脱氢酶或对应的底物的测定方法及测定用试剂盒

摘要

测定样品中含的脱氢酶或对应的底物的方法，通过作为辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP以及NAD或NADP的二者，可进行基于可视部的吸光度的测定，并且，可正确地测定以高浓度存在于样品中的脱氢酶或对应的底物。

说明书

【技术领域】

本发明涉及测定样品中的脱氢酶或对应的底物的方法及其中使用 的试剂盒。

【背景技术】

在血清、血浆等的样品中，存在高浓度的脱氢酶或对应的底物。 在临床化学诊断中，为了测定它们，作为辅酶而一般使用烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。作为 这样的方法中使用的脱氢酶和底物的组合，已知乳酸脱氢酶和乳酸、 谷氨酸脱氢酶和谷氨酸、醇脱氢酶和醇、甘油-3-磷酸脱氢酶和甘油-3- 磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸等。此时，为了测定该组 合之任何一方，将其他一方与辅酶一同作为试剂使用。另外，与其同 样地，为了测定样品中的尿素等的特定物质，通过使特定物质与试剂 进行酶反应而作为中间体或最终产物生成特定的脱氢酶或对应的底 物，使该脱氢酶或对应的底物与上述辅酶一同反应，结果测定特定物 质也广泛进行。

在这些的测定方法中，最终一般采用将NAD或NADP通过脱氢 酶反应变换为作为还原型的NADH或NADPH，而基于其结果发生的 紫外线波长域(通常、340nm)中的吸光度的升高来测定脱氢酶或对 应的底物的方法。但是，此时，为了在紫外线区域测定，有作为测定 池不使用简便的玻璃或塑料而使用高价的石英的必要，而且有作为分 析装置而使用紫外线光源或检测装置的必要，因此，有分析装置易变 得大型且高价的倾向。其结果，不可在干燥化学领域或小的医院也可 测定的使用可视分光光度计的装置中适用。从而，为了可在那样的场 合中使用，期望在可视部测定上述的脱氢酶或对应的底物的方法。

另一方面，在专利文献1中提案，使葡萄糖-6-磷酸与葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶反应之时，作为辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP和 NADH或NADPH的组合，进行酶循环反应，将生成的作为还原型酶 的硫代NADH或硫代NADPH基于在400nm附近的可视部的吸光度 而测定葡萄糖-6-磷酸的方法。但是，此方法使用酶循环反应，不好说 必定是简便的测定方法，另外不好说是在测定高浓度的测定对象物中 适宜的测定方法。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：特开平4-335898号公报

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明的课题在于提供，使基于在可视部的吸光度的测定成为可 能，可在干燥化学领域或小的医院也可测定的使用可视分光光度计的 装置中适用，并且，正确地测定以高浓度存在于样品中的脱氢酶或对 应的底物的方法。

【解决课题的技术方案】

本发明人着眼于为了如例如专利文献1所述，通过酶循环法测定 低浓度的脱氢酶或对应的底物而使用的辅酶硫代NAD或硫代NADP 通过酶反应而使可视部的吸光度变化，对于使用该辅酶，测定在样品 中以高浓度存在的测定对象的方法进行检查。其结果，将高浓度的测 定对象作为辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP时，难以在高浓度区 域维持直线性，而且空白也有升高的时候，判明不可正确地测定测定 对象。

本发明人尝试了，为了将样品中的某种物质用某酶除去，通过作 为辅酶而使用NAD来进行酶反应，接下来，使用除去该物质的样品 而使脱氢酶、对应的底物及硫代NAD反应来测定可视部区域的吸光 度，从而测定样品中的脱氢酶或其对应的底物。然而，通过无关于NAD 和硫代NAD的添加的顺序，以使样品与脱氢酶、对应的底物、硫代 NAD及NAD共存的单纯的构成测定可视部区域的吸光度，令人惊讶 地发现，反应空白减少，标准曲线的斜率变小，可正确地测定样品中 的脱氢酶或其对应的底物。其结果判明，通过这样的构成，解决了上 述的问题，在高浓度区域也可正确地测定脱氢酶或对应的底物。

从而，在以可视部的吸光度测定样品中含的脱氢酶或对应的底物 的方法中，通过作为辅酶而，使用硫代NAD或硫代NADP以及NAD 或NADP的二者，从而测定对象在高浓度区域也可维持直线性，并且， 可使标准曲线的空白变小，其结果，发现可用简便的可视分光光度计 在测定对象浓度的宽广的区域提供简单并且正确地测定脱氢酶或对应 的底物的方法，从而完成本发明。

从而，本发明涉及使用脱氢酶、对应的底物及辅酶进行反应而测 定样品中的该脱氢酶或对应的底物的测定方法，所述方法包括：作为 辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP及NAD或NADP进行反应，以 及测定源于生成的硫代NADH或硫代NADPH的吸光度的增加。

