产纤维素酶菌株、纤维素酶及其生产发酵培养的方法

摘要

本发明公开了一株产生纤维素酶的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株和利用此菌株生产纤维素酶的生产方法。经过培养基优化筛选及发酵工艺条件优化控制，确立了稳定的发酵方法，生产的纤维素酶制剂具有良好的酶活性。可广泛用于烤烟醇化、食品加工、饲料加工等行业，并具有重要意义。

说明书

发明领域

本发明涉及微生物及微生物发酵领域。具体地说，本发明涉及一种生产纤维素酶的芽孢杆菌属菌株，纤维素酶以及生产方法。芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株的保藏号为：CGMCC No.5311，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2011年9月29日。 

背景技术

纤维素是细胞壁的主要成分，是由葡萄糖通过β-(1，4)糖苷键连接而成的线状大分子聚合物。 

纤维素酶是一种在分解纤维素时起生物催化作用的酶。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。 

纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为葡聚糖内切酶(1，4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4)，葡聚糖外切酶(1，4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1，4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91)和β-葡聚糖苷酶(β-1，4-glucosidase，EC.3.2.1.21)。内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。 

纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。 

影响产酶量和活力的因素：影响纤维素酶产量和活力的因素很多，除菌种外，还有培养温度、pH、水分、基质、培养时间等。这些因素不是孤立的，而是相互联系的。 

目前，国内外产纤维素酶菌株容易退化、且发酵要求条件苛刻，生产成本高，不能大规模应用到工业生产。 

发明内容

本发明目的在于克服上述现有技术缺点，提供一种产生纤维素酶的芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株和利用此菌株生产纤维素酶的生产方法。经过培养基优化筛选及发酵工艺条件优化控制，确立了稳定的发酵方法，生产的纤维素酶制剂具有良好的酶活性。 

本发明目的是这样完成的：一种芽孢杆菌(Bacillus sp)，其保藏号为：CGMCCNo.5311，该菌株具有高产纤维素酶的能力。 

可有效地获得的纤维素酶。 

利用权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp)菌种生产纤维素酶的发酵培养方法， 其特征在于将该菌种接种于LB培养基或其他适合其的培养基中，在温度为10～35℃培养12小时； 

将分离纯化待测菌株转接到Mastplate平板上的单菌落，再接种到纤维素酶菌株筛选培养基平板上，置于37℃恒温培养箱10h； 

待菌落直径大小约3～6mm时，用0.2％的刚果红溶液染色2h，然后用5％NaCl溶液脱色1h，然后测量水解圈和菌株直径的大小，计算水解圈和菌株直径的比值，利用进活化筛选出的实验菌株进行发酵培养实验，获得本发明的纤维素酶制剂； 

所述LB培养基成分如下：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g。 

在发酵培养过程中，可将菌种直接接种于种子培养基中，然后以1～10％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养。 

选择培养温度为10℃～40℃，培养时间为30～75小时，培养的PH值可在4.5～9.5的生产范围。 

以下的条件培养温度最好为15～40℃，PH值在5～8范围内更适合于本发明的纤维素酶的生产，生产纤维素酶制剂，经上述， 

优选羧甲基纤维素钠作为碳源，用量为0.3～1.8％；优选蛋白胨、酵母膏作为最佳的氮源，用量在0.1～1.5％。 

由下述方法获得纤维素酶制剂：利用过滤法或离心法从培养液中分离菌体和培养基物质，得到上清液或滤液，然后对滤液超滤浓缩等方法最后制得纤维素酶制剂。 

本发明产纤维素酶的菌株可广泛用于烤烟醇化、食品加工、饲料加工等行业，并具有重要意义。 

附图说明

下面结合附图，进一步说明本发明内容，但并不以此来限定本发明。 

图1：菌株48-1系统发育分析。 

图2：不同碳源对菌株48-1产纤维素酶活的影响。 

图3：不同氮源对菌株48-1产纤维素酶活的影响。 

具体实施方式

本发明是通过在玉溪烤烟表面分离，纯化和筛选，获得一批产纤维素酶的微生物菌株，从中选出一株编号为48-1的菌株，具有高产纤维素酶的优良性状。经16S rDNA鉴定和生理生化鉴定，属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的菌株，其保藏号为：CGMCC No.5311。 

