一种面向空间的微体积单位的实时荧光PCR工作系统

摘要

一种面向空间的微体积单位的实时荧光PCR工作系统，属于生物学、分析化学及医学检测领域；包括有组成温度循环控制装置的陶瓷制冷片(1)，电热膜(2)，硬质透明塑料(3)，导热通道(8)，温度传感器(9)，橡胶活塞(10)；作为激发光单元的LED发光二极管(4)，激发光滤光片(5)，作为荧光光谱检测装置的硅光电池(6)，检测光滤光片(7)；还包括用于控制陶瓷制冷片(1)制冷，电热膜(2)加热的外接微处理器、对于控制参数进行输入和输出的键盘及显示屏。本系统符合结构微缩、功能集成、重量轻体积小全自动化检测的目标。光激发和荧光检测与待检测物零距离接触，不受重力要求，使得检测结果稳定，不受干扰，更适应空间工作要求。

说明书

技术领域

本发明涉及一种面向空间的微体积单位的实时荧光PCR工作系统，主要 适用于在失重条件下的空间范围内应用的实时荧光PCR工作，属于生物学、 分析化学及医学检测领域。

背景技术

随着我国载人航天技术的日趋成熟，航天任务周期的逐渐延长，对航天员 健康保障的要求也会越来越高。航天器中处于非监控状态的微生物严重威胁航 天员的健康。美俄中长期飞行的相关结果显示，乘员舱内检测出了234种微生 物，细菌共有40个属，108个种，其中致病性细菌有20余种，这些病原菌能 导致航天员感染多种疾病，乃至影响飞行任务的顺利完成。长期航天飞行中， 微生物菌群的增长及菌株变异会影响仪器设备的性能及工作环境条件，对航天 器及其仪器设备的正常运行产生危害。同时，航天飞行器上携带有能在太空环 境下生存的微生物，有可能通过人类或航天器带到空间站、火星表面，会对人 类研究太空生命形式造成不利影响。为了预防空间飞行中感染性疾病的发生、 传播和进行有效治疗，必须严密监控航天器中的微生物。

聚合酶链式反应(PCR)是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩 增技术，由高温热变性(94℃左右)、低温退火复性(50～60℃)和适温延伸(72 ℃)组成一个周期，一个循环可以使DNA总量增加一倍，可以把痕量的遗传 物质迅速而简便的扩增百万倍，再使用基于FRET(荧光共振能量传递技术) 进行荧光实时检测，根据荧光强度以及强度相对变化的信息，可对PCR产物 进行定性定量分析。

基于上述原理的实时荧光定量PCR仪，可达到对空间范围内作业的航天 器内微生物的的监测。实时定量PCR仪采用激光器或荧光激发光源进行实时 监测，保证稳定无干扰的荧光激发，由一系列透镜、滤镜和一个双色镜组成光 学系统将激发荧光聚焦到光谱仪上，光谱仪以间隔的方式将荧光按照波长的不 同分开，进入电荷耦合元件(CCD相机)或光电倍增管，序列检测应用软件从电 荷耦合元件(CCD相机)或光电倍增管中收集这些荧光信号，对数据进行分析。 目前为止，基于上述反应及检测原理的商品化的PCR仪种类繁多。国外的品牌 主要有ABI、Roche、MJ、Bio-Rad、Stratagene、Corbtt、Cepheid等，国 内的杭州博日、广州达安基因和上海枫岭等。

显然这类仪器对于进行空间作业要求的实时荧光PCR工作有着以下缺点：

1、体积庞大，不利于携带。由于光电倍增管或电荷耦合元件自身的体积 就很大，而且又是分体使用，需要有配套的光路系统，致使整个荧光微光谱检 测系统的体积庞大，很难再进行微小化。

