一种促进花生四烯酸油脂高效积累的方法

摘要

本发明公开了一种促进花生四烯酸油脂高效积累的方法，将高山被孢霉(Mortierella alpina)菌种经活化培养后，在碳源和其它营养物质丰富的培养基上进行菌体快速增殖培养，收集菌体，再在碳源丰富而其它营养物质缺乏的培养基上进行油脂快速积累培养，收集菌体，最后在缺碳的培养基上进行花生四烯酸快速积累培养，收集菌体。本发明技术实现对花生四烯酸油脂发酵过程各个阶段的精确调控，具有操作简单，生产周期短，花生四烯酸生产强度大，油脂品质好等特点，易于在工业化中应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种基于培养基成分阶段性变化促进花生四烯 酸油脂高效积累的方法。

背景技术

花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA，即5，8，11，14-二十碳四烯酸)属于n-6系 列长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)，是人体中含量最高、分布最广和最活跃的一种必需 PUFAs(Lombardo Y B，Hein G，Chicco A.Lipids，2007，42(5)：427-437)。是前列腺素、环 前列腺素和白三烯类等衍生物的直接前体，具有多种生物活性，在促进智力发育、提 高人体视力、降低血脂、增强免疫力和抗癌等方面具有重要作用，在生物医药、化妆品、 功能性食品和保健品等领域都有着广泛的应用。

由于花生四烯酸在成年人体内合成量极少，婴幼儿体内则无法合成，因此从食物中 摄取额外的花生四烯酸对人体许多组织特别是脑组织的生长发育至关重要。2009年卫生 部公布：“花生四烯酸作为高级营养强化剂在婴幼儿食品中的添加量扩大到230 mg/100g”。

花生四烯酸的传统来源是从动物肝脏、猪肾上腺、蛋黄中提取(Gill I，Valivety R. Trends in biotechnology，1997，15(10)：401-409)，但动物组织中的花生四烯酸含量很低(约 为0.2％)，来源少，且受季节限制，价格昂贵，无法满足日益增长的市场需求(Chen H， Chang C，Chen C.Journal of the American Oil Chemists′Society，1997，74(5)：569-578)。利 用微生物合成法替代传统的花生四烯酸制备方成为当今研究的热点(Jin M J，Huang H， Xiao AH，et al.Bioprocess and Biosystems Engineering，2008，32(1)：117-122)。2011年卫生 部公布食品添加剂花生四烯酸油脂(发酵法)国家标准，要求花生四烯酸含量以花生四 烯酸甘油三酯计应大于等于38％。

目前，花生四烯酸油脂的发酵生产过程中存在着生产强度低、生产周期长等问题， 导致其生产成本居高不下，市场价格昂贵，仅能作为高端营养保健品、化妆品等小规模 使用。目前，花生四烯酸油脂生产过程中主要是采用分批发酵模式，通常只在分批发酵 模式下考虑某一因素对发酵过程的影响，如限氮(Koike Y Cai H J，Higashiyama K，et al. Journal of Bioscience and Bioengineering，2001，91(4)：382-389)，改变溶氧(Higashiyama K， Murakami K，Tsujimura H，et al.(1999).Biotechnology and Bioengineering 63(4)：442-448)， 添加物质(Higashiyama K，Yaguchi T，Akimoto K，et al.Journal of the American Oil  Chemists′Society，1998，75(12)：1815-1819.)；或是对分批发酵进行一些后处理如老化工 艺(黄和，金明杰，任璐静等.花生四烯酸油脂的制备方法[P].CN：101109015.2008)等。 虽然这些方法对花生四烯酸油脂的发酵生产过程起到了一定的调控作用，但效果还很有 限，在限氮，改变溶氧，添加物质等条件下花生四烯酸生产强度低等问题依然没有得到 很好的解决，在老化工艺中虽然花生四烯酸的生产强度得到提高，但生产周期太长为 276h左右，而且这些方法通常不易在工业化中应用。本发明技术是基于微生物油脂的合 成机制，在菌体增殖，油脂积累和花生四烯酸积累的各阶段分别进行精确调控，以提高 各阶段的反应速率为目标，相比于分批发酵工艺显著提高了花生四烯酸油脂的生产强 度，相比于老化工艺显著缩短了生产周期。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种促进花生四烯酸油脂高效积累的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种促进花生四烯酸油脂高效积累的方法，将高山被孢霉(Mortierella alpina)菌种经 活化培养后，在碳源和其它营养物质丰富的培养基上进行菌体快速增殖培养，收集菌体， 再在碳源丰富而其它营养物质缺乏的培养基上进行油脂快速积累培养，收集菌体，最后 在缺碳的培养基上进行花生四烯酸快速积累培养，收集菌体。

