花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15、重组表达载体和应用

摘要

本发明公开了花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15，该启动子具有如SEQIDNO.31所示核苷酸序列，该启动子可调控目的基因特异表达于花药绒毡层，在水稻中POsABCG15调控水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15的表达，影响花药和花粉表面脂类积累，能够用于产生新的水稻雄性不育系或调控其他基因在绒毡层中表达，在农业生产上有重要作用。

说明书

 

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15，还涉及花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15的重组表达载体和应用。

背景技术

水稻（Oryza sativa）是主要粮食作物之一，全世界约有一半人口以稻米为主食。在我国，水稻播种面积为全国粮食作物播种面积的30%，而总产量却占粮食作物产量的42%以上，其重要原因就是水稻杂种优势的成功应用。Jones早在1926年就发现了水稻杂种优势现象。但水稻为自交结实作物，难以获得大量的、纯度高的杂交种，阻碍了水稻杂种优势利用的进程，直到1970年我国李必湖发现野败不育株。1973年“杂交水稻之父”袁隆平的研究团队，经过刻苦专研，实现了三系配套，1976年开始大面积推广杂交水稻，使水稻杂种优势成为现实。直到现在，不育系仍是水稻杂种优势利用的主要途径。

   目前，人们主要通过质核互作不育系（三系法）和温光敏不育系（两系法）来实现水稻的杂种优势。然而，由于质核互作不育系配组不自由，可利用的亲本有限，种子生产比两系法复杂，温光敏不育系的育性受自然温光条件影响，大面积制种风险大等原因，使得水稻的杂种优势无法通过这两种不育系得到充分体现。花药绒毡层特异表达启动子能够调控下游基因特异表达于花药绒毡层组织，而通过花药绒毡层特异表达相关基因能影响花药和花粉的发育获得雄性不育系。因此，急需一种花药绒毡层特异表达启动子，能够为利用基因工程手段获得雄性不育系和恢复系提供有力的工具。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15，该启动子调控目的基因特异表达于花药绒毡层，控制小孢子发育成可育花粉的相关基因的表达，能够用于产生新的水稻雄性不育系，在农业生产上有重要作用，技术方案为：

花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15，所述花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示。

本发明的目的之二在于提供花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15的重组表达载体，其技术方案为：

含有所述花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15的重组表达载体。

优选的，所述重组表达载体是在pCAMBIA130021载体GUS基因前载入花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15。

本发明的目的之三在于提供花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15的应用，技术方案为：

所述花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15在介导外源基因特异表达于花药绒毡层的应用。

进一步，所述外源基因为OsABCG15基因。

本发明的有益效果在于：本发明公开的花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15，该启动子调控目的基因特异表达于花药绒毡层，在水稻中调控水稻花药表皮和花粉壁脂类沉积基因OsABCG15表达，影响花药和花粉表面脂类积累，当表达受阻能够产生水稻雄性不育系；本发明还公开了花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15的重组表达载体，可以用作花药绒毡层特异表达基因的启动子，在重组表达载体的花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15调控下使下游基因定位于花药绒毡层表达，为植物基因工程领域研究基因在花药绒毡层特异表达提供了工具，具有广泛的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图l为本发明osabcg15突变体和正常的近等基因系II-32B花药和花粉形态学观察示意图（Sp表示染色花粉，Ac表示花药残渣）。

图2为本发明 OsABCG15座位定位和突变位点示意图。

图3为本发明花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15调控OsABCG15基因特异表达分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

术语“花药表皮和花粉壁脂类沉积的基因”指编码具有运输脂类到花药表皮和花粉壁的ABC-2型转运蛋白的核酸序列，碱基序列如SEQ ID NO.2中第1-2067位所示的核苷酸序列及其简并序列。简并序列是指，位于SEQ ID NO. 2序列的编码框第1-2067位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.2中第1-2067位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.1所述的序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.2中从核苷酸第1一2067位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.2中从核苷酸第1一2067位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的调控花药和花粉壁脂类积累的相同功能的蛋白的SEQ ID NO.2中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个（通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

