一种含有MRP-2基因3′UTR和报告基因的重组质粒及其应用

摘要

本发明公开了一种含有MRP-2基因3′UTR和报告基因的重组质粒及其应用，将构建的MRP-2基因3′UTR报告基因载体与pRL-SV40载体及所需筛选的microRNA共转染到耐药型的结肠癌细胞系中，通过同时检测萤火虫和海肾荧光素酶的活性来反应microRNA对于MRP-2基因3′UTR区的抑制活性，从而建立靶向筛选逆转肿瘤多药耐药的microRNA的方法。该方法在筛选逆转肿瘤多药耐药的microRNA、研究逆转肿瘤多药耐药与microRNA之间的作用机理以及研究肿瘤细胞多药耐药microRNA水平的机制方面有极佳的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，更具体地说，涉及一种含有MRP-2基因的3′ UTR和报告基因的重组质粒及其生产方法和应用。

背景技术

肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对多种药物产生抗药性的同时，对其他结构不同、靶位不同、作用方式不同的抗肿瘤药物均产生的交叉耐药性。多药耐药是最重要、最常见的肿瘤耐药现象，成为肿瘤治疗中最大的障碍之一。多药耐药相关蛋白MRP-2是三磷酸腺苷(ATP) 结合盒运载体基因家族成员之一, 也称ABCC2 (ATP-binding cassette, subfamily C, member 2), 又名管状多特异性有机阴离子转运蛋白(cMOAT), 是近几年新发现的一个与肿瘤多药耐药相关的基因。MRP-2转运的抗癌药物包括甲氨蝶呤、多柔比星、表柔比星、米托蒽醌、长春碱、顺铂、依托泊苷和一些两性阴离子药物及内源性的化合物如葡萄糖醛酸盐和硫酸盐等。近几年，MRP-2介导的MDR是研究多药耐药机制的热点之一。

随着人类基因组计划的完成和模式生物基因组计划的进行，人们对于占人类基因组95％以上的非编码序列的研究日益加强。研究发现，它们中很多是具有生物学功能和意义的片段，在这些研究之中，对于大小约21-23个碱基的单链小分子RNA的microRNA的研究则是最为热点之一。在近几年肿瘤的研究中，关于microRNA对于肿瘤的功能与调控的研究一直是肿瘤治疗领域的热点之一，取得了很大的突破与进展。目前研究表明，microRNA主要是通过结合到靶标基因的3′ UTR区域，进而抑制靶标基因的转录，因此基因的3′ UTR的抑制程度能够指示该基因受到microRNA抑制的水平。然而，现阶段对于多药耐药与microRNA的相关研究报道并不多见，对MRP-2蛋白与microRNA的研究更是鲜有报导，目前没有一种简便、快捷的方法用来筛选能够抑制多药耐药蛋白的microRNA。

发明内容

本发明的目的是，提供一种含有MRP-2基因3′ UTR和报告基因的重组质粒。

本发明的第二个目的是，提供上述重组质粒的制备方法。

本发明的第三个目的是，提供上述重组质粒在筛选抑制MRP-2基因3′ UTR活性的microRNA中的应用。

为了实现上述第一个目的，本发明提供的技术方案为：一种含有MRP-2基因3′ UTR和报告基因的重组质粒，所述报告基因为萤火虫荧光素酶基因pGL3。

为了实现上述第二个目的，本发明提供的技术方案为：一种含有MRP-2基因3′ UTR和报告基因的重组质粒的制备方法，包括以下步骤：

（1）用pGL3-promoter质粒转化常规制备的DH5α感受态细胞，进行扩增，碱裂解法制备pGL3-promoter质粒，电泳检测质粒的纯度和含量，用NcoI和HindIII对质粒进行双酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物；

（2）MRP-2基因的3′ UTR序列的克隆、酶切及纯化，所用的引物为

引物1: 5′ - CCCAAGCTTTGGGTTAGAAAAGGAC -3′；

引物2: 5′ - CATGCCATGGTTCAGGACAGTGGTTGT -3′；

以基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增，用试剂盒凝胶回收PCR产物，将回收的PCR产物用NcoI和HindIII双酶切；

