一种检测DMD基因外显子缺失和/或重复的方法

摘要

本发明涉及一种检测DMD基因外显子缺失和/或重复方法，所述方法利用现在DMD基因的序列信息设计探针，将捕获富集获得的DNA片段进行测序，通过分析获得DMD基因外显子缺失信息。

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及DMD基因的分析及其方法。 

背景技术

DMD基因是迄今为止发现的最大的人基因，该基因有时会发生突变，例如新生男婴中1∶3500出现该基因的突变。DMD基因内一个或多个外显子的大片段会发生缺失，涉及基因近端和中部两个热点区域(外显子3-7和外显子44-55)。DMD基因内一个或多个外显子的大片段会发生重复，约占DMD突变的6％。DMD基因发生更多的是点突变、小片段的缺失和插入。 

目前，DMD基因的检测方法主要有以下几种：微阵列比较基因组杂交技术(a-CGH)、MLPA、MAPH、SCAIP、多重PCR、DNA印迹、Sanger测序法和第二代测序技术。对于高通量检测DMD基因外显子缺失和重复而言，上述这些检测方法的缺点是通量低、效率差。所以，本领域中需要新的高通量检测DMD基因外显子缺失和重复的方法。 

发明内容

本发明涉及一种检测DMD基因外显子缺失和/或重复方法，所述方法利用现在DMD基因的序列信息设计探针，将捕获富集获得的DNA片段进行测序，通过分析获得DMD基因外显子缺失信息。 

本发明提供了一种检测DMD基因外显子缺失和/或重复的方法，包括步骤： 

1)将从待测样品和正常对照样品提取基因组DNA分别打断为双链DNA片段，并在所述双链DNA片段的两端添加接头序列； 

2)以第一引物和第二引物扩增所述带有接头的双链DNA片段，获得第一扩增产物； 

3)将所述第一扩增产物变性后，用核酸芯片进行杂交捕获； 

4)以第三引物和第四引物扩增所捕获的核酸，获得第二扩增产物； 

5)对上述第二扩增产物进行测序，获得测序序列片段； 

6)将所述测序序列片段比对到参考DMD基因的外显子序列及外显子侧翼上； 

7)通过比较待测样品和正常对照样品比对结果确定所述待测样品DMD基因的外显子是否有重复和/或缺失，即如果比对到所述基因外显子参考序列上的所述待测样品测序序列显著多于/少于所述正常对照样品测序序列，表示所述基因的外显子是否有重复和/或缺失。 

本发明的方法结合序列捕获技术、高通量测序和生物信息分析对DMD基因进行检测。这三种技术的结合是一种非常有效的DMD基因缺失和/或重复的检测策略。 

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。 

图1显示了用于确定本发明的设截止值的正态分布图。 

图2显示了实施例中的实验上机条件。 

具体实施方式

以下实施更详细的描述了本发明，这些实施例仅为示例性的，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。 

利用目标区域捕获技术，使用外显子捕获芯片对人DMD基因的外显子测序，进而开展DMD基因外显子缺失和重复突变相关研究，目前还是一项新技术。该技术的基本原理是使用一套寡核苷酸探针来捕获基因组上的目标序列，然后使用根据DMD基因基因区序列和/或所述接头序列设计的引物对这些捕获到的序列进行PCR扩增，再对这些扩增产物进行高通量测序，从而识别DNA样品中的碱基序列，通过生物信息分析方法对测序所得序列信息进行分析，从而找到目标序列的变异信息，包括单核苷酸变异、插入/缺失、重复、外显子拷贝数变化等。 

本发明提供了一种检测DMD基因外显子缺失和/或重复的方法，包括步骤： 

1)将从待测样品和正常对照样品提取基因组DNA分别打断为双链DNA片段，并在所述双链DNA片段的两端添加接头序列； 

2)以第一引物和第二引物扩增所述带有接头的双链DNA片段，获得第一扩增产物； 

3)将所述第一扩增产物变性后，用核酸芯片进行杂交捕获； 

4)以第三引物和第四引物扩增所捕获的核酸，获得第二扩增产物； 

5)对上述第二扩增产物进行测序，获得测序序列片段； 

6)将所述测序序列片段比对到参考DMD基因的外显子序列及外显子侧翼上； 

7)通过比较待测样品和正常对照样品比对结果确定所述待测样品DMD基因的外显子是否有重复和/或缺失，即如果比对到所述基因外显子参考序列上的所述待测样品测序序列显著多于/少于所述正常对照样品测序序列，表示所述基因的外显子是否有重复和/或缺失。 

