一种杨树下胚轴特异表达启动子ProWOX11b及其应用

摘要

本发明公开了一种杨树下胚轴特异表达启动子ProWOX11b及其应用。启动子ProWOX11b的核苷酸序列如SEQNO1所示。本发明以南林895杨DNA为材料，采用锚定PCR、反向PCR、TAIL-PCR基因克隆的方法，经过三次步移，克隆得到杨树下胚轴特异表达启动子ProWOX11b序列。采用通路克隆技术构建植物启动子表达载体pBGGUS-ProWOX11b，该启动子序列后接GUS报告基因，在启动子ProWOX11b的驱动下，报告基因GUS可在植物下胚轴特异表达。因此，应用本发明提供的启动子，可以在植物基因工程中，诱导相应目的基因在下胚轴特异表达，改良优良品种选育进程。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杨树下胚轴特异表达启动 子ProWOX11b及其应用。

背景技术

扦插作为林木无性繁殖的重要手段，不仅简单易行、效高价廉，而且能保持 母株的优良性状、提早开花结实。20世纪70年代以来，随着无性系林业的兴起， 林木扦插技术日益成熟，广泛应用。

在林业生长实践中，通常所说的扦插，一般指硬枝扦插或嫩枝扦插，其关键 是不定根的形成：首先是薄壁细胞或维管束细胞脱分化形成特定细胞群，即分生 点-根原始体，而后分生细胞逐渐向活跃状态转变并且开始分裂，新产生的细胞 群逐渐形成锥状体并分化成木质部和韧皮部，继而与插穗的输导组织结合在一 起，渐渐地根原基穿过皮层和表皮向外突出形成不定根(Haissig 1974a)。有些树 种不定根原始体在发育早期未离体时就已经产生，即潜伏根原始体。扦插前它一 直处于休眠状态，直至插穗离体后在适宜的环境条件下继续发育成根原基产生不 定根。但也有一些树种是在扦插后才分化出根原始体，称为诱发根原始体。

林木扦插生根按其形成的时间、部位和机制可分为皮部生根型、愈伤生根型 和混合生根型三大类。皮部生根型植物在插穗离体前或经过贮藏，激素处理后， 插穗皮层、形成层等组织就有根原始体形成，扦插后，只是根原始体的继续生长 发育。愈伤组织生根型是在插穗扦插后从下切口愈伤组织内的再生维管形成层 处，或在切口处的原维管形成层产生愈伤组织的同时，也产生不定根原始体，进 而形成不定根。混合生根类型是指既有皮部生根，又有愈伤组织生根；其过程是 扦插后，先是皮部生根来吸收水分和养分以维持生命，待下切口愈伤组织生根后， 皮部产生的不定根有的很快衰亡，有的退居次要，而由愈伤组织产生的不定根发 育成植株的主要根系。

林木扦插生根是一个非常复杂的生物学过程，国内外学者对其机理进行了大 量研究，但这些工作都局限于解剖学和生理学领域，对扦插生根分子机理的认识 和了解比较缺乏。一方面在于林木分子遗传学起步较晚；再者，由于林木自身的 一些生物学特性，在林木中精确定位与克隆未知基因一度被视为遗传学研究领域 的难点。杨树全基因组测序完成，克隆和验证杨树生长发育相关基因成为可能。 WOX基因家族在根尖干细胞维持、不定根根原基启动等过程中起着非常重要的 作用。在杨树中克隆和鉴定不定根特异表达启动子，不仅可丰富植物根系分子生 物学的理论基础，而且在植物无性繁殖和离体器官再生方面具有重要的应用价 值。

植物基因工程中常用的启动子有3类：组成型启动子、诱导型启动子和组织 特异性启动子。组织特异性启动子是指在这类启动子调控下，基因转录一般只发 生在某些特定器官或组织中。这类启动子中一般同时存在几种控制组织特异性表 达的元件，其表达特异性由这些元件的种类、数目及相对位置等共同决定。在杨 树中尚未有克隆和鉴定不定根特异表达启动子的相关报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杨树下胚 轴特异表达启动子ProWOX11b。本发明的另一目的是提供一种杨树下胚轴特异 表达启动子ProWOX11b的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种杨树下胚轴特异表达启动子ProWOX11b，其氨基酸序列如SEQ NO1 所示。