（3）将上述获得的pGL3-promoter载体和MRP-2基因3′ UTR片段进行连接反应；

（4）筛选重组子，将上述连接产物直接转化感受态大肠杆菌，经过含有氨苄青霉素的LB培养基中选择培养，从转化子的平板上随即挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法少量提取质粒备用，经过酶切、PCR、测序鉴定。

为了实现上述第三个目的，本发明提供的技术方案为：一种含有MRP-2基因3′ UTR和报告基因的重组质粒在筛选抑制MRP-2基因3′ UTR活性的microRNA中的应用。

作为一个优选方案，用pGL3-MRP-2-3′ UTR-promoter质粒联合海肾荧光素酶pRL-SV40质粒共转染耐药型肿瘤细胞系，通过同时检测两种荧光素酶活性来反应microRNA对MRP-2基因3′ UTR活性的抑制作用。

作为又一个优选方案，所述耐药型肿瘤细胞系为结肠癌细胞系HCT116/L-OHP。

本发明的优点在于，通过同时检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性来反应microRNA对于MRP-2基因3′ UTR区的抑制活性，即其对于MRP-2的抑制活性，从而建立靶向筛选逆转肿瘤多药耐药的microRNA的方法。该方法在筛选逆转肿瘤多药耐药的microRNA、研究逆转肿瘤多药耐药与microRNA之间的作用机理以及研究肿瘤细胞多药耐药microRNA水平的机制等方面有极佳的应用前景。

附图说明

图1 为MRP-2基因3′ UTR序列的克隆，其中Marker为DL2000，1和2 为MRP-2基因3′ UTR片段(261bp)。

图2 为pGL3-MRP-2-3′ UTR-promoter重组质粒的NheⅠ和BglⅡ双酶切检测，其中Marker1为DL10000, Marker2为DL2000，1 和2 为 pGL3-MRP-2-3′UTR-promoter/HindIII + NcoI (5010bp+261bp)。

图3为运用pGL3-MRP-2-3′ UTR-promoter质粒在HCT116/L-OHP细胞中筛选对于MRP-2基因3′ UTR活性有影响的microRNA，以空白pGL3-promoter质粒荧光活性为Control，1为空白、2为hsa-miR-148a、3为hsa-miR-222、4为hsa-miR-297、5为hsa-miR-630、6为hsa-miR-1915。

图4 为检验pGL3-MRP-2-3′ UTR-promoter质粒在HCT116/L-OHP细胞中筛选出的对于MRP-2基因有抑制作用的microRNA，1为hsa-miR-148a、2为hsa-miR-222、3为hsa-miR-297、4为hsa-miR-630、5为hsa-miR-1915。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的含有MRP-2基因3′ UTR和报告基因的重组质粒的构建和应用的具体实施方式做详细说明。

实施例1、构建含有MRP-2基因3′ UTR和报告基因的重组质粒

一、试验材料

1、菌株、质粒

（1）菌株：大肠杆菌E.coliDH5α，耐药性型大肠癌细胞株HCT116/L-OHP由华东理工大学药理实验室诱导，对于奥沙利铂的IC₅₀为167μg/ml，耐药倍数为9.7；

（2）质粒：pGL3-promoter和pRL-SV40为本实验室保存。

2、生化试剂

（1）ExTaq酶，限制性内切酶HindIII，NcoI和DNA Ligation Kit购自TaKaRa公司。DL2000 marker和λDNA/HindⅢ marker购自上海MajorBio公司。PRMI 1640培养液(Hyclone); Lipofect Transfection Reagent (TIANGEN, Beijing)；

（2）双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自KenReal公司。质粒回收试剂盒和DNA片段回收试剂盒购自Tiangen公司；

