作为主要成分的组合物；

(iii)含有以丹参酮I作为主要成分的组合物；

(iv)含有以15，16-二氢丹参酮I作为主要成分的组合物；

(v)含有以隐丹参酮作为主要成分，且任选，含有选自丹参酮IIA， 丹参酮I和15，16-二氢丹参酮I中的一种或多种化合物的组合物；

(vi)含有以丹参酮IIA作为主要成分，且任选，含有选自隐丹参 酮，丹参酮I和15，16-二氢丹参酮I中的一种或多种化合物的组合物；

(vii)含有以丹参酮I作为主要成分，且任选，含有选自隐丹参酮， 丹参酮IIA，和15，16-二氢丹参酮I中的一种或多种化合物的组合物；

(viii)含有以15，16-二氢丹参酮I作为主要成分，且任选，含有选 自隐丹参酮，丹参酮IIA和丹参酮I中的一种或多种化合物的组合物；

如果需要的话，以上所述组合物还可包括选自1β-羟基隐丹参酮， 1-氧基隐丹参酮，丹参醇B，丹参醇IIB，紫丹参甲素，二氢异丹参酮 I，丹参酮IIA磺酸盐，1，2-二氢丹参酮I和丹参酮VI中的一种或多种 丹参酮衍生物。

更加令人惊奇的是，本发明人还证实了隐丹参酮，丹参酮IIA和 15，16-二氢丹参酮I对AMPK活性的增强效果可通过两种或更多种这些 化合物的组合使用得到显著的增强。这样明显的协同作用并不能完全 预测得到，但却能确定，无论是这四种丹参酮衍生物那些类型，都能 表现出这样的效果。因此，在以上所述的组合物的组合方式中，组合 物(v)至(viii)是特别优选的。

作为组合物(v)至(viii)的特别实例，包括以下类型：

-含有隐丹参酮和15，16-二氢丹参酮I的组合物；

-含有隐丹参酮和丹参酮IIA的组合物；

-含有丹参酮IIA和15，16-二氢丹参酮I的组合物；

-含有丹参酮IIA和丹参酮I的组合物；

-含有15，16-二氢丹参酮I和丹参酮I的组合物；以及

-含有丹参酮I和隐丹参酮的组合物。

在以上所述的组合物中，所述两种组分的比例优选在10∶1-1∶ 10(w/w)的范围内，更优选在5∶1-1∶5的范围内。

含在天然存在的丹参中的丹参酮衍生物的组合物可根据其收获季 节或种植区域而表现出不同的分布情况。考虑到上述协同效果，有必 要具有在丹参酮衍生物之间的最佳的组合物比例从而一致地发挥其效 用。本发明人还证实了丹参酮衍生物对基因和蛋白表达活性及其间不 同结构差异特征的效果。通过任意地控制在这些结果上的组合物比例， 本发明人证实了通过调节丹参酮衍生物之间的比例对降低体重的效 果，并随后尝试获得最佳组合物比例。

如上所述，当如本发明所述的组合物中包含选自四氢菲衍生物和 菲衍生物中的一种或多种化合物，且优选地含有两种衍生物时，其间 的优选比例可在10∶1-1∶10(重量比)的范围内，更优选在5∶1-1∶5 的范围内，特别优选在2.5∶1-1∶2.5的范围内。优选地，所述四氢菲 衍生物成分中含有隐丹参酮和丹参酮IIA，且其比例在5∶1-1∶5的范 围内。此外，所述氢菲衍生物成分中含有15，16-二氢丹参酮I和丹参酮 I，且其比例在5∶1-1∶5的范围内。

本发明人还通过在ob/ob小鼠，肥胖模型，db/db小鼠，肥胖/糖尿 病模型，以及由较高脂肪膳食引起的DIO(善食诱导的肥胖)小鼠的体内 广泛的代谢综合症预防和治疗实验，进一步证实了丹参酮衍生物对代 谢综合症极其优良的预防和治疗效果。

结果，含有作为有效成分的丹参酮衍生物的预防和治疗代谢综合 症的组合物能够通过活化代谢预防和治疗代谢综合症，并由此可预测 其可被开发成为针对与代谢综合症相关的多种疾病的多种治疗剂。如 本发明所述的预防和治疗代谢综合症的所述组合物中包括了作为有效 成分的上述丹参酮衍生物或其任意的混合物，并可在需要的时候，与 可药用的载体一起被配制成代谢综合症的预防和治疗剂。

1、药理学特性

如本发明所述的组合物可用来预防和/或治疗与代谢综合症相关 的临床病症。这些临床病症包括，但不限于，普通肥胖，腹部肥胖， 高血压，动脉硬化，高胰岛素血症，高血糖症，II型糖尿病和表现出胰 岛素耐受特征的血脂异常。血脂异常，也称为表现型B的致动脉粥样 化的脂蛋白分布，且特征在于明显升高的非酯化脂肪酸，升高的富含 极低密度脂蛋白(VLDL)甘油三酯的颗粒，较高的ApoB值，存在有较 小的、密集的、低密度脂蛋白(LDL)颗粒，在表现型B存在时较高的 ApoB值，以及与低值ApoAI颗粒相关的低值的高密度脂蛋白(HDL)。

