防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1JN2及其应用

摘要

本发明属于农作物防病治病技术领域，公开了防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1JN2及其应用。生防菌株1JN2，分类命名为Bacillus axarquiensis，2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.5731。将该菌在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1JN2及其应用。

背景技术

西瓜细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch of watermelon，BFB)是西瓜上的一种危险 性检疫病害，又称细菌性斑点病，该病最早于1969年由Crall和Schenck在美国佛罗里达州 发现，当时只是对果斑病症状进行了描述，未做病原菌的鉴定；目前为止，在我国许多省市， 像新疆，陕西，河北，山西，吉林，福建，甘肃等地都已有果斑病的报道。该病害主要危害果 实，引起西瓜果实腐烂等，可造成毁灭性损失，一旦发病用药防治基本没有效果。而且带菌种 子将成为下一年重要的初侵染源。该病的发生严重影响了西瓜的产量和品质，成为西瓜生产上 亟待解决的难题之一。

该病害是由燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli，Aac)引起的， 西瓜果斑目前在瓜类作物中无免疫品种。西瓜细菌性果斑病是一种毁灭性的细菌性病害，大田 生长期不易被发现，且发病突然、发展迅速，由于目前还没有发现种子处理的更好方法，目前生 产中所采用的化学药剂有农用链霉素，可杀得，新植霉素，细菌杀，叶双青，加瑞农，琥胶肥 酸铜等，虽然化学药剂对该病有一定的防治效果，但是防治效果不高，而且大量使用化学杀菌 剂往往会造成环境污染、农药残留，以及引起病原菌抗药性等问题。生物防治是一种安全有效 的防治手段，符合农业持续发展的方向。

发明内容

本发明的目的针对西瓜产业潜在危害较大的西瓜细菌性果斑病，提供开发一种防治西瓜细 菌性果斑病的单一生防菌菌株及其应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种防治西瓜细菌性果斑病病害的生防菌株1JN2，分类命名为Bacillus axarquiensis， 2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.5731。

用所述的保藏号为CGMCC NO.5731的生防菌株1JN2制备的生防菌剂。

所述的保藏号为CGMCC NO.5731的生防菌株1JN2在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。

所述保藏号为CGMCC NO.5731的生防菌株1JN2用于制备生防菌剂的方法：将所述的保藏 号为CGMCC NO.5731的防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2在LB培养液中28℃180rpm 振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活 菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

所述的保藏号为CGMCC NO.5731的生防菌株1JN2制备的生防菌剂在防治西瓜细菌性果斑 病中的应用。该菌剂可以兑水喷雾使用，或做成堆肥使用，也可稀释后在移栽时灌根。

有益效果

本发明的优点和积极效果表现在：本发明是专门针对西瓜细菌性果斑病病害开发的生 防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于 西瓜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支， 而且有利于西瓜的出口贸易。

温室大棚试验结果显示，含1JN2(CGMCC NO.5731)的生防菌剂对西瓜的促生作用效 果显著，生物量增加达到55.92％(表1)，并且该生防菌剂对西瓜果斑病病害防效显著，高 达50.13％(表2)。

生物样品保藏信息

生防菌株1JN2，分类命名为Bacillus axarquiensis，于2012年1月16日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微 生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.5731。

具体实施方式

实施例1

一种防治西瓜细菌性果斑病病害的生防菌株1JN2，为Bacillus axarquiensis，由山东 省莱芜市生姜茎内分离得到。其具体分离、筛选、鉴定方法如下：

1生防菌株1JN2的分离

剪掉生姜茎部3g，用1％的次氯酸钠1mL浸5min，70％酒精浸2min，无菌水 清洗3次。(取最后一次清洗的溶液0.1mL涂R₂A，或取0.1mL最后一次清洗液加入R₂A培 养液，30℃振荡培养，若48h后无菌生长则认为表面消毒干净)。用灭菌的研砵研碎表面消毒 好的茎，加3mL无菌水，无菌棉布过滤，用无菌水稀释10倍，取0.1mL涂LB平板，每个 点重复3次，28℃培养48h，计数，挑取平板上所有的菌落分离纯化，-70℃、40％甘油 保存备用。

2生防菌株1JN2的筛选

将西瓜细菌性果斑病病原菌燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovoraxavenae)FC440(Jianjun Feng，Erin L.Schuenzel，Jianqiang Li，and Norman W.Schaad.2009.Multilocus Sequence  Typing Reveals Two Evolutionary Lineages of Acidovorax avenae subsp. Citrulli.Bacteriology.99(8)：913-920)在LB培养液(氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵 母浸粉5g/L，调节pH值为7.2)中培养16-24h至CFU为10⁸/ml)，加入熔化冷却至40℃左右的 固体培养基中，体积比1∶200，将培养基每20mL倒入9cm直径的平板中。待冷却凝固后，牙签 接种生防菌1JN2。置于28℃恒温培养箱培养，24h后记录抑菌圈环径，挑取抑菌圈最大的命名 为1JN2，于2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.5731。