2、由于光激发单元和光接收单元在传输时使用许多光纤作为光传输系统， 不可避免在光纤耦合过程中存在光能量损耗，使得整个检测系统灵敏度的提高 受到严重限制。

3、由于在激发光传导和反射光采集时需要各类光学器件和光纤组成的光 路进行光传输，这影响了光谱检测系统在实际使用中的稳定性。

4、由于检测并未达到零距离接触的测量方式，使得微光谱检测受到非检 测对象物质，如组成微通道壁物质的干扰，造成测量误差。

发明内容

本发明涉及一种面向空间的微体积单位的实时荧光PCR工作系统，主要 用于在空间范围失重条件下应用的，对PCR反应进行实时荧光检测。目的在 于将温度循环控制装置、激发光传导装置、荧光光谱检测装置这三个部分集成， 实现适用于空间作业要求的便携式微型化PCR荧光实时检测系统，达到功能 集成、结构缩微、重量轻体积小全自动检测的目标。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种面向空间的微体积单位的实时荧光PCR工作系统，其包括有组成温 度循环控制装置的陶瓷制冷片1，电热膜2，硬质透明塑料3，导热通道8，温 度传感器9，橡胶活塞10；作为激发光单元的LED发光二极管4，激发光滤光 片5，作为荧光光谱检测装置的硅光电池6，检测光滤光片7；还包括有用于控 制陶瓷制冷片1制冷，电热膜2加热的外接微处理器、对于控制参数进行输入 和输出的键盘及显示屏。

一种面向空间的微体积单位的实时荧光PCR工作系统，硬质透明塑料卷3 成筒状，电热膜2在硬质透明塑料卷3的外层，在硬质透明塑料卷3的上下两 端部的内侧开孔嵌入激发光滤光片5，激发光滤光片5上覆盖有LED发光二极 管4，LED发光二极管4位于硬质透明塑料卷3的外侧，电热膜2在上述的开 孔位置不开孔；硬质透明塑料卷3前后端部内侧开孔嵌入检测光滤光片7，检 测光滤光片7上覆盖有硅光电池6，硅光电池6位于硬质透明塑料卷3的外侧。 电热膜2的两端外侧留有导热通道8。陶瓷制冷片1拼接成横向截面为正方形 的长方体，上述的硬质透明塑料卷3置于所述的长方体中的内部空间相切，并 在陶瓷制冷片1和硬质透明塑料卷3之间充满导热银胶。上述透明塑料卷3两 端用活塞10封装，并在其中一侧的活塞10上嵌入温度传感器9。

电热膜2与硬质透明塑料卷3之间使用硅胶粘连。

拼接成长方体的陶瓷制冷片1的片数为4块。

所述的活塞10为橡胶活塞。

发光二极管4所发光的峰值波长为475nm；激发光滤光片5透射的峰值 波长也为475nm。

检测光滤光片7透射波长为525nm的荧光。

所述的陶瓷制冷片大小为5mm×5mm，厚度为1mm。

所述的硅光电池和温度传感器的尺寸为长×宽为：1mm×1mm。

本发明为微体积单位的实时荧光PCR工作系统的一个非电工作单元，集 成了所有非电要素，但工作时需外接微处理器、键盘及显示屏等，其工作过程 为，陶瓷制冷片1和硬质透明塑料卷3通过外接的微处理器控制和温度传感器 9的反馈，加热至94℃使PCR反应液中的遗传物质高温变性，后降温至55 ℃低温退伙复性，最后升温至72℃使之适温延伸，循环此3个温度(30～ 40个周期)。同时从LED发光二极管4发出的光在滤光片5处被滤光，选出的 475nm激发光照射待检测对象PCR反应液。待检测物质由激发光激发出荧光， 通过检测光滤光片7后，滤出波长525nm的荧光被硅光电池6所接收，变成 电信号输出。

本发明的微体积单位的实时荧光PCR工作系统与现有技术相比，具有以 下明显的优势和有益效果：

本发明集成了实时荧光PCR工作的全部非电要素，温度循环系统、反应 系统和检测系统，其中加热与制冷装置可达到5mm×5mm大小，制冷片厚度 可达1mm，LED发光二极管、硅光电池和温度传感器可达到1mm×1mm，使 得整套工作系统缩小到5mm×5mm大小，符合结构微缩、功能集成、重量轻 体积小全自动化检测的目标。光激发和荧光检测可与待检测物零距离接触，不 受重力要求，使得检测结果稳定，不受干扰，更适应空间工作要求。