可以预测如本发明所述的组合物可用来治疗患有或不还有其他代 谢综合症信号的混合或组合的血脂异常或高甘油血症的患者，和在饭 后罹患多种程度的血脂异常的患者。

可以预测如本发明所述的组合物可具有抗炎特性，并能够降低由 血脂异常引起的与动脉硬化相关的心血管发病率和死亡率。这些心血 管疾病包括引起心肌梗塞的多种内部器官的大血管病变，心机能不全， 脑血管疾病和下肢的外周动脉机能不全。因为其胰岛素敏感效果，可 以期待本发明的组合物可以在代谢综合症和怀孕过程中的糖尿病发展 中预防或延缓II型糖尿病的发展。因此，也可以预测本发明的组合物 能够延缓糖尿病中临床高血糖症相关的慢性并发症的发展，例如引起 肾病的大血管病变，视网膜损伤和下肢的外周血管疾病。此外，无论 是否与胰岛素耐受相关，本发明的组合物可用来治疗除心血管系统之 外的多种病症，例如多囊卵巢综合症，肥胖，癌症，炎症疾病，和诸 如轻度认知缺损(MCI)，阿尔茨海默氏病，帕金森氏症和多发性硬化的 神经退行性疾病。

本发明的组合物在肝脏中表现出了对脂肪肝(肝脂质沉着症)发展 的抑制效果，并且还能够激活脂肪酸的β-氧化，从而在降低三甘油浓 度中具有一定的作用，并由此可预测用来预防或治疗由酒精肝和非酒 精肝的脂代谢障碍引起的脂肪肝和肝炎。

本发明的所述组合物可在不同组织中改变脂成分。此外，其还可 改变脂肪含量和分布，并且降低血浆胆固醇和三酰甘油水平。

本发明的所述组合物还在内皮细胞中NO的形成有非常有效，并 因此可预期其可用来预防或治疗心脏疾病，血管疾病，高血压和勃起 功能障碍。作为引起高血压的疾病，还应该提到心脏机能不全，心肌 梗塞，脑血管系统破裂，血栓症和肾脏损伤。

本发明的组合物是在末梢组织中促进脂肪酸氧化和引起能量消耗 的物质，并由此预测其可用来治疗或预防普通性肥胖，并用来去除诸 如皮下和腹部脂肪的局部脂肪沉积。因此，当需要从脂肪局部沉积的 特定区域去除脂肪时，诸如从眼睑，手臂和臀部的突出部分去除皮下 脂肪，去除腹部脂肪以及去除例如脂肪团的特定区域的脂肪时，可预 测本发明的组合物可用来以药膏，包括抗炎症贴片的贴片，以及乳膏 的形式递送药物。

而且，本发明的所述组合物通过降低血糖水平可用作抗糖尿病制 剂。此外，还证实了本发明的所述组合物改善了对胰岛素的降低的敏 感性，并由此增强了胰岛素的效果。

本发明所述的组合物促进了线粒体的生物合成，由此增强了线粒 体的活性，与此同时诱导了肌肉组织向运动组织的转化，从而增加了 患者的运动力，提高了耐力，改善了能量生产力，疲劳恢复，增强了 体力，通过提高去除活性氧(ROS)和自由基的能力降低了氧化胁迫，因 此预期所述组合物可有效地治疗所关心的疾病。

提到由活性氧(ROS)引起的疾病，还应该提到动脉硬化，糖尿病， 神经系统疾病，肾脏疾病，肝硬化，关节炎，早熟性视网膜病，眼葡 萄膜炎，老年白内障，由放疗引起的副作用病症，由于吸烟导致的支 气管损伤，由抗癌剂引起的副作用病症，脑水肿，肺水肿，足部水肿， 脑梗塞，溶血性贫血，早衰症，癫痫症，阿尔茨海默氏病，唐氏综合 症，克罗恩氏病和胶原病。

如上所述，通过调节葡萄糖和脂体内平衡，本发明所述组合物表 现出了能为所有的上述病症和疾病提供有益的效果。因此，可以看出 本发明的所述组合物是控制代谢综合症的适合物质。

本发明涉及使用化合物来制备治疗和/或预防多种代谢综合症(代 谢综合症)，即表现出高胰岛素血症，胰岛素耐受，肥胖，葡萄糖耐受， II型糖尿病，血脂异常，心血管疾病或尤其是高血压的特征的代谢综合 症。

2、药物制剂

含有作为有效成分的丹参酮衍生物的预防和治疗代谢综合症的所 述组合物能够通过活化代谢来预防和治疗代谢综合症，因此，一般认 为可将其开发作为适于与代谢综合症相关的多种疾病的不同药物。如 本发明所述的预防和治疗代谢综合症的所述组合物包括作为有效成分 的上述丹参酮衍生物，并且，如果需要的话，其可与可药用的载体一 起被配制成代谢综合症的预防和治疗剂。