术语“花药表皮和花粉壁脂类沉积的蛋白”指具有运输脂类到花药表皮和花粉壁的ABC-2型转运蛋白活性的、具有SEQ ID NO.1序列的多肽。该术语还包括具有与天然影响花药表皮和花粉壁脂类沉积的ABC-2型转运蛋白SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能；在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

术语“启动子”指为RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。在DNA指导下RNA的合成称为转录，转录的起始由DNA的启动子控制。

实施例中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本实施例的水稻花药表皮和花粉壁脂类转运相关多肽时，可以将该蛋白的编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成调控水稻花药表皮和花粉壁脂类转运相关蛋白的表达载体。

  相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本实施例所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

  除了用重组法产生之外，实施例中蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。可以分别化学合成本实施例蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

实施例1、osabcg15突变体植株的获得和形态学的观察

  籼稻缙恢1号突变体，命名为osabcg15突变体，由本实验室保存，用II-32B作轮回亲本，与osabcg15突变体杂交和隔代回交，最终将突变体保存下来，该不育材料同II-32B为一对近等基因系。osabcg15突变体与II-32B杂交，Fl代全部为可育，自交F2代中出现分离，其中正常植株为567，突变株为187，比例符合3:1(χ2 = 0.0071<χ0.05 = 3.84)，表明该雄性不育突变体表型由一个单核基因突变造成。对osabcg15突变体植株的形态学观察：II-32B稻穗结实后下垂(图1A左)，而osabcg15突变体小穗不结实呈直立状(图1A右)；II-32B花药包含成熟花粉呈现为黄色(图1B上)，osabcg15突变体花药为白色(图1B下)；II-32B花粉碘染为黑色(图1C上)，osabcg15突变花药中无花粉，在碘液中捣碎后只有花药残渣(图1C下)。

实施例2、OsABCG15基因的定位和克隆

一、定位群体

将osabcg15突变体与粳稻日本晴杂交，自交获得F2代，选择雄性不育植株为定位群体。

二、提取水稻DNA

亲本采用改进的CTAB法进行提取，包括如下步骤：取叶片0.1-0.2克(约半片)放到小研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉状，装入2m1离心管，加入700μL 100℃预热的 1.5×CTAB溶液于离心管中，小心混匀后放入65℃水浴，20分钟后取出离心管，加入等体积氯仿/异戊醇，猛烈混匀，13000rpm离心10分钟，取上清于新管中，加入900μL无水乙醇混匀后-20℃放半小时以上。将析出的DNA离心，14000rpm离心10分钟。去掉上清，将沉淀用1mL 体积分数为70%乙醇清洗一次，离心干燥，溶于200μL TE溶液中，4℃冰箱保存。定位群体的单株DNA采用改进的碱煮法提取，包括如下步骤：剪碎嫩叶片1-2cm²放入0.5m1离心管，加入100μL浓度为0.125M的 NaOH溶液，沸水浴30秒，然后加入50μL浓度为1.0M 的Tris-HCl（pH8.0），最后加入100μL浓度为0.125M的HCl，沸水浴2分钟后4℃冰箱保存备用。

三、群体分离分析初定位

设计137对多态性标记，其中包括42对SSR引物和95对InDel分子标记引物。其中SSR引物根据已发表的序列合成(具体参见http://www.gramene.org.microsat/ssr.html)，其他InDel分子标记设计是根据比较粳稻日本晴和籼稻9311两品系的已公布的核酸序列，对差异的部分设计引物，验证2个亲本粳稻日本晴和籼稻osabcg15突变体之间的多态性。将设计的137对引物分别扩增水稻雄性不育植株和水稻亲本基因组DNA，PCR扩增程序为：10μL体系中，lμL模板，lμL 10pmol/μL 上游引物，lμL10pmol/μL下游引物，lμL 10×Buffer (Mg^2十)，lμL 2mM dNTP，0. lμL Taq，3.9μL水；PCR产物用质量体积分数为10%的PAGE胶电泳，银染方法检测。结果显示，137对标记进行扩增反应，Chr6Ind（-37-1）引物（如表1所示）对亲本与F2代选择雄性不育植株存在差异，表明6号染色体上的标记Chr6Ind（-37-1）与OsABCG15基因座位有明显的连锁关系。

