隆萼当归线型呋喃香豆素化合物及其应用

摘要

本发明涉及一类新的化合物，尤其是具有抗肿瘤活性的线型呋喃香豆素类化合物，以及它们在制药中的应用。本发明所述的隆萼当归线型呋喃香豆素化合物是具有以下结构通式的化合物：

说明书

技术领域

本发明涉及一类新的化合物，尤其是具有抗肿瘤活性的线型呋喃香豆素类化合物，以及它们在制药中的应用。

背景技术

伞形科(Umbelliferae)植物全世界约有275属2850余种，近于全球分布，以北温带最丰富，我国分布约有 96个属 525种，云南约有51个属259种21变种。云南伞形科药用植物的研究主要始于20世纪70年代，研究结果表明，云南伞形科药用植物的化学成分主要为香豆素，其主要的结构类型有4类: 简单香豆素型，线型呋喃香豆素型，角型呋喃香豆素型，角型二氢吡喃香豆素型。现代药理学研究表明伞形科香豆素具有广泛的生理和药理活性，一直是国内外研究的热点，其中抗肿瘤活性是伞形科香豆素主要的药理活性之一，且相对于已应用于临床的其他天然抗癌药物而言，香豆素化合物合成及结构修饰相对简单且成熟，具有潜在的药用价值。现有技术中未有本发明涉及的两个新线型呋喃香豆素化合物的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供从云南隆萼当归（Angelicaoncosepala）植物中分离得到的两个具有抗肿瘤活性的隆萼当归线型呋喃香豆素化合物。

本发明的另一目的在于提供这种隆萼当归线型呋喃香豆素化合物在制药中的应用。

本发明所述的隆萼当归线型呋喃香豆素化合物是具有以下结构通式的化合物：

其中：R为–H或–CH(CH₃)₂。

当R为–H时为化合物I，当R为–CH(CH₃)₂时为化合物II，其结构式分别为：

                 

         化合物I                        化合物II

本发明所述的隆萼当归线型呋喃香豆素化合物的制备方法为：用丙酮或甲醇溶剂，冷浸或热回流浸提云南隆萼当归根粗粉得到总浸膏，总浸膏用水分散后用有机溶剂乙酸乙酯或氯仿或乙醚或石油醚或苯萃取得萃取物，萃取物经柱层析及半制备HPLC分离后得所述化合物。

本发明选择云南隆萼当归根粗粉为材料，进行提取、分离、结构鉴定和活性筛选等系统工作，从中得到了2个新的线型呋喃香豆素类化合物：化合物I和化合物II。

本发明所述的化合物I和化合物II的制备：

干燥隆萼当归植物根部1.0 kg，粉碎后用纯甲醇重复提取3次（每次3升，室温浸泡24小时），提取液合并，过滤，减压蒸馏除去甲醇，静置，分散于0.5升水中，水溶液用EtOAc萃取数次，蒸干EtOAc得浸膏20.0 g。该浸膏加30.0 g硅胶（100目）拌样后以200.0 g硅胶（200-300目）柱层析，氯仿-丙酮溶剂梯度洗脱（1:0-0:1），TLC检测，合并相同馏分，得馏分段Ⅰ-Ⅳ。馏分段Ⅳ为丙酮洗脱部分，未作进一步分离。 

馏分段Ⅱ（3.5 g）经硅胶柱层析（石油醚/丙酮8:2,7:3）进行梯度洗脱，经TLC检测合并相同馏分，Sephadex LH-20（甲醇）层析以及半制备HPLC（45%甲醇水）得到化合物I （5.0 mg）。

馏分段Ⅲ（4.0 g）经硅胶柱层析（氯仿：甲醇30:1, 20:1, 15:1, 9:1, 8:2）进行梯度洗脱，Sephadex LH-20（甲醇）层析得到化合物II（6.0 mg）。

