棉纤维特异性HB转录因子基因KNAT7的鉴定及应用

摘要

本发明公开了棉纤维特异性HB转录因子基因KNAT7的鉴定及应用。棉花纤维特异性KNAT7属于homeobox(HB)转录因子基因家族成员，该基因序列中没有内含子，其cDNA全长为1244bp。KNAT7基因编码的蛋白质为300个氨基酸，分子量为33.8kDa。KNAT7在棉纤维中特异表达，其转录产物在细胞伸长后期和次生壁加厚初期的纤维中大量积累。在酵母中表达KNAT7基因能促使宿主细胞纵向伸长，转基因拟南芥分析显示KNAT7在一定程度上影响次生壁组分的合成。上述实验结果证明KNAT7在棉纤维伸长和次生壁加厚过程中起重要作用，该基因对于改良棉纤维品质、增加棉花产量可能具有重要的应用价值。

说明书

技术领域：

本发明涉及棉花基因，具体是棉花homeobox(HB)家族中的一个新成员基因KNAT7 的棉纤维细胞特异性表达及功能鉴定，进而应用于棉纤维品质改良。

背景技术：

棉花是我国最重要的经济作物之一，棉纤维广泛应用于纺织工业。随着纺织工业快速 发展和人民生活水平不断提高，纺织工业及其相关产业对棉纤维品质的要求愈来愈高。我 国棉花产量据世界第一位，但棉花纤维品质较差，不能用作一些高附加值高质量纺织产品 的生产原料。因此，我国每年需进口优质棉花100多万吨，造成国产原棉积压，纤维品质问 题已成为制约我国棉花产业可持续发展的主要障碍之一。

植物细胞的次生生长是植物的重要生命活动之一，一年或多年生的微管植物发生细胞 壁次生加厚以满足不断地对水分和营养的运输，同时，提供更大的机械支持力，以满足植 物生长发育之需求。在一些发生次生生长的植物中，按发育时期可将细胞壁分为初生壁和 次生壁。初生壁是在细胞生长时形成的一层较薄的能随着细胞生长而扩展的细胞壁，而次 生壁是细胞停止生长后在初生壁和质膜之间形成的具有木质素或其它次生代谢产物沉积的 多层结构的细胞壁。

植物的次生生长是一个复杂的细胞分化发育过程，这一过程是由许多功能基因的协同 表达来驱动的。研究表明，很多转录因子如同源异型盒(HB)、MYB、NAC、AP2/EREBP、 MADS、WRKY以及锌指蛋白等都参与次生壁的生物合成。目前，从杨树、拟南芥分离了 一些参与次生壁合成的HB家族的转录因子，这类转录因子参与非生物胁迫应答，影响植 物的生长与形态建成。但是，有关这类转录因子调控植物细胞次生壁形成的分子机制仍有 许多细节不太清楚。关于棉纤维次生壁加厚时期特异表达的KNAT7基因的分离鉴定，以及 它们在棉纤维细胞生长和细胞壁形成中的作用，未见研究报道。

植物homeobox(HB)基因是近二十年来发现的编码一类特殊转录调控因子的超基因家 族。该基因家族编码的转录因子有一个显著特征：含有由60个氨基酸组成的高度保守的结 构域-同源异型域(homeodomain，HD)。这类转录因子首先在果蝇中发现，随后在其它 动物、植物和真菌中相继发现了类似的同源异型盒蛋白。目前从植物中发现的大量HB基 因在基因大小、编码蛋白结构等方面都存在差异。根据水稻和拟南芥这两类模式生物，可 以将植物HB类转录因子分六类：具有亮氨酸拉链结构的HD-Zip、编码锌指结构域的 PHD-finger、Bell、ZF-HD、WOX和KNOX。KNOX蛋白在螺旋1与螺旋2之间存在三个 额外的氨基酸(P-YP)，这使得它的HD区包括63个氨基酸，属于非典型的同源异型盒蛋白。 KNOX的结构与人类的MEIS(myeloid ecotropic viral integration site)最为相似，除HD外， 它们都具有一个保守的N末端区域，因而这个区域在KNOX家族和MEIS家族发现之后被 命名为MEINOX域。根据基因核苷酸序列的相似性、内含子的插入位点、编码蛋白同源结 构域中氨基酸序列的相似性以及表达模式的不同，可将KNOX分为三个亚家族：I类KNOX 亚家族和II类KNOX亚家族(以下分别简称KNOXI和KNOXII)，以及目前在拟南芥中又 发现的第三类，命名为KNATM，这类亚家族基因编码的蛋白缺少HD结构域。目前对KNOX I研究较为深入，它们是一类维持分生组织功能的重要基因。KNOXII的表达较为广泛， 参与植物发育。例如，研究表明AtKNAT1、AtKNAT3、AtKNAT4和AtKNAT5参与拟南芥根 的发育，AtKNAT7受次生壁合成的关键调控因子SND1的调节，影响次生壁的加厚。