含有杨树下胚轴特异表达启动子ProWOX11b的载体。所述载体在ProWOX 11b启动子的3’端组装GUS报告基因。所述载体组装Bial基因表达盒，作为转 基因植物的筛选标记，可以用除草剂进行转基因植株的筛选。所述载体组装LB 和RB序列，促使组装于其间的ProWOX11b启动子表达框架和筛选标记基因Bi al整合至植物受体细胞染色体中。

含有杨树下胚轴特异表达启动子ProWOX11b的宿主细胞。

杨树下胚轴特异表达启动子ProWOX11b在调控基因在植物体下胚轴特异表 达中的应用。

本发明以南林895杨(Populus x euramericana cv.‘Nanlin895’)DNA为材料， 采用锚定PCR、反向PCR、TAIL-PCR基因克隆的方法，经过三次步移，克隆得 到杨树下胚轴特异表达启动子ProWOX11b序列。采用通路克隆技术构建植物启 动子表达载体pBGGUS-ProWOX11b，该启动子序列后接GUS报告基因，在启 动子ProWOX11b的驱动下，报告基因GUS可在植物下胚轴特异表达。

有益效果：本发明通过农杆菌介导将ProWOX11b启动子转入拟南芥，转Pr oWOX11b启动子载体的T2代拟南芥植株GUS染色结果显示，GUS基因在下胚 轴特异表达。因此，应用本发明提供的启动子，可以在植物基因工程中，诱导相 应目的基因在下胚轴特异表达，改良优良品种选育进程。

附图说明

图1是植物表达载体pBGGUS的结构示意图；

图2是野生型植株GUS染色图；

图3是转基因植株GUS染色图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例所使用的主要试剂盒和药品为：Plant Genomic DNA Kit(TIA  NGEN)，LR Clonase II enzyme Mix(Invitrogen)，pCR^TM8/GW/TOPO^TM vect  or(Invitrogen)，TaKaRa LA Taq(TaKaRa)，TaKaRa Taq(TaKaRa)，pMD-19 T(TaKaRa)，H.Q.&Q.Gel Extraction kit II(安徽优晶生物工程有限公司)，末 端转移酶(TaKaRa)，Bgl II(NEB)，BamH I(NEB)，T4DNA Ligase(Fer  mentas)。所有引物合成及测序工作均由Invitrogen(上海)完成。其他未作出说 明的均为常规要求。

实施例1提取南林895杨DNA

可采用常规方法提取南林895杨DNA，也可以采用TIANGEN公司的植物 基因组DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit)来提取南林895杨DNA， 操作步骤稍有改进：

吸取1mL缓冲液GP1于2mL离心管中，65℃预热；同时，取南林895杨组 培苗叶片100mg于液氮中充分研磨；分装65℃预热GP1缓冲液；将研磨精细的 样品粉末迅速转移到预热的1mLGP1缓冲液中(加样前在预热的1mL缓冲液G P1中加入10μL β-巯基乙醇)，剧烈颠倒混匀后65℃水浴20min；加入1mL氯仿， 充分混匀，12000rmp离心5min后转移上层水相至新的离心管中；重复该步骤一 次；向装有上层水相的离心管中加入1mL缓冲液GP2，充分混匀；将混合液转 入吸附柱CB3中，12000rmp离心30sec，弃滤液；向吸附柱CB3中加入500μL 去蛋白液GD，12000rmp离心30sec，弃滤液；向吸附柱CB3中加入700μL漂洗 液PW，12000rmp离心30sec，弃滤液；向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW， 12000rmp离心30sec，弃滤液；将吸附柱CB3转入新的离心管，12000rmp离心 2min，去除残余的漂洗液，室温静置气干吸附柱CB3；将吸附柱CB3转入新的 离心管中，向吸附膜的中部加入50μL灭菌Milli-Q水，室温静置2min，12000 离心30sec；将滤液重新转入吸附柱CB3中，室温静置2min，12000离心2min， 滤液即为基因组DNA。

实施例2克隆ProWOX11a启动子

以南林895杨DNA(实施例1制备)为材料，采用锚定PCR、反向PCR、 TAIL-PCR基因克隆的方法，经过三次步移，克隆得到ProWOX11b启动子序列， 如SEQ NO1所示。主要过程如下：