在本发明的方法步骤1)中，经打断后的所述双链DNA优选为100-1000bp，更优选在150-500bp，最优选在200-300bp，特别是在200-250bp，上述长度表示为双链DNA电泳的主带位置。 

在本发明的方法步骤1)中，所述双链DNA经打断后优选具有平末端，例如通过末端修复造成所述平末端。在另一优选例中，还包括步骤：在所述平末端双链DNA片段的3’端加“A”，所述3’端加“A”的双链DNA片段与带有一个“T”的接头相连，成为两端都带有接头的双链的DNA片段混合物。所述接头序列长度优选是20-150nt，特别是50-100nt。本领域技术人员可以根据序列选择合适的接头序列，也可以市售的试剂盒中常用的序列作为接头序列。 

在本发明的方法步骤1)中，优选所述双链的DNA片段两末端通过接头连接序列与接头序列连接。在另一优选例中，所述接头连接序列为poly(N)_n，其中，各个N分别独立地选自A、T、G或C，n为选自1-20的任一正整数。在另一优选例中，所述的接头连接序列为poly(A)_n，其中，n为1-20的正整数，较佳地n＝1-2。在另一优选例中，所述的接头连接互补区序列为poly(N’)_m，其中各N’分别独立地选自A、T、G或C，m为1-20的正整数，并且poly(N)_n和poly(N’)_m为互补序列。在另一优选例中，m为选自1-3的任一正整数。在另一优选例中，所述的接头连接互补区的长度与接头连接序列的长度相同，即poly(N)_n和poly(N’)_m为完全互补序列。在另一优选例中，所述的接头连接互补区为poly(T)_m，其中，m为1-20的正整数，较佳地m＝1-2。本领域技术人员可以根据序列选择合适的接头连接序列，也可以市售的试剂盒中常用的序列作为接头连接序列。 

在本发明的方法步骤2)中，优选所述第一引物和第二引物根据DMD基因的基因区序列和/或所述接头序列设计。在一个优选例中，所述的第一引物和第二引物具有对应于所述接头的引物结合区的接头结合区，以及位于接头结合区外侧的测序探针结合区。在另一优选例中，所述的第一引物和第二引物为长度30-80bp的寡核苷酸。在另一优选例中，第一引物和第二引物长度为55-65bp。在另一优选例中，所述的第一引物和第二引物是不同的。 

在本发明的方法步骤3)中，本发明使用的芯片可以通过以下方式进行设计：通 过微阵列技术，将高密度DNA片段阵列以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测，捕获目标序列。例如，芯片可以由美国Roche NimbleGen公司设计合成。 

在本发明的方法步骤3)中，优选所述的核酸芯片固定有5-200,000种对应于所述DMD基因的特异性探针。在另一优选例中，所述芯片上特异性探针的种类为50-150,000种，更佳地500-100,000种，最佳地5000-80,000种。在另一优选例中，所述探针的序列对应于DMD基因的以下区域：外显子和/或外显子前后两端优选50-500nt，更优选100-300nt，最优选200nt。在另一优选例中，所述特异性探针的长度为20-120mer，较佳地，50-100mer，更佳地，60-80mer。在另一优选例中，所述特异性探针为全人工合成或体外克隆合成。 

在本发明的方法步骤3)后，优选包括步骤：用封闭分子封闭位于所述扩增产物两端的、对应于第一引物和第二引物的区域，从而获得两端被封闭的单链扩增产物的混合物，用所述的经封闭的单链扩增产物的混合物进行后续步骤4)。在另一优选例中，所述的封闭分子封闭第一PCR扩增产物中对应于第一引物和第二引物的70％-100％区域。在另一优选例中，所述的封闭分子封闭第一PCR扩增产物中对应于第一引物和第二引物的100％区域。 

在本发明的方法步骤4)中，优选所述第三引物和第四引物根据DMD基因的基因区序列和/或所述接头序列设计。在一个优选例中，所述第三引物和第四引物分别特异性对应于或结合于所述的第一引物和第二引物。在另一优选例中，所述的第三引物和第四引物分别特异性结合于所述的第一引物和第二引物的外侧，并且长度小于第一引物和第二引物。在另一优选例中，所述的第三引物和第四引物长度为15-40bp，较佳地为20-25bp。在另一优选例中，所述的第三引物和第四引物是不同的。 