再者，本发明涉及测定样品中的特定物质的测定方法，所述方法 包括：通过使样品中的特定物质经历酶反应来作为中间体或最终产物 生成脱氢酶或对应的底物，使该脱氢酶或对应的底物经历上述的测定 方法，以及基于作为中间体或最终产物生成的脱氢酶或对应的底物的 量来测定样品中的特定物质。

再者，本发明涉及用于测定脱氢酶或对应的底物的测定用试剂盒， 所述试剂盒包含选自脱氢酶和对应的底物的测定对象以外的成分作为 必须成分，并且，包含作为辅酶的硫代NAD或硫代NADP和NAD或 NADP作为必须成分。

再者，本发明涉及用于测定特定物质的测定用试剂盒，所述试剂 盒包含用于从特定物质通过酶反应衍生脱氢酶或对应的底物的成分、 以及衍生该脱氢酶和对应的底物的成分以外的成分作为必须成分，并 且，包含作为辅酶的硫代NAD或硫代NADP和NAD或NADP作为 必须成分。

【发明效果】

根据本发明，即便以可视部的吸光度测定样品中含的脱氢酶或对 应的底物，通过作为辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP以及NAD或 NADP的二者，测定对象在高浓度区域也可维持直线性，并且，可使 标准曲线的空白变小。其结果，可用简便的可视分光光度计在测定对 象浓度的宽广的区域，简单并且正确地测定。

【附图说明】

【图1】是示在实施例1、2及3以及比较例1的方法中测定尿素 氮的结果的图。

【实施方式】

作为本发明中使用的样品而言，优选为血清、血浆、尿等的活体 样品、或者它们的模型样品。

本发明的测定对象是样品中的脱氢酶或对应的底物，另外，是可 通过酶反应作为中间体或最终产物生成脱氢酶或对应的底物的样品中 的特定物质。

在本发明中，在进行脱氢酶反应之时，作为辅酶而使硫代NAD 或硫代NADP及NAD或NADP的二者存在而进行反应。硫代NAD 或硫代NADP和NAD或NADP的组合可为任何，但优选为硫代NAD 和NAD的组合，或者硫代NADP和NADP的组合。

以下，有时候将硫代NAD或硫代NADP简写为硫代NAD(P)。 另外，有时候将NAD或NADP简写为NAD(P)。

在本发明中，硫代NAD是指硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，硫代 NADP是指硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。另外，NAD是指烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸，NADP是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。

在本说明书中，硫代NADH、硫代NADPH、NADH、NADPH 是指，辅酶的还原型，即，各自是指硫代NAD、硫代NADP、NAD、 NADP的还原型。以下，有时将硫代NADH或硫代NADPH简写为硫 代NAD(P)H。另外，有时将NADH或NADPH简写为NAD(P) H。

在本发明中，使用的NAD(P)的量不特别限定，但优选为使用 的硫代NAD(P)的量的0.5倍摩尔数以上，更优选为1.5～30倍摩尔 数，最优选为3.0～20倍摩尔数。NAD(P)的量过少，则难维持标准 曲线的直线性，另外，也有空白降低不充分之时。另一方面，NAD(P) 的量过大，则标准曲线的直线的斜率变小，难正确地测定测定对象。

在本发明中，作为辅酶而使用硫代NAD(P)及NAD(P)的二 者而进行脱氢酶反应，测定源于生成的硫代NAD(P)H的吸光度的 增加。用于测定吸光度的波长优选为395～415nm的范围，因为可在 可视部区域测定，作为使用的分析装置可用简易的可视分光光度计测 定。

在本发明中，作为脱氢酶或对应的底物，例如，现在，只要是作 为在临床检查业界成为测定对象的辅酶而可使用NAD(P)或硫代 NAD(P)来通过脱氢酶反应测定的脱氢酶或对应的底物，就不特别 限定。此时，脱氢酶或对应的底物是在样品中最初开始存在的脱氢酶 或对应的底物也可。另外，是为了测定样品中的特定物质而通过使该 特定物质进行酶反应，而作为中间体或最终产物生成的脱氢酶或对应 的底物也可，此时，依赖于生成的脱氢酶或对应的底物，结果，可测 定特定物质。

作为这样的方法中使用的脱氢酶和底物的组合，可例示例如，乳 酸脱氢酶和乳酸、谷氨酸脱氢酶和谷氨酸、醇脱氢酶和醇、甘油-3-磷 酸脱氢酶和甘油-3-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸等。此 时，为了测定该组合之任何一方，可将其他一方作为用于与辅酶一同 进行脱氢酶反应的试剂而使用。在本发明中，在样品中以高浓度存在 的测定对象是适宜的。