其中，所述的活化培养条件为：将菌种接种在PDA斜面培养基上，20-28℃下培养 120-192h，然后再将斜面上的菌丝体接入摇瓶种子活化培养基中，20-28℃、100-250rpm 下活化培养18-24h；其中，所述的摇瓶种子活化培养基的配方为：葡萄糖20-60g/L，酵 母膏3-6g/L，KH₂PO₄ 2-5g/L，NaNO₃ 2-5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3-1.5g/L，溶剂为水。

其中，所述的碳源和其它营养物质丰富的培养基配方为：葡萄糖40-80g/L，酵母膏 6-15g/L，KH₂PO₄ 2-6g/L，NaNO₃ 2-6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-1.5g/L，泛酸钙0.1-2g/L，维 生素0.2-1g/L，溶剂为水；优选配方为：葡萄糖40-60g/L，酵母膏11g/L，KH₂PO₄ 3.8g/L， NaNO₃ 3.4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，泛酸钙0.5g/L，维生素0.2g/L，溶剂为水。

其中，所述的菌体快速增殖培养条件为：接种量5％-20％(v/v)，初始pH5.5-7.5， 温度20-28℃，培养48-72h，转速100-250rpm，通气量0.2-2vvm；优选的培养条件为： 接种量10％(v/v)，初始pH5.5-7.5，温度25℃，培养48～60h，转速125rpm。

其中，所述的碳源丰富而其它营养物质缺乏的培养基配方为：葡萄糖浓度20-60g/L， 泛酸钙0.1-1g/L，维生素0.1-1g/L，溶剂为水；优选的培养基配方为：葡萄糖浓度40-60 g/L，泛酸钙0.25g/L，维生素0.1g/L，溶剂为水。

其中，油脂快速积累培养条件为：pH5-8，温度20-28℃，培养时间24-60h，转速 100-250rpm，通气量0.2-2vvm；优选的培养条件为：pH6.0-6.5，温度25℃，培养时间 48-60h，转速125rpm。

其中，所述的缺碳的培养基配方为：酵母膏1-4g/L，KH₂PO₄ 0.5-1.5g/L，NaNO₃0.5-1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-1g/L，泛酸钙0.2-1g/L，维生素0.1-0.5g/L，溶剂为水；或 NaCl 0.9-3g/L，泛酸钙0.1-1g/L，维生素0.1-1g/L，溶剂为水。所述的培养基配方优选： 酵母膏2.5g/L，KH₂PO₄ 0.8g/L，NaNO₃ 0.7g/L，MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，泛酸钙0.25g/L， 维生素0.1g/L，溶剂为水；或NaCl 0.9g/L，泛酸钙0.25g/L，维生素0.1g/L，溶剂为 水。

其中，所述的花生四烯酸快速积累培养条件为：温度15-25℃，培养时间12-60h， 转速100-250rpm，通气量0.2-2vvm；培养条件优选温度25℃，培养时间36-60h，转速 125rpm。

其中，所述的收集菌体条件为：发酵液离心后，用无菌生理盐水洗涤、离心，重复 洗涤、离心操作1～2次，收集菌体。

将花生四烯酸快速积累培养后得到的菌体真空抽滤收集，烘干，称重及提取油脂， GC-MS检测花生四烯酸。

本发明的有益效果：

本发明建立一种基于培养基成分阶段性变化促进花生四烯酸油脂高效积累的方法， 先在碳源和其它营养物质丰富的培养基上培养进行菌体快速增殖，然后在碳源丰富而其 它营养物质缺乏的培养基上培养进行油脂快速积累，最后在缺碳的培养基上培养进行花 生四烯酸的快速积累。实现对花生四烯酸油脂发酵过程各个阶段的精确调控。本发明成 功解决了老化工艺(黄和，金明杰，任璐静等.花生四烯酸油脂的制备方法 [P].CN：101109015.2008)中花生四烯酸生产周期太长和分批发酵工艺中花生四烯酸生产 强度太低的问题。老化工艺中花生四烯酸生产周期276h，生产强度0.072g/(L·h)；分批 发酵工艺花生四烯酸生产周期180h，生产强度0.029g/(L·h)；本发明花生四烯酸生产周 期144h，生产强度0.079g/(L·h)。具有操作简单，生产周期短，生产强度高，成本低等 特点，易于在工业化中应用。