在本发明的方法步骤5)中，所述测序优选采用第二代测序技术，例如illumina solexa、Hiseq 2000、ABI SOLiD、Roche 454测序平台和/或Ion torrent。在另一优选例中，将所述的第二扩增产物的混合物与固相载体上固定的测序探针进行杂交，并进行固相桥式PCR扩增，形成测序簇；然后对所述测序簇用“边合成-边测序”法进行测序，从而得到样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列。目前，有一些生物技术服务公司可提供测序服务。 

在本发明的方法步骤6)中，将所述测序序列比对到参考DMD基因外显子序列及外显子侧翼上可以通过本领域中已知的软件进行，例如短寡核苷酸分析包(Short  Oligonucleotide Analysis Package，SOAP)比对和BWA(Burrows-Wheeler Aligner)比对；所述侧翼长度优选为50-500nt，更优选100-300nt，最优选200nt。 

在本发明的方法步骤6)后，可以先对测序结果原始测序序列质控，去除不合格的测序序列，其中原始read质控包括的项目见下表； 

在本发明的方法步骤7)中，通过对测序结果进行生物信息学分析方法，可以判断待测者DMD基因发生突变的外显子与正常人之间是否具有统计学上的显著性差异。在一优选例中，可以通过适当的计算机语言进行深度计算，例如java、C++或Perl。 

在一优选例中，比较待测样品和正常对照样品比对结果的步骤如下： 

第一步： 

对于每个DMD基因外显子，将待测样品比对到该外显子上的测序序列数目相对于比对到全部外显子的测序序列数目标准化，获得标准化的待测样品测序序列数目比值， 

将对照样品比对到该外显子上的测序序列数目相对于比对到全部外显子的测序序列数目标准化，获得标准化的对照样品测序序列数目比值； 

第二步： 

对所述标准化的待测样品测序序列数目比值和标准化的对照样品测序序列数目比值进行比较，如果它们在统计学上差异显著，则 

当所述标准化的待测样品测序序列数目比值小于标准化的对照样品测序序列数目比值时，将所述标准化的待测样品测序序列数目比值乘以2后和标准化的对照样品测序序列数目比值进行比较，如果它们在统计学上差异显著，表示该外显子没有发生杂合缺失， 

当所述标准化的待测样品测序序列数目比值大于标准化的对照样品测序序列数目比值时，将所述标准化的待测样品测序序列数目比值除以2后和标准化的对照样品测序序列数目比值进行比较，如果它们在统计学上差异显著，表示该外显子没有发生杂合缺失。 

通过这两步计算方法，可以确定DMD基因的外显子拷贝数的变化，从而判断是 否发生了重复和/或缺失。 

在又一优选例中，比较待测样品和正常对照样品比对结果的步骤如下： 

a.对于DMD基因的一个外显子，通过式①计算待测样品比对到该外显子上的测序序列的测序深度exonN_depth和比对到全部外显子上的测序序列的平均测序深度averaged_depth的比值％exonN； 

将％exonN代入式②，计算出所述外显子测序深度的Z-score， 

$\%\mathrm{exonN}=\frac{\mathrm{exonN}\_\mathrm{depth}}{\mathrm{averaged}\_\mathrm{depth}}$...........................①， 

$\mathrm{exonN}\_Z-\mathrm{score}\_\mathrm{for}\_\mathrm{test}\_\mathrm{sample}=\frac{|\%\mathrm{exonN}-\mathrm{mean}\%\mathrm{exonN}\left(\mathrm{normal}\right)|}{S.D.\%\mathrm{exonN}\left(\mathrm{normal}\right)}$...②； 

其中，对于所述外显子，利用对照样品比对到该外显子上的测序序列的测序深度和比对到全部外显子上的测序序列的平均测序深度，根据式①计算％exonN(normal)，mean％exonN(normal)是所有对照样品％exonN(normal)的平均值，S.D.％exonN(normal)是所有对照样品％exonN(normal)的标准差；如果Z-score大于第一预设截止值，则该DMD基因外显子的测序深度在待测样品和正常样品之间有差异显著，对其进行进一步筛选； 

b.分两种情况对上述测序深度差异显著的DMD基因外显子进行筛选： 

当exonN小于averaged_depth值时，将％exonN乘以2代入式②中，计算得到的Z-score值小于第二预设截止值表示该外显子发生了杂合缺失，计算得到的Z-score值大于第二预设截止值表示该外显子没有发生杂合缺失； 