(1)锚定PCR

单引物PCR扩增：以2μg南林895杨基因组总DNA为模板，采用锚定PC R单引物进行单引物扩增，锚定PCR单引物序列为5’ACACCACCGCTATCGT ATGCCCGT 3’。反应体系如下：10×Ex PCR Buffer(Mg²⁺free)5.0μL；2.5mM  dNTP Mixture 4.0μL；25mM Mg²⁺ 4.0μL；Ex Taq DNA Polymerase(5U/μL)0. 25μL；锚定PCR单引物(10μM)2μL；模板(895杨DNA 1μg/μL)2μL；加无 菌ddH₂O补足50μL。反应程序：预变性94℃，7min；94℃，30s，62℃，30s， 72℃，1.5min，25个循环，常规方法回收产物。

加尾反应：在单引物PCR扩增的回收产物中加入6μL加尾缓冲液(5×)，1μ L 10mmol/L dCTP后，再加无菌双蒸水至29μL；反应混合物先在94℃保温2m in，立即置于冰上，加入1μL末端转移酶后在37℃保温15min，再在75℃保温1 0min以灭活末端转移酶。

巢式PCR：采用锚定引物AAP：5’GGCCACGCGTCGACTAGTAGTACGG GGGGGGG3’和巢式基因特异性引物：5’GCTTTGGAGTCCACCTTGACCTC 3’ 对加尾产物的扩增。反应体系如下：10×Ex PCR Buffer(Mg²⁺free)5.0μL；2. 5mM dNTP Mixture 4.0μL；25mM Mg²⁺4.0μL；Ex Taq DNA Polymerase(5U/ μL)0.25μL；锚定引物AAP(10μM)2μL；巢式基因特异性引物(10μM)2μL；加 尾产物1μL；加无菌ddH₂O补足50μL。反应程序：预变性94℃，5min；94℃， 30s，55℃，30s，72℃，2min，35个循环；72℃，10min。

使用安徽优晶生物工程有限公司DNA凝胶回收试剂盒(H.Q.&Q.Gel Extract  ion kit II)回收纯化PCR产物。具体操作：称量回收凝胶重量，近似折算其体积； 加入等体积的NJ缓冲液，60℃温浴7min至凝胶完全融化；将融化后的DNA- 琼脂糖溶液转入Mu-Pu DNA回收纯化柱中，室温12000rmp离心1min，弃滤液； 向纯化柱中加入700μL工作浓度的SPW(即等体积无水乙醇稀释)洗涤缓冲液， 静置2-3min，室温13000rmp离心1min，弃滤液；重复此步骤一次；室温13000 rmp离心1min以干燥纯化柱；将纯化柱转移至新的1.5mL离心管中，加入30-5 0μL灭菌Milli-Q水，静置1min后13000rmp离心1min，滤液即为纯化的PCR 产物；取2μL纯化产物，琼脂糖凝胶电泳检测，判断回收片段是否含有杂带， 避免非特异PCR产物影响后续实验。

纯化片段与克隆载体的连接反应：采用TaKaRa公司的pMD19-T simple V  etor克隆目的DNA分子，参考说明书，连接反应体系与程序稍有改进，具体为： 反应体系(5μL)：2.2μL纯化回收的PCR产物，0.3μL pMD-19Simple Vector， 2.5μL Solution I。反应条件：16℃30min；4℃过夜。

大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰 上融化；取5μL纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100μL感受态细胞中， 并轻轻混匀，冰浴30min左右；42℃水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min； 加入800μL LB液体培养基，37℃，100rmp摇菌1h；4000rmp离心3min，吸掉 上层800μL培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板 上，37℃倒置培养过夜。

阳性克隆筛选及测序分析：从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养 基中，37℃，250rmp摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子 的PCR检测，反应体系如表3所示，反应程序为：反应程序为：94℃，3min；9 4℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，28个循环；72℃，7min。菌液PCR检 测为阳性的克隆送英骏生物技术公司(上海)测序鉴定，得锚定PCR序列片段， 序列如SEQ NO2所示。