本发明站在实时荧光PCR工作集成方面，如果面向空间，需要在进样方 向精确到自动进样，才能构成使用的完整性。本发明的手动进样可在空间由宇 航员完成。

附图说明

图1微体积单位的实时荧光PCR工作系统沿前后方向的径向截面图

图2微体积单位的实时荧光PCR工作系统沿左右方向的径向截面图

图3微体积单位的实时荧光PCR工作系统整体示意图

图中：1陶瓷制冷片、2电热膜、3硬质透明塑料、4LED发光二极管、5 激发光滤光片、6硅光电池、7检测光滤光片、8导热通道、9温度传感器、10 活塞。

具体实施例

下面结合附图1～3详细说明本实施例。

本实施例的结构示意图如图1、2和3。图1为其沿前后方向的径向截面图， 图中只能画出陶瓷制冷片1、电热膜2、硬质透明塑料3、作为激发光单元的 LED发光二极管4，激发光滤光片5、导热通道8和温度传感器9和橡胶活塞 10，检测单元只能画出一侧滤光片7。所述陶瓷制冷片1每片为5mm×5mm 大小，1mm厚度，拼接成7mm×5mm×5mm大小的长方体。LED发光二极管 4和激发光滤光片5组成光激发单元，其中作为激发光源的LED发光二极管4 所发光的峰值波长为475nm；激发光滤光片5透射的峰值波长也为475nm； 硅光电池6、检测光滤光片7组成光检测单元，检测光滤光片7可透射被测物 质所产生波长为525nm的荧光，硅光电池6将检测光滤光片7透射的525nm 荧光转化为电信号；导热通道8将陶瓷制冷片1与硬质透明塑料3连接，导热 通道8中间充满导热银胶，可使硬质透明塑料3内反应液更好的进行温度交换； 温度传感器9对PCR反应过程中的温度变化进行反馈至外接的微处理器，再 由微处理器控制制冷片1和电热膜2的工作；10为橡胶活塞，将整个工作系统 封闭。

整个微体积单位的实时荧光PCR工作系统的工作过程是，使用针管将PCR 反应液由活塞处注入，启动工作系统，由键盘输入温度循环的三个温区时间， 微处理器根据温度传感器9的反馈控制制冷片1和加热膜2工作，进行PCR 反应。同时从LED发光二极管4发出的光在滤光片5处被滤光，选出的475nm 激发光照射待检测对象PCR反应液。待检测物质由激发光激发出荧光，通过 检测光滤光片7后，滤出波长525nm的荧光被硅光电池6所接收，变成电信 号输出。图2为该检测系统沿左右方向的径向截面图，图中只能由陶瓷制冷片、 加热膜2、硬质透明塑料3、LED发光二极管4、激发光滤光片5和硅光电池6、 检测光滤光片7以及温度传感器9和一侧活塞10，传热通道8未能画出。由激 发光滤光片5和硅光电池6组成光激发单元，由检测光滤光片7和温度传感器 9组成光检测单元；使用两组光激发单元和两组光检测单元的目的是可以进一 步提高检测灵敏度。本发明的微体积实时荧光PCR工作系统具有以下特点： 集成了实时荧光PCR工作系统的全部要素，如温度循环及控制、激发光源、 分光系统、光检测等。由于使用的器件都是毫米级的，使得整个系统的特征尺 寸缩小到只有5mm×5mm×7mm毫米。

微体积实时荧光PCR工作系统制作工艺流程如下：首先将硬质透明塑料 卷3成筒状，再将电热膜2用硅胶粘连在其外层，在加热膜上下两侧嵌入LED 发光二极管4和激发光滤光片5，前后嵌入硅光电池6和检测光滤光片7，两 侧留有导热通道8。再次，将陶瓷制冷片1四块拼接成长方体，将上步制成的 圆筒内置其中，并在未接触空间充满导热银胶。最后两头用活塞10封装，并 在底层活塞上嵌入温度传感器9。