西门塔尔牛蜘蛛腿综合征致病位点荧光自动化检测方法

摘要

本发明涉及一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合征致病位点荧光自动化检测分析方法，PCR扩增用引物，其核苷酸序列如下：5’-CTGAGTCTCCTCTTCTGTTTTCA-3’，5’-GTTGGCATCTGAGTCCAGGT-3’。本发明利用荧光标记引物PCR扩增和电泳分型技术，对西门塔尔牛AS致病位点进行分型的试剂盒结果稳定，成本低，准确可靠，对西门塔尔牛AS致病位点可以进行准确的分型。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合 征(AS)致病位点荧光标记引物PCR检测方法。

背景技术

家畜遗传缺陷多呈现隐性遗传模式的原因可能与家畜的生产方 式不无关系，尤其是奶牛。人工授精(Artificial Insemination，AI)及 精液低温冻存技术(Semen Cryopreservation Techniques)在奶牛生产 繁育中的应用，为奶牛的人工授精育种体系(AI breeding system)的 建立奠定了坚实基础。公牛因AI技术可承担更多母畜配种任务，因 而可以被广泛应用于群体当中，获得大量后代，使得高产的基因在群 体中迅速传播。精液低温保存技术使优秀种用公牛不受时间和地域限 制，实现全球范围内遗传物质的交流(张沅，2001)。经严格遗传评 定的验证公牛(Tested Bulls)在奶牛遗传改良中发挥巨大的推动作用。

人工授精技术的广泛应用使全世界种质资源交换日益频繁。对种 公牛的高强度选择，使奶牛基因库缩小，群体平均近交系数大大增加。 有研究表明，美国荷斯坦牛的群体近交系数以每年0.1％的速度持续 增长，2004年出生的母牛平均群体近交系数高达5.0％(Hansen等， 2005)。近交导致群体有效大小减小，一些不利基因的纯和，尤其是 隐性基因控制的遗传缺陷，由于携带者表现正常，不易通过常规临床 检测方法检出，致病基因“潜伏”在群体中很难被剔除。只有当群体中 隐性突变基因频率达到一定程度时，临床阳性的个体大量出现，带来 不利影响和经济损失。如荷斯坦牛的Weaver综合征(单雪松等， 2006)、白细胞粘附缺陷病(Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency， BLAD)(孙艺等，2006)、脊椎畸形综合征(Complex Vertebral  Malformation，CVM)(Chu等，2008)等。因而，寻找隐性缺陷病的 致病突变，对致病突变建立准确快速的分子检测方法，注重对有害基 因的识别与淘汰是奶牛育种工作的重要任务之一。

综上所述，动物遗传缺陷的致病基因研究是遗传学的重要组成部 分。在家畜育种工作中，建立快速有效的动物遗传缺陷致病位点的分 子检测方法，对种用动物、进口的遗传种质、甚至某些发病群体全群 进行致病位点检测，对携带致病基因的个体进行标记或淘汰，降低遗 传缺陷在动物群体中的传播与蔓延带来的经济损失。

自1975年，Rieck和Schade首次报道了德系西门塔尔牛群体中 出现的一种新的犊牛先天畸形，并定名为牛蜘蛛腿综合征(AS)。 Buitkamp等(2008)年报道了自2004年-2007年，绝迹三十多年的 AS病例又在西门塔尔牛中重新出现，并且相继报道了大量的病例； 系谱分析及后期测交试验证实了该病在德系西门塔尔牛群体中是属 于常染色体单位点控制的隐性遗传缺陷。Buitkamp等(2009)将德 系西门塔尔牛AS致病基因定位于BTA23。Buitkamp等(2011)年对 AS的精细定位及群体检测证实MOCS1基因c.1224_1225delCA突变 为西门塔尔牛AS的致病突变。但是，到目前为止，还没有一种适合 商业操作的西门塔尔牛AS致病位点快速准确的检测方法。本发明需 要解决的问题既根据目前的研究进展，设计一种快速准备，成本低廉 的检测方法，以进行商业化试剂盒的生产。