四、精细定位

用不育单株对6号染色体上的标记Chr6Ind（-37-1）附近有差异SSR标记进行验证，发现RM3628引物对（如表1所示）和RM5371引物对（如表1所示）分别有6个和38个的重组子而且重组子不相互包含，这说明OsABCG15基因座位应位于RM3628和RM5371两个分子标记之间。为了对OsABCG15基因进一步精细定位，将用于定位的突变株扩大到近2157株，又在RM3628和RM5371间设计了20对SSR引物，6对InDel引物和23对STS引物，20对SSR引物中RM20356、RM20361、RM20366 、RM275和RM275引物对存在差异，6对InDel 引物中Chr6Ind(-30) 、Chr6Ind(-7)和Chr6Ind(4)引物对存在差异，23对STS引物中Chr6STS20、Chr6STS13和Chr6STS15引物对存在差异。用有差异的引物对定位群体进行分析，最终将OsABCG15基因定位在Chr6Ind（-30）和Chr6STS13之间，如图2A所示。经分析表明，该区域只包含1个编码基因，该基因编码ABC-2型转运蛋白，编码该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，与拟南芥雄性不育基因WBC27同源，通过对该基因的两次测序，发现OsABCG15突变体在该基因的第4个外显子处发生一个碱基的替换(A变为C)，如图2B所示。基因定位所用标记的序列如表1所示。

表1 基因定位分子标记及其引物序列

引物名称上游引物(5’→3’)下游引物(5’→3’)RM36285’-aatcatgcctagagcatcgg-3’（SEQ ID NO.3）5’-gttcaacatgggtgcagatg-3’（SEQ ID NO.4）RM203565’-ttaccaggcttcctctcttgacc-3’（SEQ ID NO.5）5’-ccacgtcacccagaaactaatcc-3’（SEQ ID NO.6）RM203615’-cttgaaatttgtgcggaggttgc-3’（SEQ ID NO.7）5’-gatgtcaccatcacggagaattagg-3’（SEQ ID NO.8）Chr6Ind(-30)5’-gcttccataactacaaggc-3’（SEQ ID NO.9）5’-atctcgtataacaaactcacaa-3’（SEQ ID NO.10）Chr6Ind(4)5’-cgatattactaccaggattt-3’（SEQ ID NO.11）5’-attgccaaccaactaact-3’（SEQ ID NO.12）Chr6STS205’-aaaatggtgggtcatacgg-3’（SEQ ID NO.13）5’-gggtcctgggtagcgaaa-3’（SEQ ID NO.14）Chr6STS155’-gctccgtgaccaagtatgt-3’（SEQ ID NO.15）5’-gaggaagaagaagagggtgt-3’（SEQ ID NO.16）Chr6STS135’-cgatgagatggttgggagc-3’（SEQ ID NO.17）5’-tgcgggcaggagatttgg-3’（SEQ ID NO.18）Chr6Ind(-7)5’-acacgaggcttctagtgat-3’（SEQ ID NO.19）5’-attgattgttcctaaccaa-3’（SEQ ID NO.20）RM203665’-caggtaaagcgatgagcaattcg-3’（SEQ ID NO.21）5’-aaggagttggcaacagcgaagg-3’（SEQ ID NO.22）RM2755’-cctcaacatcctcacacacaagc-3’（SEQ ID NO.23）5’-gccaatcggatgtgatttatgc-3’（SEQ ID NO.24）Chr6Ind(-37-1)5’-atgtcctaagggtctgt-3’（SEQ ID NO.25）5’-agtggctacatttagtttg-3’（SEQ ID NO.26）RM59575’-actgctgcactgcacaagac-3’（SEQ ID NO.27）5’-agctagctaggcgtgagctg-3’（SEQ ID NO.28）RM53715’-ggctagctttagctgcgttg-3’（SEQ ID NO.29）5’-acccagatcgaaacaactgc-3’（SEQ ID NO.30）