本发明在获得芽孢杆菌属(Bacillus sp.)48-1菌株的基础上，提供了该菌株纤维素酶的生产方法，通过利用本发明的菌株经过本发明确定的具体发酵方法而获得。 

本发明的产纤维素酶菌株48-1可采用如下方法对其进行筛选以及摇瓶发酵以获得本发明 的纤维素酶制剂。 

将本发明菌种接种于LB培养基或其他适合其的培养基中，10～35℃培养12小时。其LB培养基成分如下：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g。将分离纯化待测菌株转接到Mastplate平板上的单菌落，再接种到纤维素酶菌株筛选培养基平板上，置于37℃恒温培养箱10h。待菌落直径大小约3～6mm时，用0.2％的刚果红溶液染色2h，然后用5％NaCl溶液脱色1h，然后测量水解圈和菌株直径的大小，计算水解圈和菌株直径的比值。一般说来，比值的大小与菌株降解纤维素能力大小有关。水解圈和菌株直径的比值越大，该菌株降解纤维素的能力越强，分泌纤维素酶的能力也越强，因此计算比值是进一步筛选菌株的较好依据。纤维素刚果红平板透明圈筛选法用于纤维素分解菌酶活力大小的定性试验，透明圈的大小直接反映了酶浓度的高低。此法决速方便，适合于大量菌株筛选。 

利用进活化筛选出的本发明的实验菌株进行发酵培养实验，获得本发明的纤维素酶制剂。 

在发酵培养过程中，可将菌种直接接种于种子培养基中，然后以1～10％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养。 

作为培养基的营养源，可广泛使用通常用于培养的营养源。只要是可作为碳源同化的碳化合物或者含有该碳化合物的，微生物菌种可以利用的，适合于发酵培养产生纤维素酶的碳源即可，例如，可使用葡萄糖、麦芽汁、蔗糖、可用的多糖等。本发明中优选羧甲基纤维素钠作为碳源，用量为0.3～1.8％。 

作为氮源，只要是可作为氮源同化的氮化合物或者是含有该氮化合物的即可，例如，可用铵盐、硝酸盐、大豆粉、酵母膏等，其氮源的选择和用量，可依据其他营养源的成分和用量的不同而不同，只要适合本发明的纤维素酶产生菌的培养及酶的生产即可。在本发明中，优选蛋白胨、酵母膏作为最佳的氮源，用量在0.1～1.5％。 

对于无机盐类，可适当添加磷酸氢氨，磷酸二氢钾等磷酸盐、镁盐、钙盐、锰盐等盐类，培养条件依据培养基的成分不同而有变化，只要适宜菌体产生本发明的纤维素酶即可。 

通常，可选择以下的条件培养，培养温度为10℃～40℃，最好为15～40℃，培养时间为30～75小时，只要在本发明的纤维素酶产量达到最高时结束发酵培养即可。培养的pH值可在4.5～9.5的生产范围，特别是在5～8范围内更适合于本发明的纤维素酶的生产。经如上述的发酵培养方法，生产本发明的纤维素酶制剂。 

从如上所得的培养液中提取纤维素酶，可按照通常用于采集细胞外酶的方法，如硫酸铵盐析、超滤浓缩、冷冻干燥、色谱分离等，分离精制而成。本发明可由下述方法获得纤维素酶制剂：利用过滤法或离心法从培养液中分离菌体和培养基物质，得到上清液或滤液，然后对滤液超滤浓缩等方法最后制得纤维素酶制剂。 

本发明的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株可有效地生产本发明的纤维素酶。实施例1： 

产纤维素酶菌株48-1菌株生理生化特征 

从玉溪烤烟表面分离，纯化和筛选，获得一株编号为48-1高产纤维素酶的细菌菌株。该菌株已在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(中国北京)保藏，保藏号为：CGMCC No.5311。 

菌株48-1的菌落呈菌落圆形、白色，凸起，菌落大小5.0-6.0mm，有光泽，菌落不透明，质地有粘性。该菌株可在10～35℃，pH范围是4.5～9.5范围内均可生长。细菌的16S rDNA序列经提交NCBI数据库，在GenBank中进行同源序列比对搜索(BLAST)，并下载相关类群微生物模式菌株的16S rDNA序列。利用ClustalX软件对16S rDNA序列与模式菌株的16SrDNA序列进行比对，然后用MEGA4.0软件根据Neighbor-Joinin法构建了系统进化树，并进行1000次Bootstrap统计学检验，其系统进化树见图1。 