本发明所述药物组合物的适当剂量可随诸如配制方法，给药类型， 年龄，体重和患者的性别，病理状况，饮食，给药时间，给药方式， 排泄率和对反应的敏感性的多种因素进行改变。如本发明所述的代谢 综合症的预防和治疗剂的药物组合物包括作为有效成分的丹参酮衍生 物。可通过口服或肠胃外途径的临床给药对所述丹参酮衍生物进行给 药，且其可以普通形式的药物制剂使用。换句话说，可通过多种口服 和肠胃外制剂，经过实际的临床给药方式对如本发明所述的组合物进 行给药。当进行配制时，可使用传统的填充剂，补充剂，粘合剂，湿 润剂，崩解剂，诸如表面活性剂的稀释剂，或赋型剂进行所述配制。 用于口服给药的固体制剂包括，例如片剂，丸剂，粉剂，颗粒和胶囊， 并通过与诸如淀粉，碳酸钙，蔗糖，乳糖和明胶的一种或多种赋型剂 和丹参酮衍生物混合进行制备。除了简单的赋型剂，还可以使用诸如 硬脂酸镁和滑石的润滑剂。作为口服给药的液体制剂，还应该提到悬 液，内服的溶液，乳液和糖浆。除了通常使用的诸如水和液体石蜡的 简单稀释剂，上述制剂还可包括多种赋型剂，例如湿润剂，甜味剂， 芳香剂和防腐剂。用于肠胃外给药的制剂包括无菌的水溶液，非水溶 性溶剂，悬液，乳剂，冻干的制剂和栓剂。作为非水溶性溶剂和悬液， 还可以使用丙二醇，聚乙二醇，植物油，例如橄榄油，可注射的酯， 例如油酸乙酯(ethylolate)，等等。作为栓剂的基本材料，可以使用 Witepsol，聚乙二醇(macrogol)，Tween 61，可可油脂，月桂精油脂， 甘油和明胶。

剂量单位可以包含1倍，2倍，3倍或4倍量的单剂量，或1/2， 1/3或1/4倍量的单剂量。优选地，一份单剂量含有给药一次的有效药 物量，并通常对应于一天的总给药量，或其1/2，1/3或1/4倍的量。尽 管有效量的丹参酮衍生物是浓度依赖性的，但其优选的范围是 0.1-1,000mg/kg，更优选为0.4-500mg/kg，并可一天给药1-6次。因此， 对成年人而言，可以0.1-6,000mg/天/kg体重的范围给药丹参酮衍生物。

根据本发明的另一方面，提供了含有作为有效成分的丹参酮衍生 物的预防和治疗代谢综合症的健康和功能性食品组合物。

在本发明的整个说明书中使用的术语“健康和功能性食品”是指 在普通食品中添加了丹参酮衍生物以改善其功能的食品。可以向普通 食品中添加丹参酮衍生物，或可将其制备称胶囊，粉末，悬液等形式。 摄入这种含有丹参酮衍生物的健康和功能性食品为健康提供了有益的 效果，且其优点在于并未表现有药物的长期使用所引起的副作用，因 为食品材料是被用作原材料，而不是常规的药物。

如果希望将本发明的丹参酮衍生物用作食物添加剂，这些衍生物 可被单独地添加，或可与其他食物或食物组分一同使用，或可基于其 他常规的方法进行适当地使用。可根据使用的目的(预防、健康或治疗 性处理)适当地确定混合量的有效成分。一般地，在使用混合的丹参酮 衍生物生产食物或饮料时，相对于原材料的总重量，可以0.0001-10％ 重量比的量，且优选为1-5％量比的量加入这些衍生物。然而，当为了 健康目的和卫生或为了健康控制进行长期摄入时，可将所述的丹参酮 衍生物的量调节至低于所述的范围。此外，当将其用作药物组合物时， 本发明的健康食物优选地含有在测定的毒性范围之内的丹参酮衍生 物。

对上述的食物种类并没有特定的限制。作为可向其中添加丹参酮 衍生物的食物的例子，还应该提到肉，香肠，面包，巧克力，糖果， 快餐，甜食，比萨饼，Ramen，其他的面条，口香糖，脱脂乳，干燥食 物，未加工的食物，包括乳酸细菌发酵的乳品和冰激凌的乳制品，各 种汤类，饮料，茶，饮品，酒精饮料和多种维生素制品。特别地，作 为含有丹参酮衍生物的健康食品的例子，还应该提到以丹参酮衍生物 作为主要成分的健康食品和特别风味的制品，例如榨汁，茶，果冻和 饮料。此外，还应该提到治疗以水肿，肾炎和尿道炎为目的的民间医 药。

当需要将本发明的丹参酮衍生物用为化妆品原材料时，可用这些 衍生物本身进行添加或可与其他化妆品组分一起使用，或可根据其他 现有方法进行适当地使用。可根据其使用的目的适当地确定有效成分 的混合量。一般地，在使用丹参酮衍生物生产化妆品的过程中，相对 于原材料的总重量，可以按重量计0.0001-10％的量，且优选为0.1-5％ 的量加入这些衍生物。化妆品包括，但不限于须后水，洗液，乳膏， 小包化妆品和彩妆。

可以将丹参(Salvia miltiorrhiza)作为干药材或生药材，提取到如本 发明所述的丹参酮衍生物或通过有机化学方法进行合成。

从丹参提取丹参酮衍生物的方法包括：a)将丹参进行水或有机溶 剂提取从而获得粗提物，b)过滤所述粗提物，然后进行(真空)浓缩，以 及c)任选地，去除溶剂。

例如，可是用甲醇提取丹参，真空浓缩，然后用二氯甲烷再次进 行提取从而获得浓缩的溶液。通过硅石柱层析纯化所述溶液从而得到 纯的丹参酮衍生物。将通过以下实施例对本发明进行更详细的描述。