当exonN大于averaged_depth值时，将％exonN除以2代入式②中，计算得到的Z-score值小于第三预设截止值表示该外显子发生了重复，计算得到的Z-score值大于第三预设截止值表示该外显子没有发生杂合缺失。 

通过这两步计算方法，可以确定DMD基因的外显子拷贝数的变化，从而判断是否发生了重复和/或缺失。 

对于上述步骤a和b中的第一预设截止值、第二预设截止值和第三预设截止值相同或不同。截止值的选取由发明人在进行大量实验后依据统计理论确定，具体如下： 

在进行实验的案例中，发明人发现利用本发明方法得到的Z值(Z scores)符合统计学上的正态分布图，见附图1。对于确定所述待测样品DMD基因的外显子是否有重复和/或缺失的第一步，当Z值为3.0的时候，有99.9％的可信度----DMD女性携 带者与正常人在相同外显子的拷贝数是不一样的。对于第二步，为了排除第一步中的假阳性，如果女性携带者缺失拷贝，那么她的二倍应该和正常人(正常人应该是两倍)没有显著差异，所以要乘以2后进行检测。同理，重复拷贝的情况也一样。 

虽然在本发明实施例中使用了截止值3.0，截止值也可以大于3.0或小于3.0。例如，可以使用截止值1.64(对应90％的可信度)、1.96(对应95％的可信度)或2.58(对应99％的可信度)，可能性百分数越大，可信度越高。本领域一般采用90％以上的可信度，即截止值至少要在1.64以上。 

在本发明中，基因突变包括拷贝数变异(CNV)。 

由于DMD基因位于X染色体上，所以本发明的方法特别适用于发生DMD基因外显子杂合缺失的女性。 

因此，本领域技术人员可以理解，本发明的突变检测方法可以用于基于检测DMD基因的突变。 

在本发明中，进行PCR所用的探针、引物可以基于目前固相芯片杂交技术进行设计，也可以由生物技术服务公司进行。本领域技术人员可以理解，在同一张芯片上以高特异性和高覆盖率捕获DMD基因区域。例如，罗氏NimbleGen的2.1M人外显子序列捕获芯片可捕获约18万个外显子和约550个miRNA。 

利用本发明方法得到DMD基因外显子缺失和重复信息可以用于例如对人群进行基因分型。 

在本发明的实施方案中，采用本发明的结合序列捕获技术、高通量测序和生物信息分析的方法，对DNA样本的DMD基因进行检测，获得样本中DMD基因的突变信息。 

在本发明中，测序序列、测序序列片断、读段都是指测序仪产生的数据DNA序列(read)。测序深度是指读段数。 

实施例

如本实施例所用，术语“引物”指的是能与模板互补配对，在DNA聚合酶的作用合成与模板互补的DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互 补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。 

在本实施例中，几类重要引物的序列和名称见表1。 

表1 

第一引物(SEQ ID NO.1)和第二引物(SEQ ID NO.2)对带有接头的DNA双链核酸片段进行扩增，获得第一PCR扩增产物，第一引物和第二引物具有对应于所述接头的引物结合区的接头结合区，并且位于接头结合区外侧的测序探针结合区。封闭分子1(SEQ ID NO.3)和封闭分子2(SEQ ID NO.4)的作用是在进行序列捕获时，与接头互补，避免捕获非特异性序列。第三引物(SEQ ID NO.5)和第四引物(SEQ ID NO.6)的作用是大量扩增捕获的特异性DNA片段，以便进行下一步测序。 

本研究募集1名DMD女性携带者和4名女性正常人，签署书面的知情同意书。 

根据罗氏NimbleGen的说明书进行芯片制备和杂交，根据Illumina的说明书进 行测序，步骤如下。 

1：芯片设计 

参考序列为NCBI build 37/hg19(获自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的DMD基因外显子序列及外显子前后200bp，由美国Roche NimbleGen公司设计合成。 