3生防菌株1JN2的鉴定

3.1生防菌株1JN2的形态特征

菌落扁平、灰白色，边缘波纹状，较粘稠，菌体直杆状，大小为2.0×0.5μm，单生、 对生或成短链状、丝状，周生多根鞭毛，内生孢子为椭圆形，在末端未膨大的孢子囊中，好气 性，革兰氏反应阳性。

3.2生防菌株1JN2的生理生化特征

将生防菌1JN2活化在LB平板上(氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调 节pH值为7.2)，28℃培养24h，用牙签挑取单菌落分别接种到蛋白酶，几丁质酶，纤维素酶， 以及嗜铁素酶活测定的平板上，置于28℃恒温培养箱培养，培养2-3d，测量透明圈直径的大 小。

表1.Bacillus axarquiensis 1JN2的生理生化特征

3.3生防菌株1JN2的分子学鉴定

细菌基因组试剂盒(赛百盛公司)提取细菌基因DNA后，用gyrB通用引物gyrB1(SEQ ID  NO.1)；gyrB2R(SEQ ID NO.2)从基因组DNA中扩增出gyrB基因片段。具体扩增体系及程序 (25ul)如下：引物gyrB1、gyrB2R(10μM)各1μl；Mix：12.5μl；Taq：0.5μl。ddH₂O： 10μl；模板：1μl。94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火2min，72℃ 延伸2min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电 泳进行检测，90V，30min；EB染色30min，检测扩增产物。扩增产物纯化后连接到pMD19-T 载体，转化于Escherichia coliDH5α，提取阳性克隆质粒，委托TaKaRa公司测序，提交NCBI (National Center for Biotechnology Information)进行比对。与登录号为DQ903178.1 的Bacillus axarquiensis strain LMG 22476DNA gyrase subunit B(gyrB)基因比对，相 似度为99％，因此鉴定1JN2为Bacillus axarquiensis。

实施例2蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂的制备

将上述防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2(CGMCC NO.5731)在LB培养液28℃180 rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品 中活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL，以下称该生防菌剂为蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂。

实施例3蜡质芽孢杆菌1JN2温室促生试验

将催芽后的西瓜种子播种于装有无菌土壤中盆砵中，每盆一粒，16/8h光周期。待西瓜 长到6叶期时，将悬浮好的蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂(实施例2制备，下同)以10⁸CFU/ml 的浓度用手动式喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面，使叶片湿润而菌剂又恰好不流下来。置 于温室中培养，28℃，70％相对湿度以上，生防菌接种30天后，分别取处理组和对照组植株， 小心剔除根部土壤，清洗干净后，自然风干，分别统计地上部长，地下部长，植株鲜重。60℃， 烘干72h后测量植株干重。

生物量增加(％)＝(处理组植株干重-对照植株干重)/对照植株干重×100％

表2.Bacillus axarquiensis 1JN2对西瓜苗期的促生作用

温室促生试验结果显示，芽孢杆菌1JN2能够显著促进西瓜的生长，表现在西瓜的鲜根重， 鲜茎重，干根重，干茎重，根长，茎长，与对照相比，都有显著的增加，结果计算得蜡质芽孢 杆菌1JN2对西瓜的生物量增加能达55.92％。

实施例4蜡质芽孢杆菌1JN2温室大棚防效试验

将催芽后的西瓜种子播种于装有无菌土壤中盆砵中，每盆一粒，播种前保持土壤较为干燥。 待西瓜长到6叶期时，将悬浮好的蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂以10⁸CFU/ml的浓度用手动式 喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面，使叶片湿润而菌液又恰好不流下来，随后置于温室中培 养，28℃，70％相对湿度以上，16/8h光周期。待接种生防菌5天后，进行病原菌的接种，接 种浓度为10⁷CFU/ml，同样用手动式喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面，使叶片湿润而菌液 又恰好不流下来，接种前所有植株均未发病，接种病原菌3天后，开始发病并统计其发病率， 并计算防效。

西瓜细菌性果斑病叶片分级标准：(Ofir Bahar(2009))

发病率统计(病情统计)：分为0、1、2、3、4、5、6七个等级

0级：不发病；

1级：病叶上有零星病斑，病斑占叶面积的10％以下；

2极：病叶上有少量病斑，病斑占叶面积的11％～25％；

3级：病叶上病斑数量中等，病斑占叶面积的26％～50％；

4级：病叶上病斑数量较多，病斑占叶面积的51％～75％；

5级：病叶上有许多病斑，病斑占叶面积的76％～90％；

6级：病叶上有大量病斑，病斑占叶面积90％以上；

病害严重度％＝[∑(病级株数×代表级数)/植株总数×最高代表级值]×100％；

防效％＝(对照发病率-处理防病率)/对照发病率×100％；

表3.Bacillus axarquiensis 1JN2对西瓜细菌性果斑病的防效

试验结果显示，蜡质芽孢杆菌1JN2能够显著降低西瓜细菌性果斑病的发病率，其平均防效 达50.13％。