附图说明

图1为本发明方法的工艺流程图。

图2为不同糖浓度对油脂积累的影响。

图3为不同培养时间对油脂积累的影响。

图4不同pH对油脂积累的影响。

图5为缺碳条件下脂肪酸GC-MS分布图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的 本发明。

以下实施例使用的菌株为高山被孢霉(Mortierella alpina)(保藏编号为CCTCC NO： M 207067)

实施例1：菌种活化。

菌种活化：种子在PDA斜面培养基上25℃培养168h，斜面培养基由下列物质制成： 土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。

种子活化：将斜面上的菌丝体从斜面接入250mL种子摇瓶中进行种子活化培养， 摇瓶装液量为20％(v/v)，种子活化培养基配方为：葡萄糖30g/L，酵母膏6g/L，KH₂PO₄3g/L，NaNO₃ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，溶剂为水；pH6.0，培养条件为：温度25℃， 转速125rpm，培养时间20h。

实施例2：第一阶段菌体快速增殖培养。

将实施例1活化后的种子以10％(v/v)的接种量接到7000mL装有葡萄糖浓度分别为 40、60、80和100g/L的碳源和其它营养物质丰富的培养基的发酵罐中培养，发酵罐装 液量为70％(v/v)，碳源和其它营养物质丰富的培养基除碳源外的营养成分配方为：酵母 膏11g/L，KH₂PO₄3.8g/L，NaNO₃ 3.4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，泛酸钙0.5g/L，维 生素0.2g/L，溶剂为水。培养条件为温度25℃，转速125rpm，培养时间以能把糖尽量 耗完为准。实验结果如表1所示。可见在初糖60g/L时，在60h时葡萄糖耗完，生产强 度达到最大为0.47g/(L·h)，菌体干重为27.43g/L，在100g/L时菌体干重达到最大为 33.9g/L，生产强度最低为0.20g/(L·h)，所以选择初糖60g/L为最佳初糖浓度。

表1不同初糖浓度对菌体增殖的影响

实施例3：第二阶段油脂快速积累培养。

将实施例2(60g/L葡萄糖条件)的菌体收集，菌体收集方法为发酵液在3000rpm 下离心3min，用无菌生理盐水洗涤，洗涤后在同样条件下离心，重复洗涤离心操作两 次，收集菌体。

将收集后的菌体于葡萄糖初始浓度分别为20、40、60、80、100、120g/L，泛酸钙 0.25g/L，维生素0.1g/L，溶剂为水的培养液中培养，培养条件为：温度25℃，转速125rpm， 培养时间48h后，实验结果油脂积累情况如图2所示。可见在初糖低于60g/L，总油脂 随着初糖浓度的增加而增加，但残糖越来越多，在40和60g/L的葡萄糖培养液中总油 脂量分别为25.3和27.9g/L，分别占菌体干重的61％和64％，在48h后初糖40g/L的残 糖为7g/L，而初糖60g/L残糖还有21g/L，所以综合考虑40g/L的初糖比较好。

实施例4：第二阶段油脂快速积累培养。

将实施例2(60g/L葡萄糖条件)的菌体收集，收集后的菌体于葡糖糖40g/L，泛酸 钙0.25g/L，维生素0.1g/L，溶剂为水的培养液中分别培养24、48、72、96和120h， 培养条件为：温度25℃，转速125rpm。实验结果油脂积累情况如图3所示。可见在48h 时总油脂量达到最大为24.8g/L，占菌体干重的64.2％。

实施例5：第二阶段油脂快速积累培养。

将实施例2(60g/L葡萄糖条件)的菌体收集，收集后的菌体于初始pH分别为5.5、 6.0、6.5、7.0和7.5的培养液中培养，培养液配方：葡糖糖40g/L，泛酸钙0.25g/L，维 生素0.1g/L，溶剂为水，培养条件为：温度25℃，转速125rpm，培养时间48h。实验 结果油脂积累情况如图4所示。可见在初始pH为6.5时总油脂量达到最大为26.87g/L。

实施例6：第三阶段花生四烯酸快速积累培养。

将实施例5(初始pH6.5的条件)油脂积累段培养后的菌体收集，收集方法为油脂 积累培养阶段后的发酵液在2500rpm下离心3min，用无菌生理盐水洗涤，洗涤后在同 样条件下离心，重复洗涤、离心操作2次，收集菌体。

将收集后的菌体，于pH7.5的缺碳培养基中培养，培养基配方：酵母膏2.5g/L， KH₂PO₄ 0.8g/L，NaNO₃ 0.7g/L，MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，泛酸钙0.25g/L，维生素0.1g/L， 溶剂为水，培养条件为：温度25℃，转速125rpm，培养时间分别为12、36和60h。