（3）小牛血清购自民海生物公司。BSA，NaCl，NaF，Tris，EDTA，Trytone，Yeast Extract， PMSF，PAGE，SDS，Tween-20，G250，硼酸，甘氨酸，亮肽，蛋白显影液等试剂购自上海MajorBio公司。MRP-2，β-actin抗体购买于cell signal公司。

3、主要试剂的配制

100mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）：称取BSA 0.1g溶于1mL 0.15 M NaCl，－20°C保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15M NaCl进行100倍稀释成1mg/mL，－20°C保存。

蛋白电泳缓冲液（5×）：称取Tris 15.1g，甘氨酸 94g，SDS 5g溶于1L超纯水，室温保存。

蛋白转移缓冲液（5×）：称取Tris 29g，甘氨酸 14.5g，SDS 1.85g溶于1L超纯水，室温保存。临用前稀释为1×，每升加入甲醇200 mL。

1.5 M Tris·HCl（pH 8.8）：称取Tris 45.43g溶于200mL，浓盐酸调pH至8.8，超纯水定容至250 mL，4°C保存。

0.5 M Tris·HCl (pH 6.8)：称取Tris 15.14g溶于200mL，浓盐酸调pH至6.8，超纯水定容至250 mL，4°C保存。

30%丙烯酰胺：称取丙烯酰胺 29g，甲叉双丙烯酰胺 1g溶于100 mL，滤纸过滤于棕色瓶中4°C保存。

TBS缓冲液（5×）：称取Tris 24.2g，NaCl 80g溶于1L超纯水，室温保存。

TBST缓冲液（含0.1％Tween-20的TBS缓冲液）：量取Tween-20 1mL溶于1L TBS，即可使用，最好现用现配。

封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）：称取脱脂奶粉 5g溶于100mL TBST，溶解后4°C保存。

G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）：称取G250 100mg，溶于50mL 95％乙醇，量取100mL 磷酸，超纯水定容至1L，滤纸过滤，4°C保存。

1 M Tris·HCl（pH 7.5）：称取Tris 30.29g溶于200mL超纯水，浓盐酸调pH至8.8，超纯水定容至250 mL，4°C保存。

1 M DTT：称取DTT 3.085g溶于20mL 0.01M 乙酸钠溶液，-20°C保存。

20mg/mL PMSF：称取PMSF 0.2g溶于10mL 异丙醇，-20°C保存。

细胞总蛋白提取液：称取NaCl 0.73g，NaF 0.524g，EDTA 0.931g，SDS 0.25g，去氧胆酸钠 2.5g，量取Triton-100 2.5mL，1 M Tris·HCl(pH 7.5) 2.5mL，超纯水定容至250mL，4°C保存。用时每毫升提取液中加1μL DTT(1M)、5μL PMSF(20mg/mL)、10μL亮肽(2.5mg/mL)即可。

SDS-聚丙烯酰胺分离胶(5mL)：

SDS-聚丙烯酰胺积层胶(2mL)：

AP buffer：称取Tris 2.42 g，MgCl2 0.04 g，NaCl 1.75 g溶于200mL超纯水，4°C保存。

蛋白显影液：量取NBT 33 μL，BCIP 16.5 μL溶于5mL AP Buffer，现配现用。

二、方法步骤

1、重组质粒的构建

（1）pGL3-promoter和pRL-SV40质粒的大量扩增、抽提

用pGL3-promoter质粒转化常规制备的DH5α感受态细胞，进行大量的扩增；碱裂解法大量制备pGL3-promoter质粒，电泳检测质粒的纯度和含量；用NcoI和HindIII对质粒进行酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物。

（2）MRP-2基因的3′ UTR序列的克隆、酶切及纯化

根据人的MRP-2基因的3′ UTR区序列设计两端引物：

引物1为上游5′端引物，其中包含16个MRP-2基因的3′ UTR互补碱基，一个HindIII识别位点，3个保护碱基；

引物2为上游3′端引物，其中包含17个MRP-2基因3′ UTR互补碱基，一个NcoI识别位点，4个保护碱基；

引物1: 5′ - CCCAAGCTTTGGGTTAGAAAAGGAC -3′，；

引物2: 5′ - CATGCCATGGTTCAGGACAGTGGTTGT -3′ ；

以基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增；反应条件为94℃变性5min；循环为94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，共进行35个循环，72℃延伸8min。反应结束后，取5μl反应产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测；取100μl PCR产物，琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用凝胶回收试剂盒回收；将回收的PCR产物用NcoI和HindIII双酶切。再次回收以备连接使用。