(2)反向PCR

采用限制性内切酶对南林895杨DNA进行消化：采用Bgl II，BamH I对1 μg南林895杨DNA进行双酶切完全消化，反应体系如下：Bgl II 1.0μL，10× H buffer 2.0μL，DNA 1.0μL，加无菌ddH₂O补足20μL。反应程序：37℃，1h。 所得产物纯化回收再经第二步酶切，反应体系如下：BamH I 1.0μL，10×K buf  fer 2.0μL，DNA 1.0μL，加无菌ddH₂O补足20μL。反应程序：30℃，1h。酶切 消化后的产物进行纯化后，溶解在无菌水中。

环化反应：采用T4DNA Ligase进行线性DNA片段的自我环化连接反应， 得环化连接反应产物。反应体系如下：线性DNA 10-50μg；10×T4DNA Ligas  e buffer 5μL；T4DNA Ligase(5U/μL)1μL，加无菌ddH₂O补足50μL。反应程 序：22℃温育1h，再在65℃保温10min灭火T4DNA Ligase。

巢式PCR扩增获得启动子序列：采用巢式引物进行反向PCR扩增启动子片 段。以SEQ NO2的序列为参考，设计巢式引物。巢式引引物为：F1：3’CCCA AAATAACATTCCTTCCGGTTC 5’，R1：3’TTTGACTGGACTTCGGTGCTTGA 5’，F2：3’CAAAATAACATTCCTTCCGGTTCAC 5’，R2：3’GGACTTCGGTGC TTGAATTTACAAC 5’。反应体系如表2所示。反应程序：94℃，3min；94℃，3 0sec，60℃，30sec，72℃，2min，35cycles；72℃，7min。对PCR产物依次进行 回收纯化、连接T载体、转化大肠杆菌、挑选克隆测序，方法与锚定PCR过程 相同。最终得反向PCR序列片段，序列如SEQ NO3所示。

表2巢式PCR扩增获得启动子序列的反应体系

  Outer Inverse PCR Component   Amount   Inner Inverse PCR Component   10×LA PCR Buffer(Mg2+Free)   5.0μL   10×LA PCR Buffer(Mg2+Free)   MgCl₂(25mM)   5.0μL   MgCl₂(25mM)   dNTP Mixture(each 2.5mM)   8.0μL   dNTP Mixture(each 2.5mM)   F1(10μM)   2.0μL   F2(10μM)   R1(10μM)   2.0μL   R2(10μM)   环化连接反应产物   1μL   Outer Inverse PCR product   TakaRa LA Taq(5U/μL)   0.5μL   TakaRa LA Taq(5U/μL)   Nuclease-free Water   26.5μL   Nuclease-free Water   Total volume   50μL   Total volume

(3)TAIL-PCR

以SEQ NO3序列为参考，设计TAIL-PCR引物，包括通用引物和特异性引 物。通用引物AD1：5’TGWGNAGWANCASAGA 3’；AD2：5’CAWCGICNGA IASGAA 3’；AD3：5’TCSTICGNACITWGGA 3’；AD4：5’NTCGASTWTSGW GTT 3’；AD5：5’NGTCGASWGANAWGAA 3’；AD6：5’WGTGNAGWANCA NAGA 3’；AD7：5’AGWGNAGWANCAWAGG 3’。以及特异性引物TAIL-PCR1： 5’AAAATTAAACAGCTTTCACTTGAGTAG 3’；TAIL-PCR2：5’TCTAACAAT TTAAATTATTAGGTTGAG 3’；TAIL-PCR3：5’AAGATGCAATGTCTTTAAATT AT 3’。

反应体系如表3和表4所示，反应程序包括第一轮、第二轮和第三轮。第一 轮：94℃，5min；94℃，10s，64℃，30s，72℃，3min，10个循环；94℃，10s； 25℃，3min；72℃，2.5min；94℃，10s，64℃，3min，72℃，2.5min，94℃，1 0s，64℃，3min，72℃，2.5min，94℃，10s，44℃，1min，72℃，2.5min，15 个循环。第二轮：94℃，5min；94℃，10s，60℃，3min，72℃，2.5min，94℃， 10s，64℃，3min，72℃，2.5min，94℃，10s，44℃，1min，72℃，2.5min，12 个循环。第三轮：94℃，5min；94℃，10s；44℃，1min；72℃，2.5min。对PC R产物依次进行回收纯化、连接T载体、转化大肠杆菌、挑选克隆测序，方法与 锚定PCR过程相同。最终得TAIL-PCR序列片段，序列如SEQ NO4所示。