将第三阶段培养后的菌体真空抽滤收集，烘干，用GC-MS检测花生四烯酸占总脂 肪酸含量的测量：方法如下：

混合脂肪酸甲酯的制备：取干菌体0.1g于5mL离心管中，加入2mL色谱专用正己 烷和0.2mL 4mol/LKOH-甲醇溶液，摇均，静置10min。3000rpm下离心3min，取0.3mL 上清液于1.5mL离心管中，再加入0.5mL去离子水，摇均，3000rpm下离心3min。取 上层清液0.05mL于1.5mL离心管中加入0.8mL色谱纯正己烷，再加入少许无水Na₂SO₄(用于吸水)，取1μL进样。

GC-MS条件：用Thermo finnigan trace GC2000 DSQ气相色谱质谱联用仪测定菌油 组成。天B-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。进样室温度250℃，载气为氦气， 载气流速1mL/min。程序升温：初温80℃，以40℃/min升温到200℃，然后10℃/min 到300℃。传输线温度250℃，电离方式EI，70Ev，扫描范围50～600aum。

实验结果花生四烯酸含量在12、36和60h分别为36.2％，41.9％，41.2％。表明在 36h时花生四烯酸含量达到最大为41.9％，如图5所示。

实施例7：

将实施例5(初始pH6.5的条件)油脂积累段培养后的菌体收集，收集方法为油脂 积累培养阶段后的发酵液在2500rpm下离心3min，用无菌生理盐水洗涤，洗涤后在同 样条件下离心，重复洗涤、离心操作2次，收集菌体。

将收集后的菌体，于pH7.5的缺碳培养基中培养，缺碳培养基成分配方为：NaCl 0.9 g/L，泛酸钙0.25g/L，维生素0.1g/L，溶剂为水，培养条件为：温度25℃，转速125rpm， 培养时间分别为12、36和60h。

将第三阶段培养后的菌体真空抽滤收集，烘干，用GC-MS检测花生四烯酸方法同 实施例6。实验结果花生四烯酸含量在12、36和60h分别为38.3％，42.6％，42.3％。可 见在36h时花生四烯酸含量达到最大为42.6％。

实施例8：

菌种活化：种子在PDA斜面培养基上25℃培养168h，斜面培养基由下列物质制成： 土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。

种子活化：将斜面上的菌丝体从斜面接入250mL种子摇瓶中进行种子活化培养， 摇瓶装液量为20％(v/v)，种子活化培养基配方为：葡萄糖30g/L，酵母膏6g/L，KH₂PO₄3g/L，NaNO₃ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，溶剂为水；pH6.0，培养条件为：温度25℃， 转速125rpm，培养时间20h。

以菌体增值为目标的培养：将活化后的种子以10％(v/v)的接种量接到7000mL装有 碳源和其它营养物质丰富的培养基中培养，发酵罐液量为70％(v/v)，碳源和其它营养物 质丰富的培养基配方为：葡萄糖60g/L，酵母膏11g/L，KH₂PO₄ 3.8g/L，NaNO₃ 3.4g/L， MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，泛酸钙0.5g/L，维生素0.2g/L，溶剂为水。培养条件为温度25℃， 转速125rpm，培养时间60h。

以油脂积累为目标的培养：将菌体增殖阶段后的菌体收集，于初始pH6.5的碳源丰 富而其他营养物质缺乏的培养基中培养，培养基配方为：葡糖糖40g/L，泛酸钙0.25g/L， 维生素0.1g/L，溶剂为水，培养条件为温度25℃，转速125rpm，培养时间48h。

花生四烯酸积累为目标的培养：将油脂积累阶段后的菌体收集，于初始pH7.5的缺 碳的培养基中培养，缺碳培养基成分配方为：NaCl 0.9g/L，泛酸钙0.25g/L，维生素0.1 g/L，溶剂为水，培养条件为温度25℃，转速125rpm，培养时间36h。

实验结果为：总培养周期144h，生物量：41.6g/L，总油脂量26.6g/L，花生四烯酸 11.4g/L，花生四烯酸生产强度为0.079g/(L·h)。

对比例：分批发酵实验。

将实施例8活化后的种子以10％(v/v)的接种量接到正常的发酵培养基中，正常发酵 培养基配方为：葡萄糖80g/L，酵母膏11g/L，KH₂PO₄ 3.8g/L，NaNO₃ 3.4g/L， MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，泛酸钙0.5g/L，维生素0.2g/L，溶剂为水。培养条件为温度25℃， 转速125rpm，培养时间180h，实验结果为：生物量为28.33g/L；总油脂量为14.36g/L； 花生四烯酸量5.20g/L，花生四烯酸生产强度0.029g/(L·h)。