附图说明

参考以下的发明详述以及对附图的说明，可对本发明上述和其他 目的，特征以及其他有点进行更清楚地了解，其中：

图1所示为用丹参(Salvia miltiorrhiza)提取物和丹参酮衍生物处理 成肌细胞系C2C12之后，在处理组和对照组之间AMPK(AMP-活化的 蛋白激酶)活性比较的柱状图；

图2所示为用丹参酮衍生物处理成肌细胞系C2C12之后，测定丹 参酮衍生物对总AMPK，p-AMPK，p-ACC和GLUT4的蛋白表达的作 用效果的Western印迹结果；

图3所示为用丹参酮衍生物处理成肌细胞系C2C12之后，测定丹 参酮衍生物对ACC1和2，UCP-2，CPT1，PGC-1α和GLUT1基因表 达的作用效果的Western印迹结果；

图4所示为用丹参酮衍生物处理成肌细胞系C2C12之后，在处理 组和对照组之间，丹参酮衍生物对细胞葡萄糖摄入效果的比较图；

图5所示为用丹参酮衍生物处理前成脂肪细胞系F442A之后，丹 参酮衍生物对成脂肪细胞分化的影像效果结果的显微图；

图6所示为用丹参酮衍生物处理成肌细胞系C2C12之后，在处理 组和对照组之间丹参酮衍生物对胰岛素敏感度效果的比较图；

图7所示为用隐丹参酮对肥胖，DIO(饮食诱导肥胖)小鼠的动物模 型进行处理之后，隐丹参酮对随时间体重变化影响的结果；

图8和图9所示分别为用丹参酮衍生物对肥胖的动物模型， C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠进行处理之后，丹参酮衍生物对随时间 体重变化影响的图和表格；

图10所示为用丹参酮衍生物对肥胖的动物模型，C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠进行处理之后，在处理组和对照组之间成脂肪细胞尺寸 变化的比较图；

图11所示为用丹参酮衍生物对肥胖的动物模型，C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠进行处理之后，在处理组和对照组之间对不同器官以数 值描述的脂肪分布比较图；

图12所示为用丹参酮衍生物对肥胖的动物模型，C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠进行处理之后对肝脏进行染色，在处理组和对照组之间 肝内脂肪组织分布和脂肪积累的比较图；

图13所示为用丹参酮衍生物对肥胖的动物模型，C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠进行处理之后，在处理组和对照组之间肝脏组织中脂质 和抗氧化指示剂变化的比较表；

图14所示为用丹参酮衍生物对肥胖的动物模型，C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠进行处理之后，在处理组和对照组之间血脂和血糖变化 的比较表；

图15所述为用丹参酮衍生物对肥胖的动物模型，C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠进行处理之后，在处理组和对照组之间比较小鼠内脏脂 肪分布变化的显微图；

图16所示为用丹参酮衍生物对肥胖的动物模型，Lepr db/Lepr db 小鼠进行处理之后，丹参酮衍生物对血糖变化的作用效果的表；

图17所示为通过本发明所述丹参酮衍生物双重组合对组合物活性 进行比较的表格；

图18所示为随着本发明组合物成分比例的改变导致活性变化的 表；

图19所示为通过本发明所述丹参酮衍生物的三重组合对组合物的 AMPK活性进行比较的表；以及

图20所示为以多种组合比例对肥胖的动物模型，C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠进行处理之后，在丹参酮衍生物的四氢菲衍生物组和菲 衍生物组之间的组合比例对体重改变效果结果的表。

具体实施方式

参照以下实施例，对本发明进行更详细地描述。这些实施例仅用 于对本发明进行说明，而不应该被认为是对本发明范围和精神的限制。

实施例1：丹参酮衍生物的分离

从中药店购买5kg丹参(Salvia miltiorrhiza)，并从田野和山脉收集 或从中药店购买其他的必须材料。用50L甲醇洗提丹参24小时，并在 减压下浓缩。向所得的材料中加入1500mL水。然后，加入等量的正己 烷，二氯甲烷(CH₂Cl₂)和乙酸乙酯(EtOAc)，然后顺序提取两次从而获 得凝胶状的红色提取物。当在此得到的不同分层上的活性进行测定时， 在二氯甲烷层中的活性最高。

用100％正己烷将硅胶(Kieselgel 60，230-460目，Merck)充分膨胀， 然后装入柱(530cm高)中。将从所述CH₂Cl₂层得到的50g提取物溶解 于痕量的EtOAc和正己烷中，并将所得的样品上样于所述柱子。在上 样和充分洗提所述样本之后，用10-20％的EtOAc梯度洗提所得的洗提 物，然后用0/100(v/v)→50/50(v/v)的MeOH/CHCl₃梯度进行顺序洗提从 而获得丹参酮衍生物。通过测定AMPK的活性，将活性级分混合并在 减压下浓缩。

使用硅胶(Kieselgel 60，230-460目，Merck)，对在第一个柱子中 表现出活性的材料进行再次分离。然后再用100％正己烷将硅胶充分膨 胀，然后装入柱(425cm高)中。将EtOAc/正己烷＝0/100(v/v)→20/80(v/v) 用作展开溶剂。将表现出抑制活性的级分合并并在减压下浓缩。

