一种大菱鲆未受精卵的质量检测方法

摘要

本发明涉及一种大菱鲆未受精卵的质量检测方法，当大菱鲆未受精的卵子RNA浓度在0.780±0.001μg/卵时，且Pr∶RNA∶DNA为227-250∶12-13.5∶1-1.2时，受精率和孵化率最高，此时卵子质量最佳。本发明的方法可以快速有效的对大菱鲆卵子质量进行检测，从而可以快速确定待研究的卵子是否符合生产需求，提高了生产效率，同时进一步完善了硬骨鱼类卵子质量评价体系，为研究其他养殖海水鱼类卵子质量评价提供了有效平台和借鉴。

说明书

技术领域

本发明属于卵子质量检测技术领域，具体是一种大菱鲆未受精卵的质量检测方法。 

背景技术

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是当前欧洲的重要海水养殖鱼类之一，自1992年大菱鲆被引进中国以来，在水产科研工作者和养殖企业的共同努力下，大菱鲆在工业化养殖领域取得了重大成效，最高年产量达5万吨以上，年产值逾40亿元，从而成为我国水产养殖业一个新的经济增长点。 

在大菱鲆等硬骨鱼类人工繁养殖过程中，卵子的质量是影响繁殖性能的一个关键因素，它直接关系到胚胎的发育以及仔、稚、幼鱼的成活和生长，与养殖效率密切相关。雌性亲鱼的营养状况和养殖环境中的光照、水温变化是影响卵子质量的主要因素，此外人工繁育过程催产剂的使用和不同的养殖模式也会对卵子的质量产生影响，因此需要对卵子的质量进行客观、快速的检测，从而优化亲鱼培育，提高养殖效率，同时筛选出的高质量卵子也为深入研究海水硬骨鱼类胚胎发育调控机制提供了有效的平台和保障。目前对大菱鲆卵子质量的评价通常是对其外观形态及生产性状检测，如色泽、沉浮性、受精率和死亡率等。从外观上进行检测虽然速度快，但准确率低；而通过孵化率来检测，虽然具有最高的准确率，但却耗时耗力，无法在最短时间内给出实验结果数据。因此，提供一种快速有效的大菱鲆卵子质量评价方法，可为大菱鲆规模化苗种选育提供技术基础。 

发明内容

本发明目的是提供一种评价大菱鲆卵子质量的新方法，采用此方法可以弥补现有技术的不足，进一步完善卵子质量评价体系。 

本发明通过对大菱鲆未受精卵子内脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)和蛋白质(protein，Pr)含量的检测，同时结合相应的卵子受精率和孵化率的测定，建立一种评价大菱鲆卵子质量的新方法，为大菱鲆卵子质量评价提供可靠的技术手段。 

申请人在长期的研究中发现，当大菱鲆未受精的卵子RNA浓度在0.780±0.001μg/卵时，且Pr∶RNA∶DNA为227-250∶12-13.5∶1-1.2时，受精率和孵化率最高，此时卵子质量最佳。 

本发明的方法，具体操作如下：首先精确计数卵子的数量，然后将收集的 卵子用无菌蒸馏水冲洗后，通过常规的分子生物学方法获得DNA，DNA，Pr的含量，最后确定卵子的质量。 

上述精确计数卵子的量，可以采用手工计数的方法，也可以采用便携式大菱鲆卵子快速计数板来计数，所述的计数板包括有一个基板，其特征在于，在基板内有用于测量大菱鲆卵子数量的测量孔，所述的测量孔的尺寸(长×宽×高)为10mm×10mm×1mm、20mm×20mm×1mm、40mm×40mm×1mm或124mm×50mm×1mm中的任一种或几种；且测量孔的底部开有不少于一个的用于排水的筛孔，筛孔的直径在0.5mm以内。 

上述的计数板，还包括有一个用于承载基板的底座。 

上述的基板，其长×宽×高尺寸为130mm×128mm×5mm；可以设置有四排测量孔，第一排为10个10mm×10mm×1mm的测量孔，第二排为5个20mm×20mm×1mm的测量孔，第三排为3个40mm×40mm×1mm的测量孔，第四排为1个124mm×50mm×1mm的测量孔。 

