蚕微孢子虫、核型多角体病毒和浓核病毒的三重荧光PCR检测方法及试剂盒和引物、探针

摘要

本发明属于生物检测技术领域，涉及家蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光PCR检测方法及试剂盒和引物、探针。本发明分别设计了各自的引物和探针，并在3个探针上标记了不同的荧光信号，在优化了PCR反应体系的条件下，实现三重荧光定量PCR同步检测蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒。不仅可实现DNA同步提取，也可以进行荧光PCR同步检测，大大简化了检测方法，并通过荧光补偿的程序，有效地消除了因荧光信号的交集而引起的假阳性。该方法能快速、特异和灵敏的一次性鉴别检测蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒，可提高早期检出率，有效防止疾病的传播，减少经济损失。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及家蚕微孢子虫（Nosema bombycis，Nb）、家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus，BmNPV）和家蚕浓核病毒（Bombyx mori Densovirus，BmDNV）的三重荧光定量PCR检测方法及试剂盒和引物、探针。

背景技术

家蚕微孢子虫（Nosema bombycis，Nb）、家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus，BmNPV）和家蚕浓核病毒（Bombyx mori Densovirus，BmDNV），分别是引起家蚕的微粒子病、核型多角体病和家蚕浓核病的病原体，均可造成世界蚕业巨大经济损失，甚至有可能同时混合感染。由于对上述蚕病缺少有效的控制手段，因此对病原微生物的早期检测鉴定非常重要，准确灵敏的检测方法能有效的防止疾病的传播，减少经济损失。

蚕微孢子虫属原生动物界微孢子虫门、微孢子虫纲、微孢子虫目、微孢子虫科、微孢子虫属。家蚕核型多角体病毒属杆状病毒科，真杆状病毒亚科，核型多角体病毒属，是双链DNA病毒。家蚕浓核病毒属细小病毒科，浓核病毒亚科，相同病毒属，是单链DNA病毒。

显微镜被广泛用于家蚕孢子虫的检测，但其特异性和灵敏度不高，检测速度和效率较低；而对家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的检测，更加需要电子显微镜，检测速度和效率较低，也不能同时鉴别诊断。血清学鉴别法具有特异性强、灵敏度高的特点，但是存在比较高的交叉反应与非特异性反应，而且家蚕孢子虫是颗粒性抗原，血清学检测不稳定。随着分子生物技术的发展，上述3种病原体都可以通过在保守区域设计特异性引物，进行PCR检测。荧光实时定量PCR（Real-time PCR）是在PCR反应体系中加入荧光基团标记的探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对结果进行分析。TaqMan探针是常用的一种荧光标记方法，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的TaqMan荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。多重荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增多个目的基因，而每个目的基因采用不同波长的荧光探针进行检测，根据该原理设计特异性多重荧光探针，常用的荧光基团有FAM、TET、VIC、HEX、ROX等，可通过不同的荧光检测通道，同时检测多种荧光信号。 

发明内容

为了实现同步检测家蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒，本发明的第一个目的是提供蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光定量PCR检测用试剂盒；本发明的第二个目的是提供蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的检测引物和探针；本发明的第三个目的是提供蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光定量PCR检测方法。本发明实现在家蚕中对上述3种病原微生物的快速早期鉴别诊断，由于引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，提高了早期鉴别检测效率，并简化了检测方法。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括Premix Ex Taq试剂、引物和探针，其中： 

1）家蚕微孢子虫的引物和探针

引物的序列如下：上游引物：AGTGCCATCGTTGCTGGTT，

下游引物：TGGGCCTTTCTTCTTTCCTAT；

探针的序列如下：FAM-ACCGCTAAGGAAACCCGCAAGGA-Eclipse；

2）家蚕核型多角体病毒的引物和探针

引物的序列如下：上游引物：ATCGCCATCGGACAACGCGG，

下游引物：GTGGCCGTCCGAATGCGTCT；

探针的序列如下：HEX-TTATGTCGGTGGATCGACAA-Eclipse；

3）家蚕浓核病毒的引物和探针

引物的序列如下：上游引物：GGTGGAAGTGGAAGTGGAAA，

下游引物：TTTCCACTCGATTGGCTTGT；

探针的序列如下：ROX-GGTGCAAGTAGAGGAGGTGC-Eclipse。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

蚕微孢子虫荧光定量PCR检测用引物，该引物的序列如下：

上游引物：AGTGCCATCGTTGCTGGTT，

下游引物：TGGGCCTTTCTTCTTTCCTAT。

蚕微孢子虫荧光定量PCR检测用探针，该探针针对上述的引物扩增的基因片段，探针的序列如下：FAM-ACCGCTAAGGAAACCCGCAAGGA-Eclipse。

家蚕核型多角体病毒荧光定量PCR检测用引物，该引物的序列如下：

上游引物：ATCGCCATCGGACAACGCGG，

下游引物：GTGGCCGTCCGAATGCGTCT。

家蚕核型多角体病毒荧光定量PCR检测用探针，该探针针对上述的引物扩增的基因片段，探针的序列如下：HEX-TTATGTCGGTGGATCGACAA-Eclipse。