商业化遗传病检测试剂盒的生产对我国的畜牧业蓬勃发展意义 重大。随着中国奶牛杂交生产以及肉牛改良工作的开展，大量从国外， 包括德国在内，引进西门塔尔优秀种公牛和公牛冻精，其中存在AS 携带者。为了防患于未然，杜绝AS疾病给我国牛业带来不必要的损 失，早发现、早淘汰是最好的途径。通过研究建立快速准确的携带者 分子检测平台，完善我国牛遗传缺陷数据库，同时结合系谱分析，对 引进西门塔尔牛以及现有群体中携带者的后代进行筛查，及时淘汰携 带者，对我国奶业和肉牛业的发展都具有非常重要的意义。

荧光自动化检测分析方法其基本原理就是，通过在引物上标记荧 光发色基团，经PCR扩增后，再采用毛细管电泳或聚丙烯酰胺凝胶 电泳技术进行产物分离，利用基于荧光扫描技术的遗传分析仪，结合 分子量标准自动计算PCR产物长度大小，是一种常见的用于检测长 度多态的技术手段。此法通过直接判定扩增片段的长度，能够实现高 通量和自动化的分型。另外，该技术具有灵敏度高、特异性和可靠性 更强、能与其他位点检测进行组合检测实现高通量分型、自动化程度 高、无污染性、具实时性、快捷性和准确性等特点，目前已广泛应用 于分子生物学研究和医学研究等领域。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种西门塔尔牛蜘蛛 腿综合征(AS)致病位点荧光检测自动化分析方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种西门塔尔牛蜘蛛腿综合征 (AS)致病位点荧光自动化检测分析PCR检测用引物，其核苷酸序 列如下：

5’-CTGAGTCTCCTCTTCTGTTTTCA-3’，

5’-GTTGGCATCTGAGTCCAGGT-3’。

上述引物配合使用的荧光染料，其荧光染料优选为FAM、HEX 或TET。

本发明还提供含有上述引物的检测试剂盒，其还包括：DNA裂 解液、荧光引物PCR反应液、荧光电泳标准品、阴性模板和/或阳性 模板。

本发明进一步提供利用上述引物或试剂盒检测西门塔尔牛蜘蛛 腿综合征的方法，所用引物为权利要求1所述引物，或所用试剂盒为 权利要求2或3所述的试剂盒，其包括以下步骤：

1)目的基因的扩增

以西门塔尔牛组织细胞DNA为模板，进行PCR反应，回收PCR扩 增产物；

2)基因分型

对上述PCR产物利用荧光毛细管电泳或者荧光聚丙烯酰胺凝胶 电泳分型。

所述PCR扩增条件优选为95℃预变性5min，然后95℃变性30s、60 ℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环，72℃最终延伸10min。

所述引物用量为1.5μL，引物的终浓度为10μM。

本发明还提供了上述所述方法在牛抗病育种中的应用。

该检测方法是在证实MOCS1基因的c.del1224_1225CA位点为西 门塔尔牛蜘蛛腿综合征(AS)致病位点的基础上，结合荧光引物PCR， 设计的一种快速准确遗传致病基因检测的方法。对西门塔尔牛AS致 病突变位点准确有效的分子检测方法的建立，目的在于筛选出我国牛 群中的突变携带者个体，进行不利基因的筛查和剔除，对我国进口的 西门塔尔牛种用动物及遗传物质(冷冻精液，胚胎等)进行检测，防 止AS在我国牛群中的传播，对我国西门塔尔牛及相关杂交品种的遗 传改良提供保障。

本发明利用荧光自动化检测分析技术，对西门塔尔牛AS致病位 点进行分型的试剂盒结果稳定，成本低，准确可靠，可实现高通量检 测，对西门塔尔牛AS致病位点可以进行准确的分型，及时发现携带 者个体。

附图说明

图1为本发明牛冻精基因组1％琼脂糖检测结果；

图2为本发明牛血液基因组1％琼脂糖检测结果；

图3为本发明牛耳组织基因组1％琼脂糖检测结果；

图4为本发明多重PCR反应程序；

图5为本发明MOCS1基因c.del1224_1225CA突变PCR产物2％ 凝胶检测；

图6为本发明ROMEL及其两个后代测序结果；

图7为本发明MOCS1基因c.del1224_1225CA位点荧光引物PCR 产物毛细管电泳检测判型结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的 修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。