所述的获得DNA，DNA，Pr的含量，分别采用CTAB，Trizol，SDS裂解提取法来获得。 

本发明的方法可以快速有效的对大菱鲆卵子质量进行检测，从而可以快速确定待研究的卵子是否符合生产需求，提高了生产效率，同时进一步完善了硬骨鱼类卵子质量评价体系，为研究其他养殖海水鱼类卵子质量评价提供了有效平台和借鉴。 

附图说明

图1：本发明用到的计数板的立体结构示意图； 

图2：本发明用到的计数板的平面示意图； 

其中：1、基板2、测量孔3、筛孔4、底座。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法进行详细描述： 

1)确定卵子量： 

用吸管分别吸取1ml、3ml、5ml、10ml大菱鲆卵子和卵巢液的混合物，置于便携式大菱鲆卵子快速计数板顶板内大小不一的方格内，然后计算得出每毫升卵子和卵巢液的混合物中的卵子数，最后根据卵子和卵巢液的混合物体积得出卵子数量； 

计数板可以用塑料等材质制成，例如用于制备96孔细胞培养板的材料也可 以用来制备本发明的计数板。在外形上，计数板同目前使用的细胞培养板类似(如图1)，包括有作为载体的基板1，和用于盛放基板1的底座4，底座4可以用来承接由基板1中漏出的液体。 

基板1为一个长方形面板，一种尺寸如下：长130mm、宽128mm、高5mm，再基板上可以设有大小不同的19个测量孔2，第一排10个(长10mm、宽10mm、高1mm)、第二排5个(长20mm、宽20mm、高1mm)、第三排3个(长40mm、宽40mm、高1mm)、第四排1个(长124mm、宽50mm、高1mm)，测量孔2与测量孔2之间的距离为2mm，测量孔2底部有圆形的筛孔3、孔直径在0.5mm以内(图1)。因为大菱鲆正常卵子直径在0.9-1.1mm之间，所以10mm×10mm×1mm方格内卵子数目约为100个、20mm×20mm×1mm方格内卵子数目约为400个、40mm×40mm×1mm方格内卵子数目约为1600个、124mm×50mm×1mm方格内卵子数目约为6200个。而筛孔3的尺寸可以保证卵子不会漏出，而液体则可以排出，从而保证测量时的准确性。筛孔3的数目可以为任意多个。 

另外，测量孔2在基板1上的分布也有很多的选择，即可以是单一大小的测量孔，也可以是不同大小的测量孔之间的组合，具体根据使用者的习惯确定。 

2)三种物质提取、定量的描述： 

精确计数卵子数量后，取100个卵，无菌蒸馏水冲洗3次后，分别采用CTAB，Trizol，SDS裂解提取法提取DNA，RNA，Pr，利用紫外分光光度计检测其浓度。 

DNA提取和定量 

●取卵子100个，置于1.5ml EP管中，适当剪切后立即加入0.5ml 65℃预热的2×CTAB提缓冲液，充分混匀，65℃保温10～20min； 

●加入等体积的氯仿，轻轻颠倒离心管混匀，室温下，12000rpm，离心10min； 

●将上清液转入另一个1.5ml EP管中，加入1/10体积的10％的CTAB，混合均匀， 

●加入等体积氯仿，颠倒混匀，室温下12000rpm，离心10min；取上清，重复该步骤一次； 

●将上层水相转入另一新的1.5ml EP管中，加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温静置30min后，DNA以沉淀形式出现，用枪头小心挑出沉淀，并将沉淀转移到1.5ml的离心管中，用70％的乙醇洗沉淀两次，室温干燥沉淀，肉眼观察DNA呈无色胶冻样，加50μl超纯水溶解DNA； 