    其中2个化合物的波谱解析过程：

化合物I ，淡黄色粉末；EIMS（positive）给出准分子离子峰m/z 404 [M]⁺，相应于一个分子式C₂₁H₂₄O₈，HREIMS（positive）证实了这一分子组成（m/z 404.1470 [M]⁺，calcd 404.1471 for C₂₁H₂₄O₈）。¹H NMR谱（见表1）给出了两对烯烃次甲基信号：δ_H 6.31 (1H, d, J 9.65) 和8.18 (1H, d, J 9.65)；δ_H 6.99 (1H, s)和7.65 (1H, s)； ¹³C NMR谱（见表1）上观察到四个次甲基（δ_C 105.0，113.4，139.3，145.5）及七个季碳共11个碳信号。以及紫外光谱数据 221, 248, 268, 311 nm数据表明化合物I 为一个线型呋喃香豆素类化合物。以补骨脂素相应碳的化学位移为基数，特征性碳信号δ_C 127.0 (s， C-8) 和143.8 (s, C-5) 指出化合物I为C-5、C-8二取代线型呋喃香豆素化合物。在HMBC试验中（图1），含氧亚甲基质子δ_H 4.37 (1H, dd, J=3.18, 9.76) 与C-5相关则支持了1″位亚甲基的归属；δ_H 4.62 (1H, dd, J=2.40, 8.17)与C-8相关，支持对1″′位亚甲基的归属。这样，化合物I被鉴定为5-(2",3"-dihydroxy-3"-methylbutyloxy)-8-(2"'-hydroxy-3"'-methyl-3"'-

butyleneoxy)-psoralen,并命名为隆萼当归线型呋喃香豆素A。

 表1        化合物I的¹H和¹³C NMR波谱数据 (MeOD中测定)

化合物II，淡黄色粉末；EIMS（positive）给出准分子离子峰m/z 446 [M]⁺，结合¹³C谱和DEPT谱，相应于一个分子式C₂₄H₃₀O₈，HREIMS（positive）证实了这一分子组成（m/z 446.1933 [M]⁺，calcd 446.1941 for C₂₄H₃₀O₈）。¹H NMR谱（见表2）给出了两对烯烃次甲基信号：δ_H 6.29 (1H, d, J 9.65) 和8.16 (1H, d, J 9.65)；δ_H 6.97 (1H, s)和7.63 (1H, s)；¹³C NMR谱（见表2）上观察到四个次甲基及七个季碳共11个碳信号。以及紫外光谱数据220, 241, 248, 267, 311 nm表明化合物II也是一个线型呋喃香豆素类化合物。比较化合物II与化合物I两个化合物的¹H NMR和 ¹³C NMR谱图，发现2个化合物的数据大部分一致，只在C-3″ (δ_C 77.2, s)位向低场位移了5.6 ppm，且在HMBC试验中（图2），含异丙基次甲基信号δ_H 3.9 (1H, m, H-6^″) 与C-3″相关则支持了3″位的取代基是异丙氧基而不是化合物I中羟基；含氧亚甲基质子δ_H 4.34 (1H, m) 与C-5相关则支持了

1″位亚甲基的归属；δ_H 4.59 (1H, m)与C-8相关，支持对1″′位亚甲基的归属。所以，化合物II被鉴定为5-(2",hydroxy-3"-isopropoxy-3"-methylbutyloxy)-8-(2"'-

hydroxy-3"'-methyl-3"'-butyleneoxy)-psoralen,并命名为隆萼当归线型呋喃香豆素B。

表2     化合物II¹H和¹³C NMR波谱数据 (MeOD中测定)