家蚕浓核病毒荧光定量PCR检测用引物，该引物的序列如下：

引物的序列如下：上游引物：GGTGGAAGTGGAAGTGGAAA，

下游引物：TTTCCACTCGATTGGCTTGT。

家蚕浓核病毒荧光定量PCR检测用探针，该探针针对上述的引物扩增的基因片段，探针的序列如下：探针的序列如下：ROX-GGTGCAAGTAGAGGAGGTGC-Eclipse。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的三重荧光定量PCR检测方法，该方法包括以下的步骤：

1）样本DNA提取：选取感染上述病原体的家蚕材料0.2g，经玻璃珠破碎法破碎，6000 r/min，20 s×6次，使用DNA抽提试剂盒进行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在20μl水中；

2）三重荧光PCR扩增法对3种样本的同步检测：

蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的引物和探针的序列如上所述；

三重荧光PCR反应体系如下：10μl Premix Ex Taq，各引物10 pmol/μl均0.13 μl，各探针10 pmol/μl均0.27μl，取上述提取的DNA液4μl，蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的DNA浓度分别为2.5 ng/μl，用水补足体积至20μl；

应用荧光定量PCR仪lightcycle 480进行反应，反应程序为(1) 95℃，10 sec；(2) 95℃，5 sec；60℃，23 sec；40 个循环；

3）调用相应荧光补偿程序，进行荧光补偿，对结果进行判定；一般认为Ct值小于等于35时，结果为阳性，Ct值大于等于40时，结果为阴性，Ct值介于35-40时，需要进行重复检测，若仍介于35-40，则判断为阳性，若大于等于40则判断为阴性。

上述的荧光补偿反应程序参照Roche说明书，即(1) 95℃，10 sec；(2) 95℃，5 sec；60℃，23 sec；40 个循环；(3)95℃，10 sec；40℃，30 sec；95℃，continous；40℃，1 sec。补偿反应时进行单重荧光反应，单重荧光反应体系如下：10μl Premix Ex Taq，上述的上游、下游引物10 pmol/μl各0.4μl，上述的探针10 pmol/μl，0.8μl，取DNA 1μl，蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒的的DNA含量分别为2.5 ng/μl，用水补足体积至20μl。 

本发明基于具有高度物种特异性的家蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA基因序列（Nosema bombycis small subunit ribosomal RNA，FJ854545（基因序列号））、家蚕核型多角体病毒DNA聚合酶基因序列（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus gene for DNA polymerase，D16231）和家蚕浓核病毒镇江株假设结构蛋白基因序列（Bombyx mori densovirus isolate Zhenjiang putative structural protein gene，AY236978），分别设计了各自的引物和探针，并在3个探针上标记了不同的荧光信号，在优化了PCR反应体系的条件下，实现三重荧光定量PCR同步检测蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒。由于该3种病原体的核酸均为DNA，因此，不仅可实现DNA同步提取，也可以进行荧光PCR同步检测，大大简化了检测方法，并通过荧光补偿的程序，有效地消除了因荧光信号的交集而引起的假阳性。由于该方法引入了高特异性扩增引物和不同荧光标记的探针，确保了本方法能快速、特异和灵敏的一次性鉴别检测蚕微孢子虫、家蚕核型多角体病毒和家蚕浓核病毒，可提高早期检出率，有效防止疾病的传播，减少经济损失。

具体实施方式

实施例 1 引物和探针的设计

基于具有高度物种特异性的家蚕微孢子虫小亚单位核糖体RNA基因序列（Nosema bombycis small subunit ribosomal RNA，FJ854545（基因序列号））、家蚕核型多角体病毒DNA聚合酶基因序列（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus gene for DNA polymerase，D16231）和家蚕浓核病毒镇江株假设结构蛋白基因序列（Bombyx mori densovirus isolate Zhenjiang putative structural protein gene，AY236978），用生物信息学方法根据引物设计原则，并利用Primer Express设计软件，设计出扩增上述基因片段的特异性引物和荧光探针若干组。将设计得到的引物和探针一一进行BLAST验证（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/），以保证引物的高特异性。并进一步利用DNAStar软件，验证各引物探针间是否会产生引物二聚体等。经过上述验证，最后选择了如表1所示的引物和探针，并在探针上分别标记不同的荧光信号，以实现3通道同步检测。