然后，在EtOAc/正己烷＝30/70(v/v)的展开溶剂下进行Prep-TLC。 在每一步中都进行TLC，并观察各个组分的分离程度。作为展开溶剂， 可以正常相使用EtOAc/正己烷＝80/20(v/v)。可通过加热和使用对甲氧 基苯甲醛染色溶剂(5％H₂SO₄，2.5％乙酸，5％对甲氧基苯甲醛和87.5％ 乙醇)在加热盘中展开TLC板对各材料进行搜索。以这种方式对丹参酮 衍生物进行提取，分离和纯化。

实施例2：各种活性材料的结构分析

使用NMR分析分别对实施例1中的隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮 IIA和15，16-二氢丹参酮I的结构进行测定。

隐丹参酮

1H-NMR(CDCl₃)：δ7.42(2H，ABq，J＝8.0Hz)，4.83(1H，t，J＝9.2 Hz)，4.31(1H，dd，J＝9.2和6.0Hz)，3.55(1H，m)，3.17(2H，br t)，1.65 (4H，m)，1.40(3H，d，J＝6.8Hz)，1.28(6H，s)

13C-NMR(CDCl₃)：δ9.58(C-1)，19.00(C-2)，37.73(C-3)，34.76 (C-4)，143.57(C-5)，132.48(C-6)，122.43(C-7)，128.30(C-8)，126.19 (C-9)，152.28(C-10)，184.16(C-11)，175.59(C-12)，118.21(C-13)，170.66 (C-14)，81.38(C-15)，34.54(C-16)，18.74(C-17)，31.85(C-18)，31.80 (C-19)

丹参酮IIA

1H-NMR(CDCl₃，300.40MHz)δ7.63(1H，d，J＝8.2Hz)，7.54(1H，d， J＝8.2Hz)，7.22(1H，s)，3.18(2H，t，J＝6.6Hz)，2.26(3H，s)，1.78(2H，m)， 1.65(2H，m)，1.31(6H，s)。

13C-NMR(CDCl₃，75.45MHz)δ184.29，176.43，162.38，150.80， 145.14，141.96，134.13，128.12，127.16，121.81，120.91120.57，38.52， 35.33，32.51，30.56，19.79，9.46。

15，16-二氢丹参酮I

1H-NMR(CDCl₃，300.40MHz)δ9.24(1H，d，J＝10.6Hz)，8.24(1H，d， J＝10.3Hz)，7.69(1H，d，J＝10.3Hz)，7.54(1H，dd，J＝10.6，8.4Hz)，7.41(1H， d，J＝8.4Hz)，4.95(1H，t，J＝11.3Hz)，4.41(1H，dd，J＝11.3Hz，7.5Hz)，3.62 (1H，m)，2.66(3H，s)，1.38(3H，d，J＝8.1Hz)。

13C-NMR(CDCl₃，75.45MHz)δ184.26，175.67，170.56，142.00， 134.95，134.72，132.06，131.90，130.38，128.81，128.18，126.01，124.99， 120.28，118.32，114.06，81.62，34.68，19.85，18.81。

丹参酮I

1H-NMR(CDCl₃，300.40MHz)δ9.19(1H，d，J＝10.6Hz)，8.23(1H，d， J＝10.3Hz)，7.73(1H，d，J＝10.3Hz)，7.50(1H，dd，J＝10.6，8.5Hz)，7.30(1H， d，J＝8.5Hz)，7.26(1H，q，J＝1.3Hz)，2.64(3H，s)，2.25(3H，d，3Hz)。

13C-NMR(CDCl₃，75.45MHz)δ183.38，175.55，161.13，142.00， 135.18，133.58，132.90，132.69，130.63，129.57，128.31，124.73，123.03， 121.72，120.43，118.69，19.84，8.79。

实施例3：AMPK活性的测定

将成肌细胞，C2C12，培养于含有10％小牛血清的DMEM培养基 中。当细胞密度达到约85％-90％时，用1％小牛血清的培养基替换所述 培养基，从而诱导细胞的分化。然后如下测定AMPK的酶活性。将 C2C12细胞裂解从而得到蛋白提取物，然后加入硫酸铵至终浓度为 30％，然后沉淀蛋白。将蛋白沉淀溶解于缓冲液(62.5mM Hepes，pH 7.2， 62.5mM NaCl，62.5mM NaF，1.25mM丙酮酸钠，1.25mM EDTA，1 mM DTT，0.1mM PMSF和200μM AMP)中。然后，向其中加入200μM SAMS肽(HMRSAMSGLHLVKRR：下划线的丝氨酸残基是磷酸化位点， 作为乙酰CoA羧化酶的AMPK磷酸化位点)和[γ-32P]ATP，并在30℃ 将所述反应物反应10分钟。然后将所得反应溶液喷点于p81磷酸纤维 素纸上。用3％磷酸溶液洗涤所述p81纸，并测定放射性。对每一种反 应条件而言，还进行了并未涉及SAMS多肽的反应，并从总值中减去 基本值。