作为脱氢酶或对应的底物，为了测定样品中的特定物质，使用通 过使样品中的特定物质进行酶反应而作为中间体或最终产物生成的脱 氢酶或对应的底物时，可例示例如，脱氢酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶， 而对应的底物是葡萄糖-6-磷酸的情况。此时，例如，作为特定物质， 可测定尿素(再有，尿素在习惯上作为尿素氮求出也可)。此时，例 如，作为第一酶反应，使样品中的尿素与源于试剂的ATP、镁离子、 钾离子、碳酸氢根离子和脲酰胺裂合酶作用而生成ADP，接下来，作 为第二酶反应，使该ADP与源于试剂的己糖激酶作用而生成葡萄糖-6- 磷酸，接下来，使生成的葡萄糖-6-磷酸(对应的底物)与葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶(脱氢酶)和硫代NAD(P)和NAD(P)作用而进行脱 氢酶反应，从而可从依赖于生成的硫代NAD(P)H的量的吸光度的 升高，测定生成的葡萄糖-6-磷酸(对应的底物)，基于此，结果，作 为样品中的特定物质而可测定尿素。此时，作为己糖激酶，优选为ADP 依赖性己糖激酶。

将此例以反应式表示，则如下。

【化1】

在本发明中，在作为测定对象测定脱氢酶或对应的底物之时，例 如，作为第一试剂，包含选自脱氢酶和对应的底物的测定对象以外的 成分作为必须成分，此外，根据需要，可使用含缓冲剂、表面活性剂 等的其他成分的，作为第二试剂，以硫代NAD(P)和NAD(P)作 为必须成分，此外，可使用含缓冲剂、表面活性剂等的其他成分的。

此时，作为具体性的测定对象，测定葡萄糖-6-磷酸之时，例如， 作为第一试剂，作为脱氢酶以葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作为必须成分，作 为第二试剂以硫代NAD(P)和NAD(P)作为必须成分，作为其他， 在第一试剂及第二试剂中可含缓冲剂、表面活性剂等的其他成分。

使用这样的第一试剂和第二试剂，作为测定对象，测定脱氢酶或 对应的底物之时，例如，使样品与第一试剂混合而0～15分钟之后， 接下来，使得到的混合液与第二试剂混合而进行0.5～15分钟酶反应， 用可视分光光度计在405nm测定得到的反应液的吸光度。通过预先制 成的标准曲线和测定值的比较，可测定样品中的测定对象的浓度。另 外，在此时的样品和试剂的混合中，首先，可将第一试剂和第二试剂 混合而作为一个测定试剂，将此测定试剂和样品混合，再者，通过反 应0.5～15分钟也可进行酶反应。

在本发明中，在作为测定对象而测定特定物质之时，例如，在第 一试剂中，作为必须成分含用于从特定物质通过酶反应衍生脱氢酶或 对应的底物的成分、及衍生该脱氢酶和对应的底物的成分以外的成分， 此外，根据需要含缓冲剂、表面活性剂等的其他成分，第二试剂以硫 代NAD(P)和NAD(P)作为必须成分，此外，可含缓冲剂、表面 活性剂等的其他成分。

此时，作为具体性的测定对象的特定物质测定尿素之时，例如， 作为第一试剂，作为从尿素(即特定物质)通过酶反应衍生葡萄糖-6- 磷酸(即对应的底物)的成分，可含用于从尿素生成ADP的第一酶反 应衍生成分(即，脲酰胺裂合酶、ATP、Mg²⁺、K⁺、HCO₃^-)、用于 从ADP生成葡萄糖-6-磷酸(即对应的底物)的第二酶反应衍生成分 (即，葡萄糖、己糖激酶)、作为试剂成分的脱氢酶可含葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶。第二试剂以硫代NAD(P)和NAD(P)的二者作为必须 成分。此外，在第一试剂及第二试剂中，可含缓冲剂、表面活性剂等 的其他成分。

使用这样的第一试剂和第二试剂，作为测定对象，测定特定物质 之时，例如，使样品与第一试剂混合而0～15分钟之后，接下来，使 得到的混合液与第二试剂混合，进行0.5～15分钟酶反应，用可视分 光光度计在405nm测定得到的反应液的吸光度。通过预先制成的标准 曲线和测定值的比较，可测定样品中的测定对象的浓度。另外，在此 时的样品和试剂的混合中，首先，可使第一试剂和第二试剂混合而作 为一个测定试剂，使该测定试剂与样品混合，再者，通过使其反应0.5～ 15分钟也可进行酶反应。

如从以上的说明明了，在本发明中可使用用于测定脱氢酶或对应 的底物的测定用试剂盒，所述试剂盒包含选自脱氢酶和对应的底物的 测定对象以外的成分作为必须成分，并且，包含作为辅酶的硫代NAD 或硫代NADP和NAD或NADP作为必须成分。