2：文库制备 

取人的外周血，提取基因组DNA，获得3μg DNA。将抽提获得的人基因组DNA样品，在Covaris S2仪器(购自美国Covaris公司)上进行片段化，最终打断成为主带在200bp的DNA双链片段的混合物。 

接下来，对上述片段进行纯化，纯化过程采用Ampure Beads方法，按照Agencourt AMPure protocol进行(美国Beckman公司)。简而言之：将DNA片段进行末端修复，成为带有平末端的片段混合物，并在每一条单链的3′端添加一个“A”；然后在接头连接反应体系(PE文库)中按照试剂盒内的说明书进行连接，通过此过程为DNA片段加上带有“T”的接头；在连接后继续按照Agencourt AMPure protocol(美国Beckman公司)进行纯化，并除多余试剂如缓冲物、酶、ATP等，最终得到连有接头的DNA。 

由于连有接头的DNA样品浓度很低，接下来进行扩增富集，PCR反应在Bio-Rad公司的PTC-200PCR仪上运行(PCR反应体系：98℃，30s；98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共扩增4-10个循环；最终72℃延伸5min)。 

50μL PCR扩增反应反应体系含有：25μL 2x Phusion HF Master Mix、1μL第一引物(SEQ ID NO.1)、1μL第二引物(SEQ ID NO.2)、23μL连接接头后的样品DNA(buffer和taq酶的购自sequenom公司)。 

经扩增的DNA都带有接头，使用Ampure beads法，按照Agencourt AMPure protocol的程序(美国Beckman公司)纯化PCR产物。 

反应完成后的纯化产物可在4℃保存数天，也可在-20℃保存数周，也可直接用于后续的序列捕获。 

3：序列捕获 

将准备好的DNA样品置于SpeedVac中60℃蒸干，然后加入11.2μL的超纯水，充分溶解。全速离心样品30秒，分别加入以下两种试剂：18.5μL的2×SC Hybridiation Buffer(购于美国Roche NimbleGen公司)和7.3μL的1×SC Hybridiation Component A(购于美国Roche NimbleGen公司)。震荡混匀后置于离心机上全速离心30秒，然后于95℃使DNA充分变性，变性过程10分钟，得到单链的带有接头的DNA文库。 

按照Roche NimbleGen的试剂盒说明书，将带有相应探针的芯片按要求固定在杂交仪(美国Roche NimbleGen公司)上，将变性后的样品加入芯片中并封闭芯片，然后设定杂交程序，于42℃在严格的条件下杂交64-72小时。在杂交体系中，基因芯片上探针分子的浓度要远远高于靶分子浓度。34μl的杂交反应体系含：300μgCot-1DNA、1μg DNA文库(步骤1中制备获得)、1μL封闭分子1(SEQ ID NO.3)、1μL封闭分子2(SEQ ID NO.4)。其中Cot-1DNA通过Human Cot-1 -Fluorometric QC(Invitrogen)按照提供商说明书获取。 

待杂交完毕后，将芯片洗涤与样品按以下次序洗脱： 

将NaOH洗脱液回收，并用32μL的20％冰醋酸中和；将上述中和液用Qiagen MinElute PCR Purification Kit纯化，捕获后的样品最后溶解于138μL纯水中。 

对上述捕获的DNA文库进行PCR扩增。反应条件是：98℃30s；15个循环(98℃15s；60℃30s；72℃30s)；72℃5min；4℃静置。所述扩增分为6管50μL进行： 

PCR产物采用Ampure Beads方法，按照Agencourt AMPure protocol进行(美国Beckman公司)进行纯化，完成后溶于50ul EB中，使用NanoDrop及Bioanalyzer 2100 检测浓度。 

4：以接头介导的PCR(LM-PCR)扩增产物和实时荧光定量PCR(QPCR)进行检测富集度： 

依照美国Roche NimbleGen公司的NSC Assay mix试剂盒内提供说明书进行以下步骤： 

1)将稀释好的4种NSC Assay mix取出在冰上溶解。 

2)根据之前Nanodrop检测浓度，将未捕获的(Non-Captured)以及成功捕获的(Captured LM-PCR)产物稀释至1ng/ul，最后体积要求＞12ul。 

3)按照每个样品4种NSC Assay，每个样品包括2种DNA模版，每个样品需要4*2＝8个反应，每个平板需要1个阴性对照共4个反应。96孔平板最多能进行11个样品检测。 