（3）连接反应

将经过双酶切的pGL3-promoter载体和MRP-2基因3′ UTR片段在0.2ml的离心管中进行连接反应，16℃过夜反应。

（4）筛选重组子

取10μl连接产物直接转化100μl感受态大肠杆菌。经过含有氨苄青霉素的LB培养基中选择培养。从转化子的平板上随即挑取10个菌落，扩增培养后用碱裂解法少量提取质粒备用；经过酶切（图2）、PCR、测序鉴定。结果显示，重组载体中含有插入的MRP-2基因3′ UTR片段并且未发现有碱基突变。

实施例2、筛选对MRP-2基因3′ UTR活性有影响的microRNA

1、细胞的培养

人结肠癌细胞株耐奥沙利铂型HCT116/L-OHP培养于含有10％新生牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640完全培养基（37℃ 5％ CO₂、饱和湿度）中，并使之维持单层贴壁生长。HCT116/L-OHP细胞的培养基中添加5mg/mL的奥沙利铂以维持其耐药性。

2、细胞的铺板

按5×10⁵个细胞/孔的量在6空板中接种指数生长期的细胞，在37℃ 5％ CO₂培养箱中过夜培养，直到细胞到80％汇片。

3、共转染

在EP管中配置mimics (microRNA模拟物)/DNA/脂质体符合物如下：分别稀释质粒DNA (4μg/well)及mimics (80nM/well)至RPMI 1640-SF(250μL/well)中，稀释脂质体(10μL/well)至RPMI 1640-SF(250μL/well)，分别室温放置5 min。然后将所有上述稀释液混合，在室温放置20 min，使microRNA/DNA与脂质体结合。铺板细胞用RPMI 1640-SF洗一次，在每个孔中加入500μL的mimics/DNA/脂质体混合物。在37℃ 5％ CO₂培养箱中培养3-5 hour，吸去mimics/DNA/脂质体/RPMI 1640-SF混合物，每孔加入2 ml新鲜培养液，在37℃ 5％ CO₂培养箱中培养24-48 hour。蛋白样品细胞转染方法同上，符合物配置为mimics和脂质体。

4、荧光素酶活性检测

按照试Kenreal剂盒说明书指导配制工作液（工作业1：A液（2 ml）+B液（40 μl）＋C液（10 μl）混合均匀，用于测定萤火虫荧光素酶活性；工作业2：D液（2 ml）+E液（10 μl）混合均匀，用于测定海肾荧光素酶活性）。转染有mimics，pGL3-MRP-2-3′ UTR-promoter Vector和pRL-SV40 Vector的细胞经过一定时间的培养后收集。细胞的裂解：取出培养基，建议用PBS洗一次。加入裂解液500 μl/孔，室温摇动15 min。取15-20 μl细胞裂解液于1.5 ml的离心管中。加入工作液1，设定延迟2 sec，发光仪测读10 sec。加入工作液2，设定延迟2 sec，发光仪测读10 sec。

5、Western-blot测定筛选出得microRNA对于MRP-2蛋白的作用

1）细胞总蛋白的提取

细胞处理完毕，将6孔板置于冰浴，去上清液，加入5mL冰浴PBS洗涤2次（每毫升PBS加5μL的20mg/mL PMSF）；加入5mL冰浴PBS洗涤（每毫升PBS加5μL的20mg/mL PMSF），用细胞刮片收集细胞，2000rpm离心5 min，去上清液，加1 mL冰浴PBS（每毫升PBS加5μL的20mg/mL PMSF），洗涤沉淀，并将细胞悬液转移至Ep管，4°C，14000rpm离心1min；吸弃上清液，加入2倍体积的细胞裂解液，充分混匀后冰浴30min；4°C，14000rpm离心30 min，将含有细胞总蛋白上清置于新的EP管中。蛋白定量后，-80°C冻存。