如从图1中所看到的，当用丹参提取物和丹参酮衍生物处理成肌 细胞C2C12时，可导致AMPK酶活性的升高。

实施例4：t-AMPK，p-AMPK，p-ACC和GLUT4酶表达水平的测定

将成肌细胞，C2C12培养于含有10％小牛血清的DMEM培养基中。 当细胞密度达到约85％-90％时，用1％小牛血清的培养基替换所述培养 基，从而诱导细胞分化。用30μM丹参酮衍生物分别处理分化细胞。通 过裂解C2C12细胞测定AMPK的酶活性，获得了蛋白提取物，并将蛋 白提取物进行Western印迹分析，从而测定总AMPK，p-AMPK(磷酸化 AMPK)，p-ACC(磷酸化乙酰CoA羧化酶)和GLUT4(葡萄糖转运蛋白 4)蛋白的量。

从图2可看出，尽管在AMPK蛋白的总量上没有变化，当与对照 组进行比较时，丹参酮衍生物处理的细胞表现出了增加的磷酸化 AMPK蛋白的量，增加的磷酸化ACC蛋白的量和增加的GLUT4蛋白 表达水平。

实施例5：丹参酮衍生物对脂肪酸代谢和线粒体生物合成的作用

将成肌细胞，C2C12培养于含有10％小牛血清的DMEM培养基中。 当细胞密度达到约85％-90％时，用1％小牛血清的培养基替换所述培养 基，从而诱导细胞的分化。用30μM丹参酮衍生物分别处理分化细胞。 从细胞中提取RNA，并进行了RT-PCR来观察各种丹参酮衍生物对 ACC-1(乙酰CoA羧化酶-1)，ACC-2，CPT1(肉毒碱棕榈酸转移酶-1)， PGC1α(过氧物酶体增殖子活化的受体γ共活化子1α)，GLUT1(葡萄糖 转运蛋白1)和UCP-2(非偶联蛋白-2)基因表达的作用效果。

如从图3可看出，当与对照组进行比较时，丹参酮衍生物处理的 细胞表现出了对ACC-1，ACC-2，CPT1，PGC-1α，UCP-2和GLUT1 基因增加的表达水平。

实施例6：对葡萄糖摄入水平的分析

将成肌细胞，C2C12，培养于含有10％小牛血清的DMEM培养基 中。当细胞密度达到约85％-90％时，用1％小牛血清的培养基替换所述 培养基，从而诱导细胞的分化。将完全分化的细胞进一步在含有5μM 葡萄糖的Krebs-Ringer缓冲液中再培养2小时。用丹参酮衍生物对细 胞处理预定的时间，加入0.2μCi 2-脱氧葡萄糖，并静置2分钟。在去 除KRB缓冲液之后，用冰预冷的生理盐水缓冲液洗涤细胞，用0.5N NaOH裂解细胞，然后使用放射计数器测定每分钟的计数(cpm)。在这 种情况下，可使用含有10μM细胞松弛素B的KRB缓冲液测定葡萄糖 的非特异性摄入，并从总值中减去。

如图4所示，当用30μM丹参酮衍生物分别处理C2C12细胞时， 与对照组相比较，所处理的细胞表现出了增加的葡萄糖摄入。

实施例7：成脂肪细胞分化抑制活性的测定

在含有10％小牛血清的DMEM中培养前成脂肪细胞，3T3-L1和 F442A。当分别的前成脂肪细胞密度达到约90％时，用地塞米松，IBMX 和胰岛素处理3T3-L1细胞约48-55小时，从而诱导脂肪细胞的分化。 然后每2天用含有小牛血清和胰岛素的培养基更换原来的培养基。在 F442A细胞的情况下，当前成脂肪细胞的细胞密度达到约90％时，用 含有10％小牛血清和胰岛素的培养基更换原来的培养基，每2天更换 一次，从而诱导脂肪细胞的分化。为了测定脂肪细胞分化的抑制性效 果，用从丹参提取的，浓度为5-30μM的丹参酮衍生物对处于脂肪细胞 分化早期的细胞进行处理，并与对照组进行比较。约12-15天后有超过 90％的细胞分化成了脂肪细胞。为了研究各个级分的活性，与对细胞进 行与对照组相同的时间处理，并在显微镜下观察从而测定丹参酮衍生 物处理的效果。

图5是根据脂肪细胞分化诱导时间，在丹参酮衍生物处理组和对 照组之间脂肪细胞分化能力比较的显微图。在对照组的情况下，80-90％ 的F442A细胞分化成脂肪细胞需要约11天。然而，在丹参酮衍生物处 理组的情况下，当用浓度为30μM的丹参酮衍生物从分化的早期对细胞 进行处理时，在相同时间内仅有5-10％的细胞分化成脂肪细胞。

实施例8：丹参酮衍生物对肌肉细胞中胰岛素敏感性的作用

将成肌细胞，C2C12，培养于含有10％小牛血清的DMEM培养基 中。当细胞密度达到约85％-90％时，用1％小牛血清的培养基替换所述 培养基，从而诱导细胞的分化。通过用胰岛素和丹参酮衍生物分别或 其组合处理分化的成肌细胞，测定了对于不同丹参酮衍生物浓度的葡 萄糖摄入水平，并由此测定了丹参酮衍生物对胰岛素敏感性的作用效 果。

如图6所示，在存在胰岛素的情况下以不同浓度给药丹参酮衍生 物时，这表现出了葡萄糖对进入肌肉细胞的促进性浓度依赖性摄入， 正如与单独给药的组和对照组进行的比较。

实施例9：在肥胖的动物模型，DIO小鼠中对肥胖预防和治疗性效果的分析

作为最常用的膳食诱导的肥胖(DIO)的小鼠模型，用高脂肪膳食 (D12451，45％kcal脂肪，Research Diests，New Brunswick，NJ)饲喂4 周龄的C57BL/6雄性小鼠。