表3-1TAIL-PCR的反应体系

  1^stTAIL-PCR Component   Amount   2^ndTAIL-PCR Component   10×LA PCR Buffer(Mg2+Free)   5.0μL   10×LA PCR Buffer(Mg2+Free)   MgCl₂(25mM)   5.0μL   MgCl₂(25mM)   dNTP Mixture(each 2.5mM)   8.0μL   dNTP Mixture(each 2.5mM)   AD*(10μM)   2.0μL   AD*(10μM)   TAIL-PCR1(10μM)   2.0μL   TAIL-PCR2(10μM)   南林895杨DNA   1μL   1^stTAIL-PCR product   TakaRa LA Taq(5U/μL)   0.5μL   TakaRa LA Taq(5U/μL)   Nuclease-free Water   26.5μL   Nuclease-free Water   Total volume   50μL   Total volume

表3-2TAIL-PCR的反应体系

  3^rd TAIL-PCR Component   Amount   10×LA PCR Buffer(Mg2+Free)   5.0μL   MgCl₂(25mM)   5.0μL   dNTP Mixture(each 2.5mM)   8.0μL   AD*(10μM)   2.0μL   TAIL-PCR3(10μM)   2.0μL   2^ndTAIL-PCR product   1μL   TakaRa LA Taq(5U/μL)   0.5μL   Nuclease-free Water   26.5μL   Total volume   50μL

注：表3-1、2中的*AD为使用所述AD1-AD7引物分别进行TAIL-PCR。 采用BioEdit软件对三次步移结果序列(SEQ NO2、SEQ NO3、SEQ N O4)进行比对拼接，设计特异性引物：ProWOX11b正向引物：5’TTAATGTT GATATAATTATATGGCT3’和ProWOX11b反向引物：5’TGGCTCACTTCTTT CAGTTC3’。高保真PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer(Mg²⁺free)5.0 μL；2.5mM dNTP Mixture 8.0μL；25mM Mg²⁺5.0μL；LA Taq DNA Polymer  ase(5U/μL)0.5μL；ProWOX11b正向引物(10μM)2μL；ProWOX11b反向引 物(10μM)2μL；模板(895杨DNA 1μg/μL)1μL；加无菌ddH₂O补足50μL。 反应程序：预变性94℃，3min；94℃，40s，55℃，30s，72℃，2min，35个循 环；72℃，10min。对扩增产物测序，得ProWOX11b启动子1706bp的序列，如 SEQ NO1所示。

实施例2ProWOX11b启动子表达载体构建

利用通路克隆技术构建ProWOX11b启动子的表达载体。使用特异PCR引物 (同实施例1特异性引物)，以南林895杨DNA为模板，进行PCR扩增。高保 真PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer(Mg²⁺free)5.0μL；2.5mM dNTP  Mixture 8.0μL；25mM Mg²⁺5.0μL；LA Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL；P roWOX11b正向引物(10μM)2μL；ProWOX11b反向引物(10μM)2μL；模板(8 95杨DNA 1μg/μL)1μL；加无菌ddH₂O补足50μL。反应程序：预变性94℃， 3min；94℃，40s，55℃，30s，72℃，2min，35个循环；72℃，10min。并定 向克隆到入门载体，入门载体为pCR^TM8/GW/TOPO^TM vector(Invitrogen)。反应 体系为：Fresh PCR product(purified)10-20ng；Salt solution 1μL；pCR^TM8/G W/TOPO^TM vector 1μL；加无菌ddH₂O补足6μL。反应程序为：室温静置30mi n。

大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰 上融化；将6μL连接产物，加入到100μL感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30 min左右；42℃水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min；加入800μL LB液体 培养基，37℃，100rmp摇菌1h；4000rmp离心3min，吸掉上层800μL培养基， 混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有spc的LB筛选培养板上，37℃倒置培养过夜。

阳性克隆筛选及测序分析：从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及 测序验证，反应体系如表3所示。