表1 家蚕微孢子虫、核型多角体病毒和浓核病毒检测的引物和探针

F：正向引物；R：反向引物；P：探针。

实施例 2：样本DNA提取

选取感染上述3种病原体的家蚕材料 0.2g，经玻璃珠破碎法破碎，6000 r/min，20 s×6次后，使用DNA抽提试剂盒(Promega FF3750)，按照说明书进行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在20μl水中。

实施例 3：三重荧光PCR扩增反应及荧光补偿反应

三重荧光PCR扩增法对3种样本的同步检测。引物探针序列如表1所示，三重荧光PCR反应体系如下：10μl Premix Ex Taq（Takara），各引物（10 pmol/μl）均0.13μl，各探针（10 pmol/μl）均0.27μl，取上述提取的DNA液4μl（Nb，BmNPV和BmDNV的DNA含量分别为2.5 ng/μl），不足的体积用水补足至20μl。应用荧光定量PCR仪lightcycle 480（Roche）进行反应，反应程序为(1) 95℃，10 sec；(2) 95℃，5 sec；60℃，23 sec；40 个循环。调用相应荧光补偿程序，进行荧光补偿，对结果进行判定。一般认为Ct值小于等于35时，结果为阳性，Ct值大于等于40时，结果为阴性，Ct值介于35-40时，需要进行重复检测，若仍介于35-40，则判断为阳性，若大于等于40则判断为阴性。

实施例 4：质粒的制备

应用表1中的引物，对实施例2得到的DNA样本进行普通单重PCR扩增，普通单重PCR反应体系如下：2.5 μl PCR ExBuff（Takara），2 μl dNTP(2.5 pmol/μl)，2 μl MgCl₂ (25 pmol/μl)，引物各(10 pmol/μl) 0.5μl，0.125 μl ExTaq (5 U/μl)，DNA 4 μl，加水补足25 μl。普通PCR（PTC-200，MJ Co.）程序如下 (1) 94°C，5min；(2) 94°C，30 sec；60°C，60 sec；72°C，45 sec，40 个循环；(3) 72°C，10 min。将PCR扩增产物进行凝胶电泳，并割胶回收，将PCR产物纯化后，将其克隆至PMD18-T载体上，如此获得各含有一种目的片段的质粒3种。

实施例 5：单重荧光PCR灵敏度验证

分别对上述3种病原体进行荧光PCR的灵敏度验证。单重荧光PCR反应体系如下：10ul Premix Ex Taq（Takara），引物（10 pmol/μl）均0.4μl，探针（10 pmol/μl）均0.8ul，上述实例4中的质粒取1 ul（各个浓度梯度的质粒含量如表2所示），不足的体积用水补足至20ul。应用荧光定量PCR仪lightcycle 480（Roche）进行反应，反应程序为(1) 95°C，10 sec；(2) 95°C，5 sec；60°C，23 sec；40 个循环。 各个单重PCR的结果如表2所示。一般认为Ct值小于等于35时，得到的阳性结果比较可靠。由此判断，BmNPV引物、探针的检测灵敏度为0.00025 ng/μl ；Nb 的为0.0025 ng/μl； BmDNV的为0.025 ng/μl。

表 2 单重荧光PCR灵敏度验证的检测结果

所有实验取重复3次的平均值；Undet.: Ct值低于检测限。

实施例 6：多重荧光PCR灵敏度验证

比较了三重荧光反应时，各引物探针的检测灵敏度。反应体系和反应程序如实例3所示，即各引物浓度相同，各探针浓度也相同。在三种质粒（实例4中获得）浓度为1：1：1时，三重荧光PCR反应对三种物质检测灵敏度如表3所示，即对Nb和BmNPV的灵敏度较高，达到0.0025 ng/μl；而对BmDNV的灵敏度稍低，达到0.025 ng/μl。 

表 3 三重荧光PCR灵敏度验证的检测结果

所有实验取重复3次的平均值；Undet: Ct值低于检测限。

序列表

<110>浙江省检验检疫科学技术研究院

<120>蚕微孢子虫、核型多角体病毒和浓核病毒的三重荧光PCR检测方法及试剂盒和引物、探针

 

<160>9

 

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

AGTGCCATCG TTGCTGGTT 19

 

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

TGGGCCTTTC TTCTTTCCTA T 21

 

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ACCGCTAAGG AAACCCGCAA GGA 23

 

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ATCGCCATCG GACAACGCGG 20

 

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

GTGGCCGTCC GAATGCGTCT 20

 

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

TTATGTCGGT GGATCGACAA 20

 

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

GGTGGAAGTG GAAGTGGAAA 20

 

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

TTTCCACTCG ATTGGCTTGT 20

 

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

GGTGCAAGTA GAGGAGGTGC 20