结果，脂肪在动物体内过量累积，在出生约3个月后，小鼠随后 保持了超过31-32g的体重，相当于正常小鼠的1.4倍体重。为了测定 丹参酮衍生物对脂肪代谢的作用，将3月龄、重量为31-32g的DIO小 鼠(16只)分成两组，一个实验组和一个对照组，各具有8只动物。在预 定的时间点，对实验组的8只小鼠以100mg/kg的浓度给药丹参酮衍生 物30天。与此同时，以相等量的蒸馏水单独对对照组进行给药。在给 药30天之后对实验组和对照组的体重进行测定，给药了丹参酮衍生物 的实验组表现出了明显降低的体重，正如与对照组相比的那样，如图7 所示。

实施例10：丹参酮衍生物给药对肥胖小鼠(ob/ob)的作用效果

从Daehan Biolink公司(Chungchongbuk-do，Korea)购买10周龄、 具有肥胖特征的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob雄性小鼠。将动物饲养于温 度为23℃、湿度为55％、照明为300-500lux，光-暗循环为12∶12小 时，以及每小时通风10-18次的饲养室中。对动物饲喂Purina Rodent  Laboratory Chow 5001(购买自Purina Mills Inc.，St.Louis，MO，美国)的 鼠料和随意的水。允许小鼠在饲养室的新环境中适应两周，并给药 300mg/kg的丹参酮衍生物26天。根据给药的时间点，对体重、血糖和 膳食摄入的变化进行观察。在给药完成之后，进行计算断层照相法(CT) 对动物的脂肪组织分布变化，多种器官中脂肪的组织分布变化，脂肪 细胞体积的变化，血液和肝脏中的葡萄糖，以及脂肪和酶的变化进行 测定。图9所示的表显示给药丹参酮衍生物对体重损失的作用效果。

图8是在给药了丹参酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠和 对照组之间随时间体重变化的比较图。如图8所示，与对照组相比， 丹参酮衍生物的给药导致了体重的明显降低。

图10是在给药了丹参酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠 和对照组之间脂肪细胞大小数值的比较图。如图10所示，与对照组相 比，给药了丹参酮衍生物的实验组显示脂肪细胞大小超过60％的降低。

图11是在给药了丹参酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠 和对照组之间不同器官的脂肪分布的数值的比较图。如图11所示，与 对照组相比，给药了丹参酮衍生物的实验组显示所有器官的组织的脂 肪含量的明显降低，和升高的褐色脂肪含量，说明了脂肪代谢的明显 增强。

图12是通过H&E染色和油红O染色，在正常小鼠，肥胖小鼠和 给药了丹参酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠的肝脏中脂肪组 织分布的比较图。如图12所示，与肥胖小鼠的对照组相比较，通过脂 肪组织的染色证实了丹参酮衍生物的给药导致了肝脏中脂肪积累的明 显降低。

图13是在给药了丹参酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠 和对照组之间肝脏组织中脂类和抗氧化指示剂材料变化结果的表。如 图13所示，与对照组相比，给药了丹参酮衍生物的组表现出了在肝脏 中总脂肪含量，甘油三酯，胆固醇，GOT和GPT的明显降低。

图14是在给药了丹参酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠 和对照组之间血液中的脂类和葡萄糖变化的比较表。如图14所示，与 对照组相比，给药了丹参酮衍生物的组表现出了在血液中甘油三酯， 胆固醇，GOT和葡萄糖的明显降低。

图15是在给药了丹参酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠 的计算断层照相法(CT)的分析结果。如图15所示，与对照组相比，给 药了丹参酮衍生物的实验组表现出了内脏脂肪分布的明显降低。

实施例11：在糖尿病的动物模型，Lepr db/Lepr db小鼠中对糖尿病预防和治疗效果的分析

Lepr db/Lepr db雄性小鼠缺乏瘦蛋白受体，并由于其不受控制的 胃口，因而连续和过量地消费食物。结果，脂肪在动物体内过量累积， 且血糖水平升高，导致了在出生后约10-11周后约350-400mg/dl的血 糖水平。为了测定丹参酮衍生物对糖尿病的预防和治疗效果，将血糖 水平约350-400mg/dl的成年Lepr db/Lepr db小鼠分成了两组，一个实 验组和一个对照组，每组各有10只动物。以300mg/kg浓度的丹参酮 衍生物给药实验组的10只小鼠12天。与此同时，以等量的蒸馏水而 不是丹参酮衍生物对对照组的10只小鼠进行给药。图16是显示丹参 酮衍生物给药阶段的血糖变化的表，并可以看出由丹参酮衍生物引起 的血糖的降低效果。

实施例12：关于丹参酮衍生物间组合比例对AMPK活性的协同效果

使用肌肉细胞，进行了本实施例，从而确认了含有作为主要成分 的丹参酮I，丹参酮IIA，隐丹参酮和15，16-二氢丹参酮I的衍生物之间 组合比例对AMPK活性的协同效果。换言之，我们尝试确认如实施例 5中所示根据基因表达衍生物之间的相互互补功能，并通过AMPK活 性对任一的丹参酮衍生物组合引起的协同效果进行了确认。