表3PCR检测反应体系

  10×PCR Buffer(Mg²⁺free)   2.0μL   MgCl₂(25mM)   1.5μL   dNTP Mixture(each 2.5mM)   1.3μL   ProWOX11b正向引物   1.0μL   ProWOX11b反向引物   1.0μL   菌液   0.1μL   TaKaRa Taq   1.0μL   Milli-Q Water   12.1μL   Total volume   20.0μL

反应程序为：94℃，3min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，28个循 环；72℃，7min。菌液PCR检测为阳性的克隆送英骏生物技术公司(上海)测 序鉴定正确。

带有ProWOX11b的入门载体与植物表达载体pBGGUS(Invitrogen)进行L R反应。反应体系为：linearized entry clone 100ng；purified destination vector (100ng/μL)1.5μL；LR Clonase II enzyme mix 2μL；加TE(pH 8.0)补足10μL；。 反应条件：25℃1h。植物表达载体pBGGUS如图1所示。经LR反应后ProW OX11a启动子交换至植物表达载体pBGGUS中，通过PCR检测及测序验证，确 认启动子载体构建成功，命名为pBGGUS-ProWOX11b，该载体在ProWOX11b 启动子的3’端组装GUS报告基因，其编码的β-葡萄糖苷酸酶，能催化5-溴-4- 氯-3吲哚葡萄糖苷酸(X-Gluc)形成不溶解的5，5’-二溴-4，4’-二氯深色的靛蓝 色物质，使得具有GUS活性的部位呈现蓝色。在载体上组装Bial基因表达盒， 作为转基因植物的筛选标记，可以用除草剂进行转基因植株的筛选。所述载体组 装LB和RB序列，促使组装于其间的ProWOX11b启动子表达框架和筛选标记 基因Bial整合至植物受体细胞染色体中。

实施例3ProWOX11b启动子组织特异表达分析

通过常规液氮冻融法将所构建的pBGGUS-ProWOX11b转入农杆菌菌株EH A105(Invitrogen)，通过农杆菌介导将ProWOX11b启动子转入拟南芥。转ProW OX11b启动子载体的T2代拟南芥植株GUS染色结果如图3所示，通过与图2 的野生型植株GUS染色图对比，显示，GUS基因在下胚轴特异表达。因此，应 用本发明提供的启动子，可以在植物基因工程中，诱导相应目的基因在下胚轴特 异表达，改良优良品种选育进程。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京林业大学

 

<120>  一种杨树下胚轴特异表达启动子ProWOX11b及其应用

 

<130>  100

 

<160>  23   

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1706

<212>  DNA

<213>  Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'

 

<400>  1

ttaatgttga tataattata tggctattaa ttaaccacaa attaaggata taattaagaa       60

 

tgatcattac cctcgataat tagcaatccc attaatatat atgtatgcat atcaccagaa      120

 

tccctataaa cgaaggaaaa gcctacaggg cggaggaaac ctggtctgag acagctgaag      180

 

cagtcggttc cggttcctga agctccgtta catgtaaacg cagtaataga atatgaatat      240

 

aaaagcatga catgttgcag acattttgat acacgtagaa aagtgttcga tgtatcagcc      300

 

aacttttgtc accgctttcc ttcctctctc gtttaatata aaaaagagag gtcaggagag      360

 

gagaggagag gagaggactc agtgagtcag ccatgtttcc ttatacgtca ttgttaataa      420

 

attattgcac agtttcttga ccgtctattt ggatccttcc tctcattttc cgattaaata      480

 

attctccgga ctcgacttcc catgcatgcc tgcacatgca cttgccaagt tgaaaaccct      540

 

agccaacttt tcttgtctac cattaacatt accgttttga ccactccttc gagagatttt      600

 

cccatgcaac catgtttatt agttaatgta tatgctctac taatagaacg ggaggatcaa      660

 

attatataat tagtgatcat gtgaatcgaa agaatattca aatacagatg taatttaatt      720

 

aataaattta attaaaagat tgcaacttaa atatattttt tgaaaaacat gagcacagaa      780

 

cgttataata atttatacta atgatttagt tcaaggttat ctcctcgtgt agaatcagaa      840

 

ttacaaacaa taccatttgt gaggaaatac ttatacaggt tgattaatga gcagcatttg      900

 

gggcgatttt ccaaaattgt catacaacat ggaatatcaa tattgattat attttattaa      960

 

