磺胺二甲基嘧啶亲和膜及其在抗体分离纯化中的应用

摘要

本发明公开了一种磺胺二甲基嘧啶亲和膜，所述的磺胺二甲基嘧啶的制备方法包括如下步骤：(1)取醋酸纤维素膜，先在碱性条件下充分水解，然后加入环氧氯丙烷进行环氧活化，反应结束后在抽滤条件下用去离子水洗至中性，得到环氧活化后的膜；(2)将磺胺二甲基嘧啶溶解于pH 10～12的碱性缓冲溶液中，然后将步骤(1)获得的环氧活化后的膜分散在上述溶液中，在50～65℃反应24h～36h，在抽滤条件下用去离子水洗至滤出液在280nm处的紫外吸收接近于0，干燥后即得磺胺二甲基嘧啶亲和膜。所述的磺胺二甲基嘧啶亲和膜对于抗体具有较好的吸附性能，尤其适于分离纯化免疫球蛋白IgG。

说明书

一、技术领域

本发明涉及生物医学材料领域，特别是涉及磺胺二甲基嘧啶亲和膜的制备及其在抗体分离纯化中的应用。

二、背景技术

抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类蛋白。它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应(生理效应)的球蛋白。作为一种特殊的蛋白质分子，抗体常被作为体外诊断的试剂、治疗疾病的药物、免疫亲和层析的配基等，在生命科学研究、生物技术及医学领域中有着广泛的应用。尤其是抗体作为各种免疫分析的核心试剂，对免疫分析结果的灵敏度、特异性起着至关重要的作用。在对一些与生命体功能关系密切的新基因产物的研究中，是否拥有相应的抗体以检测与鉴定新基因的产物蛋白质，是整个研究工作能否深入开展的关键。

目前常用的分离纯化抗体的方法有盐析法、正辛酸-饱和硫酸铵法、亲和层析法、凝胶过滤层析法、疏水层析法、以及离子交换层析法等，但前两种种方法只能得到纯度不是很高的抗体；亲和层析虽然选择性较好，但存在着装柱、预处理等耗时步骤，且处理量较小；凝胶过滤层析、疏水层析、以及离子交换层析同样也存在在处理量小，时间长，装柱等问题。

80年代中期以来，出现了亲和膜分离技术。它将两种技术有机地结合起来，发挥各自的优点，弥补不足，不仅利用了生物分子的识别功能，可以高选择地分离低浓度的生物产品，而且利用膜的渗透通量大的特点，能在较低的操作压和较高的流速下对目标蛋白进行快速的分离和纯化；操作方便、设备简单。目前利用亲和膜已能纯化和制取白蛋白、单克隆抗体、干扰素、纤维蛋白、胰蛋白酶及其抑制剂等医药制品，并在医学检验、体外循环治疗技术等领域显示出广阔的应用前景，受到日益广泛的关注。亲和膜分离技术把亲和色谱与膜分离技术结合起来，利用生物分子的识别功能分离低浓度的生物产品，并以对流传质方式实现快速分离，具有易于放大、分离速度快的特点，又具备亲和层析选择性好、分离精度高的优势，是备受关注的生物产品纯化分离技术。

三、发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种磺胺二甲基嘧啶亲和膜，所述的磺胺二甲基嘧啶亲和膜对抗体(尤其是免疫球蛋白IgG)有特异性吸附作用，所得抗体具有较高的纯度和活性，适用于大规模分离纯化抗体。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种磺胺二甲基嘧啶亲和膜，所述的磺胺二甲基嘧啶的制备方法包括如下步骤：

(1)取醋酸纤维素膜，先在碱性条件下充分水解，然后加入环氧氯丙烷进行环氧活化，反应结束后在抽滤条件下用去离子水洗至中性，得到环氧活化后的膜；

(2)将磺胺二甲基嘧啶溶解于pH 10～12的碱性缓冲溶液中，然后将步骤(1)获得的环氧活化后的膜分散在上述溶液中，在50～65℃反应24h～36h，在抽滤条件下用去离子水洗至滤出液在280nm处的紫外吸收接近于0，干燥后即得磺胺二甲基嘧啶亲和膜。

本发明选用醋酸纤维素的膜为基膜，这是因为醋酸纤维素膜非特异性吸附比较低，活化方法较简便，故其相对于硝酸纤维素膜和混合纤维素膜等更适合作为本发明的基膜。本发明所述的醋酸纤维膜使用市售商品。

本发明在制备亲和膜过程中，需先对醋酸纤维膜进行水解处理，以提高膜上配基的修饰密度。本发明推荐所述醋酸纤维素膜的水解在1.5～2mol/LNaOH溶液中进行，水解温度为60～80℃，水解时间为1.5～2.5h。