4)在1.5ml的离心管中配制QPCR反应混合液，一下为每个反应试剂使用量，可以根据具体样品量统一配置混合液，需要将阴性对照和阳性对照纳入计算。 

5)将配置好的12ul QPCR反应混合液转移至96孔QPCR反应板中，向其中加入3ul稀释的1ng/ul LM-PCR产物，把所有的试剂和样品加完后使用封口膜将平板封口。以4000rpm离心2min。 

6)将96孔板置于QPCR仪上，按照下表2所示程序进行检测 

表2 

7)实验完成后分析试验结果，整理QPCR试验数据，利用Ct值的差ΔCt计算富集度E＝(ef)^ΔCt，其中ef代表目的基因的Q-PCR扩增效率，理想的扩增效率ef值为2。其中为了计算ΔCt，Non-capture Ct是指以杂交前的N-LM-PCR纯化产物为模板、用目的基因特异性引物来进行Q-PCR扩增，检测到的Ct值；capture Ct是指以杂交后的C-LM-PCR纯化产物为模板、用目的基因特异性引物来进行Q-PCR扩增，检测到的Ct值。见下表： 

判断文库是否合格，能否进行下一步试验：需要根据平均富集倍数值判断之后建库类型，在本实施例中平均富集倍数＞60进行下一步测序。 

5：测序与数据分析 

在一张芯片上进行杂交反应，样品在芯片上杂交的64-72小时中，目标序列与探针互补，从而被捕获下来。将洗脱后的样品于Solexa测序平台中进行双末端测序。通过数据分析测序数据的样品来源，并对样品的捕获效果进行计算。 

使用BWA软件将所有泳道中的读段先比对到参考序列NCBI build 37/hg19(获自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的DMD基因外显子序列及外显子前后200bp上去。比对的输入是过滤接头等污染后的fq文件，比对的输出是原始比对结果——SAM文件。使用samtools工具对原始结果需要进行一系列处理：经过格式转换和压缩之后，将比对结果按染色体序列进行排序。其次，将同一个文库的泳道合并到一起，最后再将所有文库合并到一起。经过这一系列处理，得到了合格的能作为突变检测软件SOAPsnp(soap.genomics.org.cn/soapsnp.html)的输入文件——BAM格式文件，即进入突变检测软件的接口。 

通过对落在每个外显子上的读段数和所有外显子上的读段数，计算出各个外显子深度以及平均深度，代入式①计算出％exonN。以余下4名女性非携带者为参考，将mean％exonN(normal)和S.D.％exonN(normal)代入公式②计算出Z-score。计算发现，该携带者在10、11、15、23、26、29、46-51、70、71、和73号外显子Z-score分别为：3.80、3.23、4.33、3.72、6.16、5.09、7.04、9.08、6.81、10.10、26.95、8.51、4.36、3.65、和3.24，均大于截止值3.00。接着，进行第二步计算，得到的结果分别为19.60、11.26、24.77、12.50、37.55、33.79、0.85、0.32、0.49、0.63、1.01、1.52、60.62、22.32、和11.30，其中0.85、0.32、0.49、0.63、1.01、1.52所对应的外显子46-51均小于3.0。因此，利用本发明的方法表明，该携带者在46-51号外显子有缺失现象。 

如下，为了验证本发明的结果，通过实时荧光定量PCR，检测分析该携带者46-51号外显子拷贝数。实验步骤如下： 

设计好引物后，对1名DMD女性携带者和4名女性正常人的样本进行qPCR上 机扩增。反应体系为： 

预先配置母液 

  10×Buffer   1.0ul   MGSO4   0.1ul   Tween20 100×   0.1ul   DMSO   0.5ul   H2O   3.35ul   Betaine   2.0ul

取以上提前配置好的母液加以下成分 

配制2.0ml的反应体系： 

  dNTP(2.5mM)   0.8ul   Eva Green   0.5ul   ROX   0.2ul   上游Primer   0.2ul   下游Primer   0.2ul   HS Taq   0.1ul

实验上机条件见图2。 

试验后将QPCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，通过对扩增条带的观测，发现DMD女性携带者在46-51号外显子有缺失，而4名女性正常人在46-51号外显子没有缺失。 

因此，通过本发明的外显子计算得到的结果与实时荧光定量PCR的结果是一致的，说明本发明的方法是可行的。