本发明的高产纤维素酶菌株48-1的生理生化特征如表1所示。其生理生化特征使用杭州天和微生物试剂有限公司的细菌微量生化反应管分析细菌的尿素、半乳糖、硫化氢还原、阿拉伯糖、明胶、硝酸盐还原、葡萄糖、木糖、纤维二糖和甘露醇的生理生化特征。 

结合生理生化特征，将48-1菌株鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的菌株。 

实施例2： 

产纤维素酶菌株48-1的筛选及发酵条件 

将分离到的菌株接种于含有1％的羧甲基纤维素钠(CMC)的LB培养基上，其成分为：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，0～35℃培养12小时，待菌落直径大小约3～6mm时，用0.2％的刚果红溶液染色2h，然后用5％NaCl溶液脱色1h，然后测量水解圈和菌株直径的大小，计算水解圈和菌株直径的比值。一般说来，比值的大小与菌株降解纤维素能力大小有关。水解圈和菌株直径的比值越大，该菌株降解纤维素的能力越强，分泌纤维素酶的能力也越强， 

产纤维素酶菌株的复筛采用酶活的测定方法进行，酶活力的测定参考Miller G.L的DNS法，这种方法可以确知待筛选菌株产纤维素酶活力单位。酶活力单位的定义：在pH 7.0、37℃下，单位时间内催化纤维素生成1μg葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位。将初筛有降解纤维素活力的菌落用接种针转接到液体LB培养基和液体(CMC+LB)培养基中，置37℃、150rpm条件下培养10h，然后按1％的接种量将培养液接入新鲜的液体LB培养基中，37℃、150rpm条件下培养60h。采用DNS法检测菌株醇化液中的纤维素酶活力，并区别在液体LB培养基和液体(CMC+LB)培养基中同一菌株降解纤维素能力有无差别。结果表明菌株48-1产纤维素酶的活力最高。 

实施例3： 

高产纤维素酶菌株48-1产酶条件优化 

碳源对产酶的影响： 

基础培养基A：酵母粉0.2g/L，氯化钾0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硝酸钠1g/L，硫 酸镁0.4g/L，硫酸亚铁0.01g/L。分别加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、甘油、果糖和CMC-Na(终浓度1g/L)，pH 7.0。用接种针从48-1菌株斜面挑起少许菌苔分别接入液体LB培养基中，37℃振荡培养2～3d。再按1％的接种量接入基础培养基A中，37℃振荡培养2d。采用DNS法检测各发酵液中的纤维素酶活力。结果表明：在各种碳源中，葡萄糖酶活最高，麦芽糖次之，蔗糖、淀粉和甘油产酶量相对较低(图2)。 

氮源对产酶的影响： 

基础培养基B：葡萄糖1g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.4g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L。分别加入硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨、酵母粉、尿素、柠檬酸铵、氯化铵(终浓度1g/L)，pH 7.0。用接种针将48-1接入液体LB培养基中，37℃振荡培养2～3d。按1％的接种量接入基础培养基B中，37℃振荡培养2d。采用DNS法检测各发酵液中的纤维素酶活力。结果表明：在参试的7种氮源中，无机氮源效果优于有机氮源，而无机氮源中以硫酸铵效果最佳(图3)。 

经碳源、氮源、pH、温度、时间优化，表明48-1菌株的优化产酶条件为：培养基组成：酵母粉0.2g/L，葡萄糖1g/L，硫酸铵2g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.4g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，pH 9.0。培养温度：25℃。培养时间：48h。在优化条件下48-1菌株的酶活力比优化前提高了4.7倍。在优化过程中，发现高浓度的碳源(大于0.1％)不利于48-1菌株产酶，这可能与纤维素酶受葡萄糖反馈抑制和菌株长期生长于碳源营养相对贫乏的环境，形成独特的生长代谢类型有关。 

表1：菌株48-1的生理生化特征 

表1 

注：+表示阳性反应  -表示阴性反应。