本发明中，为提高环氧活化效果，优选环氧活化温度为40～60℃，优选环氧活化时间为4～6h。

本发明优选所述环氧氯丙烷的加入体积为水解后反应体系体积的15％～20％。

本发明中，所述磺胺二甲基嘧啶的加入质量优选为环氧活化后的膜质量的10％～20％。

本发明中，所述的pH 10～12的碱性缓冲溶液优选为pH 10～12的PBS缓冲溶液或碳酸盐缓冲液。

本发明以醋酸纤维膜作为基膜，通过对反应步骤的设计和反应条件的控制，获得了具有较好配基修饰密度的磺胺二甲基嘧啶亲和膜。

本发明要解决的第二个技术问题是将所述的磺胺二甲基嘧啶亲和膜应用于抗体分离纯化中的应用，以获得具有较高纯度和活性的抗体。

具体的，所述的抗体分离纯化的装置示意图如图1所示，所述的分离纯化可按照如下步骤进行：取磺胺二甲基嘧啶亲和膜装入膜杯中，将用缓冲溶液稀释后的腹水用蠕动泵装入膜杯中让其与亲和膜上的配基充分吸附后，用蠕动泵泵入去离子水直至滤出液在280nm处的紫外吸收接近为0，然后再用蠕动泵泵入洗脱缓冲液，收集洗脱出来的物质，得到的洗脱液即为从腹水中分离纯化后的抗体，用SDS-PAGE检测其纯度。

进一步，由于所述的磺胺二甲基嘧啶亲和膜的固有性质，本发明所述的分离纯化优选在酸性条件下进行，优选在pH5.5～7.5的条件下进行，更优选在pH5.5～6.0的条件下进行。在分离纯化过程中，利用缓冲液控制体系的pH值，例如PBS缓冲液。

进一步，所述的洗脱缓冲液中含有NaCl，其中NaCl的浓度为1.0～3.0mol/L，采用高浓度的盐洗脱避免了酸洗脱对抗体活性的影响。优选洗脱缓冲液为含有1.5～2.0mol/L NaCl的pH5.5～6.0的PBS缓冲液。

本发明所述的磺胺二甲基嘧啶亲和膜对于抗体具有较好的吸附性能，尤其适于分离纯化免疫球蛋白IgG。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明以醋酸纤维素膜为基膜经环氧活化并偶联上磺胺二甲基嘧啶配基制得磺胺二甲基嘧啶亲和膜，该方法简便易行，而且制得的磺胺二甲基嘧啶亲和膜具有良好的配基修饰密度；

(2)本发明的磺胺二甲基嘧啶亲和膜，用于分离纯化抗体具有较高的选择性，所得抗体具有较高的纯度和活性；而且本发明的分离纯化方法简单易行，操作条件温和，不需要装柱处理，待吸附平衡后采用膜分离的方式除去没有被结合的杂蛋白，即可得到纯度大于90％的抗体。

四、附图说明

图1为实施例1所得该分离方法的装置图；其中，1：磁力搅拌器，2：微滤装置，3：平衡缓冲液，4：腹水溶液，5：洗脱缓冲液，6：蠕动泵，7：压力表，8：部分收集器，9：紫外检测器；

图2为实施例1所得亲和膜的吸附等温线；

图3为实施例2所得吸附效果图，其中1＝蛋白marker；2＝标准IgG；3＝腹水；4＝从腹水中纯化后抗体。

五、具体实施方式

下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1：磺胺二甲基嘧啶亲和膜的制备

(1)将10片醋酸纤维素膜(杭州科诺，Φ＝10cm)分散在100mL浓度为2mol/L的NaOH溶液中，于70℃在水浴振动摇床中(175rpm)水解1.5h。降温至40℃后，加入体积分数为20％的环氧氯丙烷溶液，于40℃反应4h，反应结束后在抽滤条件下用去离子水洗至中性，即得环氧活化后的膜。

(2)将1.0g磺胺二甲基嘧啶溶解于pH10.5，20mmol/L的PBS缓冲溶液中，将步骤(1)所得环氧活化后的膜10片(约5g)分散于该缓冲溶液中，于55℃反应水浴震荡(175rpm)36h。然后在抽滤条件下用去离子水洗至滤出液在280nm处的紫外吸收接近于0，干燥后即得磺胺二甲基嘧啶亲和膜，其修饰密度参数如下表所示：

  亲和膜  环氧基团  磺胺二甲基嘧啶  修饰密度(umol/cm²)  1.01  0.73

将亲和膜剪碎后分别称取100mg(相当于1/4片膜)分散至5mL 6个不同抗体IgG含量(0.0615、0.123、0.1845、0.246、0.3075、0.369mg/mL)的溶液中，室温振荡吸附至平衡，测定平衡时溶液中抗体的浓度，以平衡浓度和吸附容量作图得到该亲和膜吸附等温线，如图2所示。

实施例2：磺胺二甲基嘧啶亲和膜在抗体分离纯化中的应用

取实施例1制得的磺胺二甲基嘧啶亲和膜10～15片，将其装入膜杯中(如图1)，将10ml腹水用pH 5.5、20mmol/L的PBS缓冲溶液稀释至100mL，然后再用蠕动泵以2ml/min的流速泵入膜杯中让其与膜上的配基充分吸附后，用相同流速泵入去离子水直至滤出液在280nm处的紫外吸收接近为0。然后以相同流速泵入洗脱缓冲液(PH5.5 20mmol/L的PBS+1.5mol/L NaCl)。收集洗脱出来的物质，用超滤离心管3000rpm离心15min后，将其分装于1.5mL的管中，冷冻保藏。

用SDS-PAGE检测抗体纯度，结果如图3所示，1表示蛋白marker，2表示标准抗体，3表示腹水，4表示纯化后抗体。条带4表示的是用该方法分离纯化的抗体，从而可以看出腹水得到了很好的纯化。

间接elisa法测抗体的效价均在10^-7以上，生物活性良好。