ataatgtgtt ataattaata aattaatgta aacaattttt gagatttatg attataacca     1020

 

actatataat aattaattta aagatattgc atcttgtgaa agaaccttct caacccaact     1080

 

atataataat ttaaagacat tgcatctttt aaaaaaatca tctcaaccta ataatttaaa     1140

 

ttgttagatg agatcttaat atatgattaa tattctttaa tacatctact caagtgaaag     1200

 

ctgtttaatt tttatcaaat aaataaaaat tatgagattt gaatttgtga ccgcttagtt     1260

 

attaaaattc taatatcata ttaaataata tctcaattta ttaaataaaa tatttcaaga     1320

 

tataatttaa aatataattt atattatttt ataacaaatc cactttttat ctcattaaat     1380

 

cctacaatgg agcactcttt gactactgat tatatgttcg aataaactaa gttgggcggt     1440

 

tgacttggaa gagaaagatt agcataacat tttctaaacc aggtaaagtt gtaaattcaa     1500

 

gcaccgaagt ccagtcaaac caaggttgat cacgtaaatt cccaaaataa cattccttcc     1560

 

ggttcaccgc tttatatata caacctcatc tctctatgca ttctgccttg tgcatatgta     1620

 

ctttccttct ctcccatatt attgttaatt tttttatttt tttatttttt atcgacaaac     1680

 

atttcttttc ttcatttcaa tacagt                                          1706

 

 

<210>  2

<211>  376

<212>  DNA

<213>  Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'

 

<400>  2

taagttgggc ggttgacttg gaagagaaag attagcataa cattttctaa accaggtaaa       60

 

gttgtaaatt caagcaccga agtccagtca aaccaaggtt gatcacgtaa attcccaaaa      120

 

taacattcct tccggttcac cgctttatat atacaacctc atctctctat gcattctgcc      180

 

ttgtgcatat gtactttcct tctctcccat attattgtta atttttttat ttttttattt      240

 

tttatcgaca aacatttctt ttcttcattt caatacagta tggaagataa tcaaggccaa      300

 

gaccaagacc ataacagtcc aagcaaccat ggaactgaaa gaagtgagcc agtgaggtca      360

 

aggtggactc caaagc                                                      376

 

 

<210>  3

<211>  653

<212>  DNA

<213>  Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'

 

<400>  3

aattgtcata caacatggaa tatcaatatt gattatattt tattaaataa tgtgttataa       60

 

ttaataaatt aatgtaaaca atttttgaga tttatgatta taaccaacta tataataatt      120

 

aatttaaaga tattgcatct tgtgaaagaa ccttctcaac ccaactatat aataatttaa      180

 

agacattgca tcttttaaaa aaatcatctc aacctaataa tttaaattgt tagatgagat      240

 

cttaatatat gattaatatt ctttaataca tctactcaag tgaaagctgt ttaattttta      300

 

tcaaataaat aaaaattatg agatttgaat ttgtgaccgc ttagttatta aaattctaat      360

 

atcatattaa ataatatctc aatttattaa ataaaatatt tcaagatata atttaaaata      420

 

taatttatat tattttataa caaatccact ttttatctca ttaaatccta caatggagca      480

 

ctctttgact actgattata tgttcgaata aactaagttg ggcggttgac ttggaagaga      540

 

aagattagca taacattttc taaaccaggt aaagttgtaa attcaagcac cgaagtccag      600

 

tcaaaccaag gttgatcacg taaattccca aaataacatt ccttccggtt cac             653

 

 

<210>  4

<211>  1098

<212>  DNA

<213>  Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'

 

<400>  4

ttaatgttga tataattata tggctattaa ttaaccacaa attaaggata taattaagaa       60

 

tgatcattac cctcgataat tagcaatccc attaatatat atgtatgcat atcaccagaa      120

 

tccctataaa cgaaggaaaa gcctacaggg cggaggaaac ctggtctgag acagctgaag      180

 

cagtcggttc cggttcctga agctccgtta catgtaaacg cagtaataga atatgaatat      240

 

aaaagcatga catgttgcag acattttgat acacgtagaa aagtgttcga tgtatcagcc      300

 

aacttttgtc accgctttcc ttcctctctc gtttaatata aaaaagagag gtcaggagag      360

 