●DNA浓度的测定：用紫外分光光度计(Nanodrop)检测DNA的浓度，计算得出卵子DNA含量。 

RNA提取和定量 

●加1ml Trizol到卵子中(100个)，反复吹打，使卵子充分溶解，室温静置5min后，转入1.5m1经DEPC处理EP管； 

●每EP管加入200μl氯仿，在漩涡器上剧烈振荡15～30s，充分混匀； 

●在4℃下，12,000rpm离心15min，离心后EP管内分三相：下层红色的酚相，中间层为白色氯仿相，上层为无色的水相； 

●将上层水相小心吸400μl至经DEPC处理的新EP管中，加入等体积的异丙醇，室温放置15min后，4℃，12,000rpm离心10min； 

●弃去上清，用1ml 75％的乙醇(0.1％DEPC作溶剂)清洗沉淀，剧烈震荡，4℃以7,500rpm离心10min，用微量移液器将乙醇吸尽，室温放置数分钟风干，肉眼观察RNA呈无色胶冻样最佳(15min左右)； 

●RNA浓度的测定：50μl超纯水溶解RNA，用紫外分光光度计(Nanodrop)检测RNA的浓度，计算得出卵子RNA含量。 

Pr提取和定量 

●把卵子(100个)适当剪切后，加入150μl融解SDS裂解液，混匀，充分裂解(3-5min)； 

●充分裂解后，10000～14000rpm离心3-5min，取上清，用紫外分光光度计(Nanodrop)562nm处BCA法测定蛋白浓度，计算得出卵子蛋白子含量。 

通过受精率和孵化率检测该方法的准确度。 

将同一来源的卵子，一部分测定DNA、RAN、Pr的含量，一部分进行受精率和孵化率的检测。同时对不同处理、养殖条件下的卵子进行平行实验，在相同的条件下受精和孵化，利用便携式大菱鲆卵子快速计数板统计受精率和孵化率。 

受精率统计：卵子受精2～4小时后，吸管分别吸取1ml、3ml、5ml、10ml大菱鲆卵子和海水的混合物，置于便携式大菱鲆卵子快速计数板顶板内大小不一的方格内，待海水从方格底部筛孔中流出后，在倒置显微镜下观察受精卵发育情况(正常受精卵此时发育至四细胞期，未受精卵发育停止)，根据方格容纳量不同，计数卵子，计算得出卵子受精率；受精率＝正常发育卵子数/总卵数 

孵化率统计：卵子受精后，每间隔12小时，吸取沉于孵化网箱底部的死卵(发育正常的卵子浮于水层表面)，置于便携式大菱鲆卵子快速计数板顶板内大 小不一的方格内，根据方格容纳量不同，计数发育失败的卵子数；待仔鱼孵化后，统计孵化仔鱼总数，计算得出孵化率； 

孵化率＝孵化仔鱼数/(沉卵总数+孵化仔鱼数) 

在胶南通用水产有限公司亲鱼车间内进行试验，取产卵期的雌性亲鱼20尾，分别挤卵后用吸管分别吸取两次各10ml的卵子和卵巢液的混合物，并用本发明的计数板确定个数后，其中10ml的卵子用于进行受精率和孵化率的检测，10ml用于提取三种分子，并定量。将20组的数据进行分析后，得到如下表的数据： 

  RNA(μg/卵)   Pr∶RNA∶DNA   受精率   孵化率   0.205±0.001   231-251∶3-4∶1-1.2   33.20±0.35   22.70±1.48   0.780±0.001   227-250∶12-13.5∶1-1.2   86.83±2.21   66.49±4.76   0.230±0.012   231-258∶3.5-4.7∶1-1.1   44.66±0.85   30.72±4.69

结果显示未受精的卵子RNA浓度在0.780±0.001μg/卵时，且Pr∶RNA∶DNA在227-250∶12-13.5∶1-1.2时，受精率和孵化率最高，此时卵子质量最佳。

在不同养殖厂对不同来源大菱鲆的卵子质量进行检测，结合受精率和孵化率的验证，结果表明本发明的检测标准可以有效的确定卵子的质量好坏，从而为养殖和科研提供了翔实和有效的试验数据。