（2）Bradford比色法测定蛋白质含量

在小试管中加入0.5 mg/mL牛血清白蛋白BSA（用0.15 mM NaCl配制）15、30、45、60和75 μL，用0.15 mM NaCl补足300 μL；每管加入3 mL考马斯亮蓝染料，混匀，室温放置2 min；用1 cm光径微量比色皿测定OD₅₉₅，作标准曲线；将待测样品稀释适当倍数，测定蛋白质含量。

（3）蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

①配置10％丙烯酰胺分离胶；

②加入到玻璃板间，使用无水乙醇封闭液面，室温静止30 min；

③配置5％的丙烯酰胺积层胶；

④加入到玻璃板间，插入相应梳子，室温静止30 min；

⑤分别将经过变性，总量为40 μg蛋白上样；

⑥以80V电压使溴酚蓝条带到达分离胶；

⑦调整电压到100V直至电泳结束。

（4）蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜

①取出凝胶切成适当大小的长方形，在右下角切下一小块作为标记；

②在海绵上依次叠加3张剪好的滤纸，准确对齐，而且滤纸之间要没有气泡；

③在滤纸上叠加PVDF膜，准确对齐，避免气泡；

④在膜上叠加凝胶，准确对齐，避免气泡；

⑤将两块海绵对齐后立即夹紧塑料板，放入转膜电泳槽中并倒入足够的转移缓冲液；

⑥接通电源，调整电流到300 mA，电泳2 h（注意补加碎冰块，以降低转膜缓冲液温度）。

（5）封闭PVDF膜的免疫球蛋白结合位点

①取出塑料板，用镊子小心夹出膜，在PBST缓冲液中漂洗3 min；

②将膜转移至塑料培养皿中，加入10 mL封闭液；

③室温下，在水平摇床上封闭1 h。

（6）第一抗体与靶蛋白结合

①室温下，将膜在PBST缓冲液中漂洗3次，10 min/次；

②在包有封口膜的玻璃板上，滴加1 mL一抗(MRP-2，β-actin蛋白)溶液（1:1000稀释），然后将膜正面向下，小心的覆于一抗溶液上，膜与抗体溶液 间勿留气泡；

③ 4℃下，抗体与靶蛋白结合过夜。

（7）第二抗体与第一抗体结合

①室温下，将膜在PBST缓冲液中漂洗3次，5 min/次；

②同一抗操作，加入1 mL二抗溶液（1:1000稀释）；

③室温下，结合2 h。

（8）显影

①室温下，将膜在PBST缓冲液中漂洗3次，5 min/次；

②用5 mL AP buffer（Alkaline Phosphatase）配置显影液NBT/BCIP；

③将膜置于显影液中，室温下温和摇动，直至条带清晰；

④待条带清晰，置清水中洗5 min。

结果显示，通过运用构建的pGL3-MRP-2-3′ UTR-promoter质粒进行筛选，hsa-miR-297 mimics和hsa-miR-630 mimics对于MRP-2基因3′ UTR活性均产生抑制效果，同时其他的microRNA均没有产生效果，这也与文献及生物信息学分析预测相符（见图3）。

运用Western blot方法检验所构建的筛选方法的结果，验证结果显示，所筛选出得microRNA mimics均对目标蛋白MPP-2有抑制作用，证明所建立的以MRP-2基因3′非转录区为靶点的逆转肿瘤多药耐药的microRNA的筛选方法是有明显效果的（见图4）。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华东理工大学

 

<120>  一种含有MRP-2基因3′ UTR和报告基因的重组质粒及其应用

 

<130>  。

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  25

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

 

<400>  1

cccaagcttt gggttagaaa aggac                                             25

 

 

<210>  2

<211>  27

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

 

<400>  2

catgccatgg ttcaggacag tggttgt                                           27