此时，例如，为了测定脱氢酶或对应的底物，可使用用于测定脱 氢酶或对应的底物的测定用试剂盒，所述试剂盒包含：含选自脱氢酶 和对应的底物的测定对象以外的成分作为必须成分的第一试剂、及含 硫代NAD或硫代NADP以及NAD或NADP作为必须成分的第二试 剂。

另外，在本发明中，为了测定特定物质，可使用用于测定特定物 质的测定用试剂盒，所述试剂盒包含用于从特定物质通过酶反应衍生 脱氢酶或对应的底物的成分、以及衍生该脱氢酶和对应的底物的成分 以外的成分作为必须成分，并且，包含作为辅酶的硫代NAD或硫代 NADP和NAD或NADP作为必须成分。

此时，例如，可使用用于测定特定物质的测定用试剂盒，所述试 剂盒含有：含用于从特定物质通过酶反应衍生脱氢酶或对应的底物的 成分及衍生该脱氢酶和对应的底物的成分以外的成分作为必须成分的 第一试剂、及含硫代NAD或硫代NADP以及NAD或NADP作为必 须成分的第二试剂。

在这些的测定用试剂盒中的第一试剂及第二试剂中，如上所述， 可根据需要含缓冲剂、表面活性剂等的其他成分。

【实施例】

以下，使用实施例及比较例再详细地说明本发明，但本发明不受 这些例的限制。

【实施例1、2及3以及比较例1：尿素氮的使用可视部测定装置 的测定】

为了测定样品中的作为特定物质的尿素氮，作为第一酶反应，使 样品中的尿素氮与源于试剂的ATP、镁离子、钾离子、碳酸氢根离子 和脲酰胺裂合酶作用而生成ADP，接下来，作为第二酶反应，使该 ADP与源于试剂的己糖激酶作用而生成葡萄糖-6-磷酸，接下来，使生 成的葡萄糖-6-磷酸(对应的底物)与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(脱氢酶) 和硫代NAD和NAD作用，从依赖于生成的硫代NADH的量的吸光 度的升高，测定生成的葡萄糖-6-磷酸(对应的底物)，从而测定样品 中的作为特定物质的尿素氮。另外，作为比较对照，单独使用硫代NAD 进行同样的测定。

【1.方法】

在使用脲酰胺裂合酶、己糖激酶、及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的尿素 氮测定系统中，比较了作为辅酶而混合硫代NAD和NAD的测定系统 (实施例1、2及3)、及单独使用硫代NAD的测定系统(比较例1)。 此时，尿素作为尿素氮量定量。样品及试剂如下。

【样品】

作为尿素氮制备达75mg/dL的尿素溶液，用生理盐水适宜稀释至 各浓度。

【第一试剂】

调节成分至第一试剂达到如下浓度。

  20mM   Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)，pH9.0   10mM   D-葡萄糖   10mM   醋酸镁·四水和物   10mM   碳酸氢钾   10mM   ATP.2Na(腺苷三磷酸·二钠)   1％   表面活性剂   6KU/L   己糖激酶   2KU/L   脲酰胺裂合酶   2KU/L   葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

【第二试剂】

进行成分调节至第二试剂的Tris、表面活性剂达到如下浓度。

 200mM   Tris，pH7.2  xmM   硫代NAD  ymM   NAD  1％   表面活性剂

第二试剂的硫代NAD和NAD的添加量示于表1。另外，比较例 1中是从上述的第二试剂组成除NAD而单独使用硫代NAD。

【表1】

 比较例1  实施例1  实施例2  实施例3   硫代NAD∶NAD的混合比  1∶0  1∶1  1∶4  1∶9   xmM(硫代NAD)  4  2  0.8  0.4   ymM(NAD)  0  2  3.2  3.6

【测定方法】

如下进行测定。使用可视部测定装置，将样品3.0μL和第一试剂 100μL于37℃混合5分钟之后，加第二试剂100μL而在同温度反应5 分钟。用所述机种的1端点法在主波长405nm、副波长505nm测定发 色反应后的吸光度。

【2.结果】

得到的结果示于图1。从图1的结果判明，除了硫代NAD之外添 加NAD时，测定空白低，斜率也变小。在硫代NAD和NAD的混合 中使用的组成是，在实施例1中是至50mg/dL，在实施例2、3中是 至75mg/dL测定可能。

另一方面，作为比较例1而单独使用硫代NAD的组成中，直线 性在尿素氮25mg/dL以上，则由于超过可测定的吸光度，从而不可测 定。

【工业实用性】

在本发明中，通过酶反应测定样品中含的脱氢酶或对应的底物之 时，通过作为辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP以及NAD或NADP 的二者，变得可通过可视部的吸光度而测定，即便测定对象在高浓度 区域也可维持直线性，并且，可使标准曲线的空白变小。其结果，可 用简便的可视分光光度计在测定对象浓度的宽广的区域，简单并且正 确地测定。