实施例1试验材料的准备和DNA的提取

本研究采用的试验材料来自两个部分：4头德系西门塔尔公牛家 系中的与配母牛和杂交后代抗凝血样及耳组织样；11个牛品种或品系 的公牛管制冻精。

4个德系西门塔尔公牛家系(表1)，包括80头与配母牛及106头后 代，分别来自中国鞍山恒利奶牛场(鞍山恒利)和内蒙古海拉尔市谢 尔塔拉三河牛种牛场(海拉尔谢尔塔拉)。4个家系中，母牛品种为中 国荷斯坦牛和中国三河牛，后代均为杂交牛(荷斯坦×德系西门塔尔 杂交牛、三河牛×德系西门塔尔杂交牛)。4头德系西门塔尔牛分别为 ROMEL、BOSSAG、RIFURT、HIRMER(德国西门塔尔牛系谱查询 网站：http://www.zar.at/article/archive/18981)。ROMEL为已知AS致病 基因携带者，其他3头公牛均为不携带AS致病基因的正常个体。

表1 4头德系西门塔尔公牛家系信息

本研究以11个牛品种或品系的194头公牛冻精为试验材料。品种 或品系名称、样品数、样品来源见表2。其中德系西门塔尔公牛为表1 中4头公牛。

表2 10个牛品种或品系冻精样品信息

本试验提取DNA的方法参考陈慧勇(2005)方法提取公牛冻精 DNA，采用DNA提取试剂盒DP304(天根生化科技有限公司，北京)) 提取牛耳组织、血液DNA。使用NanoDrop2000色谱法检测DNA浓 度及纯度后，4℃保存备用。

所提取的DNA条带单一，经紫外分光光度计检测，冻精浓度在 150ng/μl左右，血液DNA在100ng/μl左右，耳组织DNA浓度在 150ng/μl左右。所有个体DNA均稀释到50ng/μl，冻存于-20℃备用。 牛冻精基因组1％琼脂糖检测结果如图1所示，牛血液基因组1％琼 脂糖检测结果如图2所示，牛耳组织基因组1％琼脂糖检测结果如图 3所示。

实施例2亲子鉴定

为了保证结果的可靠性，本研究对ROMEL及其31个后代，进 行了亲子鉴定。采用ABI(美国应用生物)的牛用亲子鉴定试剂盒 (StockBovine Genotyping Kit)进行11个标记的多重PCR。 1、标记信息如表3所示

表3 Stock牛用亲子鉴定试剂盒标记信息

2、亲子鉴定试剂盒多重PCR

牛用亲子鉴定试剂盒采用11重PCR，15μL体系，组分为Gold Taq 酶，0.5μL；Permix引物，5.5μL；PCR缓冲液，3μL；dNTP预混液， 4μL；模板DNA，1μL；ddH20，1μL。本研究使用试剂盒中的对照 DNA(正常个体DNA)作为阳性对照，并设有不加DNA模板的阴性 对照。多重PCR反应程序见图4。

3、利用ABI3700测序仪进行微卫星标记基因型的判定

PCR扩增结束后，须用琼脂糖电泳初步检测一下扩增效果，并初 步估计产物浓度，检测合格后根据预试验结果将PCR产物稀释，加入 到适量的灭菌水中震荡3分钟充分混匀，在离心机4000转/分钟的转速 下离心30秒。将混匀的PCR产物取1～1.5μL和上样混合液混匀。混匀 后的PCR产物取1-1.5μL，加甲酰胺10μL，分子内标400HD或 500LIZ0.6μL，配制成混合体系，然后再在3700测序仪上样电泳与收 集荧光信号。上测序仪前要先进行变性处理，方法是：进行95℃水浴 5min，然后迅速放入4℃水浴5min。变性后的样品要保持在低温状态， 以使PCR产物的两条链处于分离状态。注意如果温度过高，则可能会 复性，影响电泳结果。

