一种双重TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测黄病毒和甲病毒的非诊断性方法

摘要

本发明公开了一种双重TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测黄病毒和甲病毒的非诊断性方法，该非诊断性方法包括针对黄病毒序列中NS5基因和甲病毒序列中NS1基因所设计的互补序列，对待检样本进行实时定量检测，采用常规反转录PCR扩增及实时荧光定量PCR技术，简化了虫媒病毒检测过程，替代了操作复杂、技术难度大、试验时间长的病毒分离技术，提高了检测时的生物安全性，建立一种高通量快速、敏感的检测与筛选黄病毒属和甲病毒属病毒的方法，并在虫媒病毒的检测方面发挥了重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种双重TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测蚊虫标本中黄病毒和甲病毒的非诊断性方法。 

背景技术

虫媒病毒(arbovirus)是指通过吸血的节肢动物叮咬敏感的脊椎动物而引起的自然疫源性疾病及人兽共患病的一组病毒。主要集中在黄病毒科黄病毒属、披膜病毒科甲病毒属、呼肠孤病毒科和布尼亚病毒科，以黄病毒属病毒对人类的危害最大。人、畜被携带病毒的节肢动物叮咬而感染，不但造成人类疾病和死亡，更会造成大批牲畜发病甚至死亡，造成巨大经济损失，成为各国的公共卫生问题。 

目前，虫媒病毒鉴定的金标准是病毒分离，但因其操作繁琐、技术难度大、耗时长、实验条件要求高、并存在严重的生物安全问题，在实际工作中难以推广应用。 

近年来应用广泛的常规反转录PCR扩增(retro-transcript-PCR，RT-PCR)及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)在虫媒病毒的检测方面发挥了重要作用。但是，目前使用的RT-PCR、实时荧光PCR大多是针对某一种虫媒病毒的检测。本发明利用TaqMan探针实时荧光RT-PCR技术，建立一种快速、敏感的检测和筛选黄病毒属和甲病毒属病毒的方法，应用于虫媒病毒的监测检测。 

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种高通量快速检测和筛选黄病毒、甲病毒的双重TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测的非诊断性方法。 

为实现上述目的，本发明一种双重TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测黄病毒及甲病毒的非诊断性方法，该非诊断性方法包括： 

设计了两对引物和探针对待检样本进行实时定量检测，两对引物和探针序列分别为： 

针对黄病毒序列中NS5基因设计的互补序列： 

针对甲病毒序列中NS1基因设计的互补序列： 

进一步，所述NS5基因的互补序列中探针连接的荧光基团为：FAM-BHQ1，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端连接淬灭基团。 

进一步，所述该淬灭基团为BHQ1非荧光淬灭基团。 

进一步，所述NS1基因的互补序列中探针连接的荧光基团为：TXR-BHQ2，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是TXR，3’端连接淬灭基团。 

进一步，所述该淬灭基团为BHQ2非荧光淬灭基团。 

进一步，所述该非诊断性方法包括步骤： 

1)样本用裂解液和RNA抽提液处理，提取病毒RNA； 

2)实时荧光RT-PCR反应，配制一定组分浓度的25μLPCR反应体系，混匀后短暂离心分装到PCR管中； 

3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增； 

4)收集荧光信号，检测Ct值。 

进一步，所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下： 

根据待检样品数n个配制n+1或n+2个除模板RNA外的体系，混匀后短暂离心分装到PCR管中，并采用本领域的标准扩增条件。 

本发明的有益效果在于：采用常规反转录PCR扩增(retro-transcript-PCR，RT-PCR)及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术简化了虫媒病毒检测过程，替代了操作复杂、技术难度大、试验时间长的病毒分离技术，提高了检测时的生物安全性，建立一种快速、敏感的检测与筛选黄病毒属和甲病毒属病毒的方法，并在虫媒病毒的检测方面发挥了重要作用。 

附图说明

图1为登革病毒RNA扩增曲线； 

图2为基孔肯雅病毒RNA扩增曲线。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐释本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例中所使用的两对引物和探针序列分别为： 