本发明涉及所述的隆萼当归线型呋喃香豆素化合物在制备抑制肿瘤细胞药物中的应用。

本发明涉及所述的隆萼当归线型呋喃香豆素化合物在制备抑制白血病细胞药物中的应用。

本发明涉及所述的隆萼当归线型呋喃香豆素化合物在制备抑制肝癌细胞药物中的应用。

本发明涉及所述的隆萼当归线型呋喃香豆素化合物在制备抑制肺癌细胞药物中的应用。

本发明涉及所述的隆萼当归线型呋喃香豆素化合物在制备抑制乳腺癌细胞药物中的应用。

本发明涉及所述的隆萼当归线型呋喃香豆素化合物在制备抑制结肠癌细胞药物中的应用。

本发明所述的化合物I和化合物II经对五种细胞株（HL-60，SMMC-7721，A-549，MCF-7，SW480）的体外抗肿瘤活性实验，对五种肿瘤细胞均表现出了较好的细胞毒活性。实验结果显示，化合物Ⅱ个对人白血病细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞均有很强的抑制作用，半数生长抑制浓度范围为1.99～3.69 μΜ，表现了显著的细胞毒活性。化合物I对结肠癌细胞有强抑制作用，半数生长抑制浓度为10.77 μΜ。

本发明所述的化合物的体外抗肿瘤作用：

经对五种细胞株（HL-60，SMMC-7721，A-549，MCF-7，SW480）的体外抗肿瘤活性实验，化合物I和化合物II对五种肿瘤细胞均表现出了较好的细胞毒活性。实验结果显示，化合物II对人白血病细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞均有很强的抑制作用，半数生长抑制浓度范围为1.99～3.69 μΜ，表现了显著的细胞毒活性。化合物I对结肠癌细胞有强抑制作用，半数生长抑制浓度为10.77 μΜ。

体外抗肿瘤活性实验方法：

1．实验设计：

细胞与不同浓度化合物（分别为0.064, 0.32, 1.6, 8, 40μM）温育72小时，采用MTT方法评价化合物对细胞增殖的抑制程度，计算抑制率，根据抑制率采用Logit方法计算IC₅₀, 比较化合物的体外抗肿瘤活性。

2．抑制率计算方法： 

抑制率 (%) = (对照组OD值－用药组OD值) / 对照组OD组×100％

3.实验方法

（1）、接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液（DMEM或者RMPI1640）配成单个细胞悬液，以每孔5000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，贴壁细胞提前12小时接种培养。

（2）、 加入待测化合物溶液（固定浓度40μM初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50%附近的化合物设5个浓度进入梯度复筛），每孔终体积200μl，每种处理均设3个复孔。

（3）、 显色：37摄氏度培养48小时后，每孔加MTT溶液20μl。继续孵育4小时，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加200μl的SDS溶液（10%），过夜孵育（温度37℃），使结晶物充分融解。

（4）、 比色：选择595nm波长，酶联免疫检测仪（Bio-Rad 680）读取各孔光吸收值，记录结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法（Reed and Muench法）计算化合物的IC50值。

表3     化合物I、II对五种细胞株的细胞毒活性                     

  备注：顺铂和紫杉醇是阳性对照。

本发明的化合物可用于制备治疗癌症的药物，特别是用于制备治疗白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌的药物。

上述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、以及和聚乙二醇等。另外还可以在其中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、胶囊和注射剂。

本发明所述药物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

附图说明

图1为本发明所述的化合物I的二维HMBC相关图。

图2为本发明所述的化合物Ⅱ的二维HMBC相关图。

图3为本发明所述的化合物分离流程图。

具体实施方式

下面结合附图用对本发明作进一步的描述，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

片剂：化合物I  10mg   乳糖180mg  淀粉55mg  硬脂酸镁5mg。

制备方法：将化合物I、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250 mg，活性成分含量为10 mg。

实施例2：

安瓿剂：化合物Ⅱ 2mg        氯化钠10mg。

制备方法：将化合物Ⅱ和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例3：

胶囊剂：化合物Ⅱ  10mg   乳糖187mg  硬脂酸镁3mg。

制备方法：将化合物Ⅱ与助剂混合，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。