利用ABI Gene Mapper4.0软件完成基因型判定与数据导出Excel 文件，作为基因型文件，准备下一步亲子鉴定的整理与统计分析。

4、利用Cervus3.0进行亲子鉴定

本研究使用Cervus3.0软件，利用最大似然法原理对32头犊牛及4 头候选父亲进行亲子鉴定。分别使用99％和95％的置信概率。亲子鉴 定根据群体各标记基因型值，进行10000次模拟，假设标记基因型判 型过程存在0.001的判型错误率。犊牛可用标记与公牛可用标记数为 基因型分析后可以用来做亲子鉴定的标记数目。不匹配标记对指犊牛 与对其应的最可能父亲不符合孟德尔遗传定律的标记数目。亲子对 LOD值为最可能父亲和第二可能父亲的似然值的比(似然比)，再取 对数的值。亲子对置信度取0.99和0.95两种水平，用“+”和“*”表示。

根据系谱得到的携带者即ROMEL的后代为31头，亲子鉴定结 果表明，ROMEL的真实后代有24头，另外7头犊牛的系谱记录发 生错误。所有亲子对的置信度都达到95％或以上，表明是可信的。

表4 31头犊牛与4头公牛亲子鉴定结果

注：上表中，^*代表进行亲子鉴定99％置信度，+代表95％。

实施例3AS致病突变的直接测序分析

本研究针对MOCS1基因c.del1224_1225CA突变，设计了引物， 选取了ROMEL等4头德系西门塔尔公牛及ROMEL其系谱记录上的 31个后代，进行对突变所在片段的PCR扩增，扩增后进行PCR产物 测序。测序引物为表5所示，PCR体系同实施例2，PCR反应如图4 所示。PCR经2％凝胶检测，PCR产物在华大基因进行纯化和Sanger 测序。

表5 MOCS1基因突变位点直接测序用引物

代(表6)为携带该突变的杂合基因型，其他个体均为野生型。ROMEL 及其2头后代测序峰图如图6所示，ROMEL在突变位点为杂合型， 其两个后代94254和9129x在突变位点分别为杂合型与野生纯合型， 黑色箭头表示突变位点。测序结果与参考序列的多重比对结果与测序 峰图相符。

表6 24头ROMEL真实后代MOCS1基因c.del1224_1225CA突变 位点检测结果

注：A为野生型、B为突变型

实施例4AS致病突变荧光自动化检测法

1、方法

本研究中，MOCS1基因c.del1224_1225CA突变为2bp的缺失突 变，由于荧光引物PCR检测法灵敏度高，可准确检测长度在1bp的 长度多态，因此本研究针对突变位点，设计荧光标记的引物，进行 PCR扩增后毛细管电泳检测其基因型。由于毛细管电泳检测不同板间 可能存在系统误差，因此试验中每板设有3个相同个体，以校正板间 的基因型判定误差；板内误差使用分子量标准GS500LIZ进行校正。

采用FAM荧光基团标记上游引物的5’端。PCR体系与反应程序同 实施例2，反应程序如图4所示。

2、荧光引物PCR检测及结果统计

西门塔尔牛AS致病位点的PCR的上游引物，携带荧光标记。收 集PCR产物后，通过2％琼脂糖检测，估测PCR产物浓度。对PCR产物 浓度进行合理稀释后，ABI3700自动测序仪上样检测。检测过程及基 因型分析方法参见实施例2。

3、结果

以表1和表2中共380头牛基因组DNA为模板，使用荧光引物进行 PCR扩增与PCR产物的毛细管电泳，进行MOCS1基因 c.del1224_1225CA位点基因型检测。检测结果中有13头牛，分别是 ROMEL与其12头真实后代，在248bp、250bp位置出现2个明显主峰， 为杂合基因型，判断为杂合子(AB基因型)。其他367头被检测个体均 在250bp位置出现单一峰，为纯合基因型，判定为纯合子(AA基因型)。 荧光检测结果由图7表示。与实施例3中的35个个体测序结果进行比对 后，在测序峰图中出现套峰的13头杂合子在荧光检测结果中均显示为 两个主峰的杂合型，测序峰图中为正常单一峰的22头牛在荧光检测结 果中均为单一峰的纯合基因型。该位点的35头牛测序结果与荧光引物 PCR检测结果完全一致。证实荧光引物PCR产物毛细管电泳检测法的 准确性和实用性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以 做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。