①针对黄病毒序列中NS5基因设计的互补序列： 

②针对甲病毒序列中NS1基因设计的互补序列： 

实施例1 

1.待检样品为登革病毒液，阳性对照为含有乙脑病毒RNA和盖塔病毒RNA的混合模板，阴性对照为RNase-Free Water。 

2.登革病毒RNA的提取：按QIAamp Viral RNA Mini Kit使用说明书提取样品RNA，具体操作步骤如下： 

①根据样本的数量分装裂解液AVL，每管560μl； 

②取140μl病毒液加入到560μl分装好的AVL，涡旋震荡15s，充分混匀，室温孵育10分钟； 

③每管分别加入560μl的无水乙醇(96％-100％)，震荡15秒充分混匀，快速离心； 

④从试剂盒中取出带滤柱的2ml的收集管，打开包装，做好标记。取步骤③中的混合液630μl加入到收集管中，8000rpm离心1分钟； 

⑤将滤柱放置到新的2ml收集管中，将剩余的混合液全部吸入到滤柱中，8000rpm离心1分钟； 

⑥取一个干净的2ml收集管，将滤柱移至新的收集管中，加入500μl洗脱液AW1，8000rpm离心1分钟； 

⑦离心后，弃液，将滤柱放置到一个新的收集管中，加入500μl洗脱液AW2，14000rpm离心3分钟。弃液，再离心一次，以去除乙醇； 

⑧将离心后的滤柱移到干净的1.5ml EP管中，加入60μl溶解液AVE，静置2分钟，12000rpm离心1分钟，即得到病毒RNA。 

3.配制反应体系 

每个反应管中包含以下试剂： 

在1.5mL离心管中配制4个除模板RNA外的体系，混匀后短暂离心分装到3个PCR反应管中，分别加入阴性对照、乙脑病毒疫苗RNA、阳性对照。 

4.上机，按如下反应条件进行扩增： 

扩增条件：采用本领域的标准扩增条件。 

45℃15分钟 

95℃10分钟 

5.收集荧光信号，检测Ct值； 

6.结果判断：根据阳性对照，阴性对照Ct值判断。当Ct值小于等于37时即判断为阳性。图1中红色为阳性对照，绿色为登革病毒RNA的扩增曲线Ct值20.1。 

实施例2 

1.基孔肯雅病毒RNA的提取：用QIAamp Viral RNA提取试剂盒，按说明书操作。 

具体操作步骤如下： 

①根据样本的数量分装裂解液AVL，每管560μl； 

②取140μl病毒液加入到560μl分装好的AVL，涡旋震荡15s，充分混 匀，室温孵育10分钟； 

③每管分别加入560μl的无水乙醇(96％-100％)，震荡15秒充分混匀，快速离心； 

④从试剂盒中取出带滤柱的2ml的收集管，打开包装，做好标记。取步骤③中的混合液630μl加入到收集管中，8000rpm离心1分钟； 

⑤将滤柱放置到新的2ml收集管中，将剩余的混合液全部吸入到滤柱中，8000rpm离心1分钟； 

⑥取一个干净的2ml收集管，将滤柱移至新的收集管中，加入500μl洗脱液AW1，8000rpm离心1分钟； 

⑦离心后，弃液，将滤柱放置到一个新的收集管中，加入500μl洗脱液AW2，14000rpm离心3分钟。弃液，再离心一次，以去除乙醇； 

⑧将离心后的滤柱移到干净的1.5ml EP管中，加入60μl溶解液AVE，静置2分钟，12000rpm离心1分钟，即得到病毒RNA。 

2.配制反应体系： 

3.上机，按如下反应条件进行扩增： 

扩增条件：采用本领域的标准扩增条件。 

45℃15分钟 

95℃10分钟 

4.收集荧光信号，检测Ct值 

5.结果判断：根据阳性对照，阴性对照Ct值判断。当Ct值小于等于37时即判断为阳性。图2中红色为阳性对照，蓝色为基孔肯雅病毒RNA的扩增曲线Ct值20.6。 

上述病毒是从试剂盒中提取的，本发明公开的检测方法并非以人体和动物为对象，只是为了检测是否具有病毒，不是以诊断为目的，不属于疾病的诊断方法。 

除非特殊定义，本发明描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。 

除非特殊指明，本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或供应商提供的说明书进行。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国检验检疫科学院

 

<120>  一种双重TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测黄病毒和甲病毒的非诊断性方法

 

<130>  发明

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  59

<212>  DNA

<213>  针对黄病毒序列中NS5基因设计的互补序列

 

<400>  1

caacatgatg ggraaragch agrgcttcra actchagctc cvagccacat gtaccatat      59

 

 

<210>  2

<211>  62

<212>  DNA

<213>  针对甲病毒序列中NS1基因设计的互补序列

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (22)..(22)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<400>  2

gcaggtcacw smbaatgaca tnggrcaray rcartgcatg ctaatgcyag agcgttttcg     60

 

ca                                                                    62