可将不同成分的丹参酮I，丹参酮IIA，隐丹参酮和15，16-二氢丹 参酮I双倍或三倍组合从而制备不同的组合物。将所制备的组合物的 AMPK活性与包含于那些组合物中不同组分的AMPK活性进行比较从 而确认协同作用。此外，通过改变所述组合物中成分之间的比例，我 们试图确认随着所述组合物比例改变的AMPK活性，并通过丹参酮衍 生物的任一组合获得活性的协同效应。

图17是通过丹参酮衍生物的双重组合对组合物活性进行比较的 表，图18是显示关于双重组合中成分比例改变的活性变化的表，而图 19则是通过丹参酮衍生物的三重组合对组合物的AMPK活性进行比较 的表。

首先，如图17和图18所示，在相同浓度下，与分别组分的AMPK 活性相比，含有两种或三种丹参酮衍生物组分组合的组合物具有明显 较高的AMPK活性。可以看出由于衍生物成分组合的这种协同效果是 与组分的种类没有关系的非常独特的现象。与此同时，正如图18所示， 在相同组合物中不同组分之间的组合比例的差异导致了依赖于成分种 类的特别不同的AMPK活性。

实施例13：关于丹参酮衍生物间的组合比例对体重降低的协同效果

从Daehan Biolink公司(Chungchongbuk-do，Korea)购买10周龄、 具有肥胖特征的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob雄性小鼠。将动物饲养于温 度为23℃、湿度为55％、照明为300-500lux，光-暗循环为12∶12小 时，以及每小时通风10-18次的饲养室中。对动物饲喂Purina Rodent  Laboratory Chow 5001(购买自Purina Mills Inc.，St.Louis，MO，美国)的 鼠料和随意的水。允许小鼠在饲养室的新环境中适应两周，并给药丹 参酮衍生物。将包含于丹参提取物中的丹参酮衍生物分成两组：四氢 菲衍生物组(1∶1的隐丹参酮和丹参酮IIA)和菲衍生物组(2∶1的丹参 酮I和15，16二氢丹参酮I)，并可对丹参酮衍生物之间的比例进行适当 调节。以这种方式，我们试图测定组分比例改变对体重的效果，并由 此确定了内部互补作用的效果。四氢菲衍生物组和菲衍生物组之间的 组合比例可以从10∶1-1∶10，并以300mg/kg的剂量对动物给药26天。 测定了伴随衍生物给药体重的改变，关于组分比例改变对体重降低的 效果可见于图20。如图20所示，在四氢菲衍生物和菲衍生物间的组合 比例改变导致了体重降低(％)的改变。尤其是，当组合比例(四氢菲衍生 物∶菲衍生物)在5∶1-1∶5范围内且更优选在2.5∶1-1∶2.5范围时， 证实了极好的协同效果。

实施例14：急性毒性测试

1、口服给药

将23±2g的IRC小鼠和250±7g的Sprague-Dawley(Jung-Ang Lab  Animal Inc.，Seoul，Korea)大鼠分成4组，每组10只，并分别以100， 500和1,000mg/kg的剂量口服给药本发明的丹参酮衍生物。口服给药 后观察2周看是否表现出毒性，在所有四个分组中没有动物死亡，并 且与对照组(除体重降低以外)相比也未观察到可见的症状。

2、腹膜给药

将25±3g的IRC小鼠和255±6g的Sprague-Dawley(Jung-Ang Lab  Animal Inc.，Seoul，Korea)大鼠分成4组，每组10只，并分别以10，50 和100mg/kg的剂量腹膜给药本发明的丹参酮衍生物。腹膜给药后观察 2周看是否表现出毒性，在所有四个分组中没有动物死亡，并且与对照 组(除体重降低以外)相比也未观察到可见的症状。

从上述结果证实了本发明的丹参酮衍生物没有急性毒性。

在下文中描述了如本发明所述药物组合物的制备实施例。所提供 的这些实施例仅为了对本发明进行说明，而不应该被认为是对本发明 范围和精神的限制。

实施例15：片剂的制备

实施例16：粉剂制剂的制备

实施例17：将丹参酮衍生物应用于乳品中

乳品         99.9％

丹参酮衍生物 0.1％

实施例18：将丹参酮衍生物应用于橙汁中

实施例19：制备饮料

实施例20：将丹参酮衍生物应用于化妆品乳液

实施例21：将丹参酮衍生物应用于化妆护肤品

工业应用

如上所述，本发明所述的组合物可有效地通过代谢活化降低体重， 阻止体内的脂肪积累，降低血糖水平，并有效地降低胆固醇和甘油三 酯的量，因此可有效地预防和治疗代谢综合症。此外，所述组合物可 阻止体内的脂肪积累，并增强胰岛素敏感性，从而控制血糖水平，因 此可用来开发能够预防或治疗由脂肪和葡萄糖代谢功能紊乱导致的与 代谢综合症相关的多种疾病的食品，化妆品和药物组合物。

尽管在此已公开了说明性的本发明的优选实施方案，但本领域所 属技术人员都应理解在不偏离权利要求公开的本发明的范围和精神的 前提下，仍然可进行多种修饰，添加和替换。