实施例3、花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15分析

分析发现，位于精细定位的OsABCG15基因上游2034bp具有RNA聚合酶识别位点，核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，命名为花药绒毡层特异表达启动子，简称POsABCG15。根据如SEQ ID NO.31所示序列设计引物，上游引物为POsABCG15F:5'-gacaagcttcgaaatgctcggttatatg-3’(SEQ ID NO.32)，下划线为Hind Ⅲ酶切位点；下游引物为POsABCG15 R：5'-gctctagactcctccaagagacacag-3’ (SEQ ID NO.33)，下划线为XbaⅠ酶切位点，用PCR进行扩增，PCR反应条件为：95℃预变性3分钟；94℃变性45秒，61℃退火45秒，72℃延伸2分钟，28个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收含花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15的2051bp大小的片段，用Hind Ⅲ和XbaⅠ同时酶切花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15 PCR扩增片段和pCAMBIA130021载体并回收花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15和pCAMBIA130021载体骨架，将回收的花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15与pCAMBIA130021载体骨架连接，使POsABCG15启动子载入pCAMBIA130021载体的GUS基因之前，得含有花药绒毡层特异表达启动子POsABCG15的重组表达载体，命名为：POsABCG15:GUS载体。将POsABCG15:GUS载体转化农杆菌LBA4404感受态细胞，获得含有POsABCG15:GUS载体的LBA4404，命名为LBA4404：POsABCG15:GUS。将LBA4404：POsABCG15:GUS侵染水稻愈伤，获得转基因水稻。通过B-半乳糖苷酶（GUS）的活性分析POsABCG15的表达模式，取不同发育阶段的转基因水稻根、茎、叶和花，通过GUS染色液染色，染色后的组织用75%的乙醇脱色处理，将脱色处理的材料放入FAA固定液中固定，脱水，渗透和石蜡包埋等处理，通过切片(l0um厚)观察，结果显示GUS染液呈蓝色组织为花药绒毡层，表明了分离获得的位于OsABCG15基因上游2034bp核苷酸具有启动子活性，并且能够调控下游基因特异表达于花药绒毡层，因此为花药绒毡层特异表达启动子。

原位杂交检测POsABCG15下游OsABCG15基因的表达组织，原位杂交使用探针合成为：以水稻cDNA为模板，上游引物为OsABCG15IF: 5'-agtaatacgactcactatagggacggccacctgacctac-3’(SEQ ID NO.34)，下游引物为OsABCG15IR: 5'-agatttaggtgacactatagaacagcacccaaaccaaca-3’(SEQ ID NO.35)，进行PCR扩增，扩增时用地高辛进行标记，制得原位杂交用探针。原位杂交使用罗氏（Roche）公司地高辛核糖核酸标记试剂盒（DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7))和地高辛核酸检测试剂盒(DIG Nucleic Acid Detection Kit)，具体步骤按照试剂盒说明书进行，其中原位杂交结果如图3所示，结果表明OsABCG15基因表达于花药绒毡层，同样证明了位于OsABCG15基因上游2034bp核苷酸具有启动子活性，并且能够调控下游OsABCG15基因特异表达于花药绒毡层，为花药绒毡层特异表达启动子。

本发明不限于使用pCAMBIA130021载体，也可以使用其他可接受载体；构建的POsABCG15:GUS载体可以作为其他基因的表达载体，将目的基因连接在POsABCG15下游，替换POsABCG15:GUS载体中的GUS基因即可在花药绒毡层中特异表达。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。