杨树木质部特异性启动子的功能及JCesAP关键调控域研究

摘要

杨树是我国的主要树种之一，具有生长迅速、适应性强、易杂交、易改良等优良特性。随着园林绿化事业的发展，杨树在我国环境建设中也发挥着愈加重要的作用。但由于天牛类蛀干害虫严重危害杨树，而且采用传统防治技术难以见效且污染环境，所以利用植物基因工程技术防治天牛类蛀干害虫成为有效解决这一问题的有效措施。
　　本研究将前期从杨树中分离到的启动子融合报告基因的植物表达载体转化杨树及烟草，通过对转基因植物中不同组织、器官GUS报告基因的定量活性检测，从而筛选具有木质部组织特异性启动子。通过定量检测创伤及ABA激素刺激条件下，转基因杨树不同器官的GUS酶活性，来分析不同启动子对创伤及ABA激素诱导的响应情况。并采用5'端缺失分析方法，对前期从加杨中分离得到的木质部特异启动子JCesAP，利用模式植物作为转基因体系，分析启动子不同区段驱动GUS基因在转基因植物中的表达能力和水平。明确各调控元件的结构与功能及相互之间的关系、确定控制木质部组织特异性及诱导活性的调控元件。主要研究结果如下:
　　(1)采用农杆菌介导法获得含有三个植物表达载体PMDCesAP-GUS、PJCesAP-GUS、PDMDCesAP-GUS的转基因植株。GUS组织化学染色结果表明，植物材料叶脉、叶肉都显示蓝色，说明MDCesAP、JCesAP、DMDCesAP都具有启动子活性。而且MDCesAP叶脉与叶肉比较显示明显的深蓝色，说明具有明显的木质部组织特异性。通过GUS定量活性检测结果表明:MDCesAP是3个启动子中功能最强的，且具有木质部组织特异性;与叶、茎比较，串联改造后的DMDCesAP启动子在根部组织特异性最高;与根、茎比较，JCesAP启动子在叶部组织特异性最高。
　　(2)以融合PMDCesAP-GUS、PJCesAP-GUS、PDMDCesAP-GUS的转基因杨树作为实验材料，分别对其根、茎、叶进行创伤及ABA(脱落酸Abscisie Acid)激素诱导处理，通过定量检测转基因杨树不同器官的GUS酶活性，来分析不同启动子对创伤及ABA激素诱导的响应情况。结果表明，创伤处理转基因杨树12h时，PMDCesAP的根的GUS酶活达到最高点。ABA激素处理转基因杨树，PDMDCesAP、PJCesAP在根中的GUS酶活是先升高、降低、升高再降低的趋势，处理0h时PDMDCesAP的GUS酶活最高;PMDCesAP的根、茎在ABA激素处理前GUS酶活处于最大值。
　　(3)以融合PMDCesAP-GUS、PJCesAP-GUS、PDMDCesAP-GUS的转基因烟草作为实验材料，分别对其根、茎、叶进行创伤及ABA激素诱导处理，通过定量检测转基因烟草不同器官的GUS酶活性，来分析不同启动子对创伤及ABA激素诱导的响应情况。结果表明，创伤处理转基因烟草24h时，PJCesAP的根的GUS酶活达到最高点。ABA激素处理转基因烟草，PMDCesAP在根中的GUS酶活是降低、升高、降低、升高的变化规律;PJCesAP在根、叶中的GUS酶活是先升高再降低的变化规律;PDMDCesAP的根在ABA激素处理前GUS酶活处于最大值。
　　((4)将GUS作为报告基因，构建了JCesAP启动子的一系列植物缺失表达载体，并通过农杆菌介导转化模式植物的方法对启动子的缺失片段活性进行分析。采用瞬时检测功能分析结果表明，L2、 L3和L4三个启动子缺失片段均具有启动予功能。在得到的稳定表达的转基因烟草植株中，经过GUS组织化学染色可知，L2叶片表面有明显的蓝色区域，L3和L4需要在显微镜下仔细观察方能看出蓝色，不太明显，表明L2、L3和L4启动子都具有启动子活性，L2的启动子活性强于L3和L4启动子活性。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 植物启动子分类

1．2 启动子研究进展

1．2．1 组织或器官特异性启动子

1．2．2 诱导型启动子

1．2．3 组成型启动子

1．3 启动子的研究方法

1．3．1 启动子克隆的方法

1．3．2 启动子表达的方法

1．3．3 启动子缺失突变方法

1．4 杨树基因工程抗性研究的现状及展望

1．4．1 杨树基因工程抗性研究的现状

1．4．2 杨树基因工程抗虫研究的发展前景

1．5 研究目的及意义

2 启动子木质部组织特异性活性研究

2．1 材料

2．1．1 试验材料

2．1．2 试剂

2．2 试验方法

2．2．1 菌液的制备

2．2．2 杨树的转化

2．2．3 转基因杨树GUS报告基因的检测

2．3 结果与分析

2．3．1 转基因杨树GUS报告基因的分子检测

2．3．2 转基因杨树的GUS组织化学染色

2．3．3 转基因杨树的GUS活性定量检测

3 启动子诱导活性研究

3．1 转基因毛白杨的诱导处理

3．1．1 材料

3．1．2 试验方法

3．1．3 结果与分析

3．2 转基因烟草的诱导处理

3．2．1 试验材料

3．2．2 试验方法

3．2．3 结果与分析

4 加杨木质部特异启动子缺失片段的克隆

4．1 材料

4．1．1 材料和试剂

4．1．2 培养基及抗生素

4．2 试验方法

4．2．1 JCesAP启动子5’系列缺失片段的获得

4．2．2 植物表达载体的构建

4．3 结果与分析

4．3．1 不同长度5’端缺失启动子及全长启动子的克隆

4．3．2 JCesAP启动子重组表达载体的鉴定

4．3．3 重组质粒转化根癌农杆菌的PCR检测

5 加杨木质部特异启动子缺失序列的功能分析

5．1 材料

5．1．1 试验材料

5．1．2 培养基

5．2 试验方法

5．2．1 烟草瞬时表达

5．2．2 农杆菌介导的叶盘法转化烟草

5．2．3 转基因烟草的PCR检测

5．2．4 GUS基因表达的组织化学染色

5．3 结果与分析

5．3．1 转基因烟草的瞬时检测

5．3．2 转基因烟草植株的获得

5．3．3 转基因烟草的PCR检测

5．3．4 转基因烟草的GUS基因表达的组织化学染色

6 结论

参考文献

在读期间已发表论文

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致谢