gagaggagag gagaggactc agtgagtcag ccatgtttcc ttatacgtca ttgttaataa      420

 

attattgcac agtttcttga ccgtctattt ggatccttcc tctcattttc cgattaaata      480

 

attctccgga ctcgacttcc catgcatgcc tgcacatgca cttgccaagt tgaaaaccct      540

 

agccaacttt tcttgtctac cattaacatt accgttttga ccactccttc gagagatttt      600

 

cccatgcaac catgtttatt agttaatgta tatgctctac taatagaacg ggaggatcaa      660

 

attatataat tagtgatcat gtgaatcgaa agaatattca aatacagatg taatttaatt      720

 

aataaattta attaaaagat tgcaacttaa atatattttt tgaaaaacat gagcacagaa      780

 

cgttataata atttatacta atgatttagt tcaaggttat ctcctcgtgt agaatcagaa      840

 

ttacaaacaa taccatttgt gaggaaatac ttatacaggt tgattaatga gcagcatttg      900

 

gggcgatttt ccaaaattgt catacaacat ggaatatcaa tattgattat attttattaa      960

 

ataatgtgtt ataattaata aattaatgta aacaattttt gagatttatg attataacca     1020

 

actatataat aattaattta aagatattgc atcttgtgaa agaaccttct caacccaact     1080

 

atataataat ttaaagac                                                   1098

 

 

<210>  5

<211>  24

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  锚定PCR单引物

 

<400>  5

acaccaccgc tatcgtatgc ccgt                                              24

 

 

<210>  6

<211>  32

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  锚定引物AAP

 

<400>  6

ggccacgcgt cgactagtag tacggggggg gg                                     32

 

 

<210>  7

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  巢式基因特异性引物

 

<400>  7

gctttggagt ccaccttgac ctc                                               23

 

 

<210>  8

<211>  25

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  F1

 

<400>  8

cccaaaataa cattccttcc ggttc                                             25

 

 

<210>  9

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  R1

 

<400>  9

tttgactgga cttcggtgct tga                                               23

 

 

<210>  10

<211>  25

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  F2

 

<400>  10

caaaataaca ttccttccgg ttcac                                             25

 

 

<210>  11

<211>  25

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  R2

 

<400>  11

ggacttcggt gcttgaattt acaac                                             25

 

 

<210>  12

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<212>  DNA

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<220>

<223>  AD1

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (5)..(5)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<220>

<221>  misc_feature

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<223>  n is a, c, g, or t

 

<400>  12

tgwgnagwan casaga                                                       16

 

 

<210>  13

<211>  14

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  AD2

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (7)..(7)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<400>  13

cawcgcngaa sgaa                                                         14

 

 

<210>  14

<211>  14

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  AD3

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (7)..(7)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<400>  14

tcstcgnact wgga                                                         14

 

 

<210>  15

<211>  15

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  AD4

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (1)..(1)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<400>  15

ntcgastwts gwgtt                                                        15

 

 

<210>  16

<211>  16

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  AD5

 

 

<220>

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<222>  (1)..(1)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<220>

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<223>  n is a, c, g, or t

 

<400>  16

ngtcgaswga nawgaa                                                       16

 

 

<210>  17

<211>  16

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  AD6

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (5)..(5)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (10)..(10)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<220>

<221>  misc_feature

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<223>  n is a, c, g, or t

 

<400>  17

wgtgnagwan canaga                                                       16

 

 

<210>  18

<211>  16

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  AD7

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (5)..(5)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (10)..(10)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<400>  18

agwgnagwan cawagg                                                       16

 

 

<210>  19

<211>  27

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  TAIL-PCR1

 

<400>  19

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<210>  20

<211>  27

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  TAIL-PCR2

 

<400>  20

tctaacaatt taaattatta ggttgag                                           27

 

 

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<211>  23

<212>  DNA

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<220>

<223>  TAIL-PCR3

 

<400>  21

aagatgcaat gtctttaaat tat                                               23

 

 

<210>  22

<211>  25

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  ProWOX11b正向引物

 

<400>  22

ttaatgttga tataattata tggct                                             25

 

 

<210>  23

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  ProWOX11b反向引物

 

<400>  23

tggctcactt ctttcagttc                                                   20