发明内容：

本发明的目的在于提供一个在棉纤维次生壁加厚时期优势表达的新基因KNAT7，分析 其蛋白亚细胞定位、转录激活活性及其在酵母细胞中表达对宿主细胞形态的影响，以研究 其功能，为解析纤维细胞次生壁加厚的分子机制，改良棉纤维的品质提供新的科学资料。

申请人采用比较基因组学和生物信息学等研究方法，利用申请人所构建了棉花纤维 cDNA文库，分离鉴定了一个在纤维次生壁加厚时期优势表达的基因KNAT7。该基因不含 内含子，其cDNA全长序列为1244bp，开放阅读框为903bp，编码一个含300个氨基酸 的蛋白质，分子量为33.8kDa。

与已知的拟南芥KNOX蛋白序列相比较，棉花KNAT7与KNOXII的AtKNAT7蛋 白的同源性较高，其序列相似性达到80％。棉花KNAT7蛋白具有KNOX蛋白的典型结构 和保守序列，包含MEINOX结构域(由KNOX1和KNOX2两个亚结构域组成)、ELK结 构域、GSE和HD结构域(见图1)。

为获取棉花KNAT7基因的基因组DNA全长序列，申请人在其开放阅读框(ORF)两端 设计一对引物(见表1)，以棉花基因组DNA为模板，在94℃-5min，1个循环；94℃-1min， 58℃-1min，72℃-2min，32个循环的PCR反应条件下得到该基因的DNA序列。测序结果 显示，棉花KNAT7基因的DNA序列与其cDNA序列相同，没有内含子插入。

为验证KNAT7基因编码的蛋白是否为转录因子，申请人分析了该蛋白的亚细胞定位以 及转录激活活性。构建了pBI121-KNAT7：GFP融合表达载体，转化棉花下胚轴，观察转化 3个月的转基因愈伤组织，KNAT7：GFP融合蛋白定位于细胞核中(见图2)。为了分析转 录激活活性，构建了pGBKT7/pGADT7-KNAT7分别转化酿酒酵母菌株Y187和AH109，并 经PCR(聚合酶链式反应)检测阳性克隆。将在SD/-Trp平板上生长的AH109阳性转化子 划线SD/-Trp/-Ade平板，结果显示转入KNAT7的AH109菌株在SD/-Trp/-Ade平板上不能 生长(图3A)；将在SD/-Trp平板上生长的Y187阳性转化子进行显色反应，检测LacZ 报告基因是否被激活表达，结果显示X-gal显色后，8小时内转入pGBKT7-KNAT4的菌落 没有出现蓝色(图3B)，以上结果说明GhKNAT7不具备自激活效应。

定量RT-PCR(逆转录PCR)进一步分析KNAT7基因在棉花各组织/器官中的表达以及 受激素诱导的情况。结果如图4A所示，KNAT7基因在纤维中特异表达。该基因在纤维起 始期和伸长前期表达量较低，在纤维伸长后期和次生壁开始加厚时表达量逐渐升高，在 20DPA纤维中表达量最高。利用50μM ABA、5μM IAA、5μM KT、5μM GA、0.1μM BL、 500μM ACC和100μM SA离体胚处理15DPA纤维4小时，结果显示KNAT7不受激素诱导 (图4B)。

为进一步研究棉花KNAT7基因的功能，构建pREP-5N-KNAT7酵母表达载体，随后将 重组质粒转化裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)细胞。在pREP质粒中，KNAT7的表 达受到nmt-1启动子的调控。nmt-1启动子的活性受外源VB1的抑制，即当培养基中缺乏 VB1(诱导培养基)时，启动下游基因的表达。对包含pREP-KNAT7质粒的酵母在诱导或非 诱导培养基中培养一段时间后的细胞形态进行观察分析，实验结果如图5所示。对照酵母 细胞(包含pREP-5N空质粒)无论在非诱导还是在诱导培养基中，形态没有差异(图5A，5B 和5C)。KNAT7转基因酵母(包含pREP-KNAT7质粒)在非诱导培养基中形态与对照类似 (图5D)，而在诱导培养基中细胞长度比在非诱导条件下显著增长(图5E和图5F)。从转基 因酵母中随机选取10个细胞系，测量其在非诱导和诱导条件下的细胞长度，统计分析结果 显示KNAT7转基因酵母在诱导条件下是在非诱导条件下的细胞长度的2-3倍(图5G)。以 上实验结果表明，棉花KNAT7基因在裂殖酵母中异源表达可以显著改变细胞的形态，促使 细胞纵向伸长。

KNAT7mRNA在次生壁形成时期的棉纤维中大量积累，表明这些基因产物在纤维细胞 次生壁加厚过程中可能起重要作用。构建了棉花KNAT7过量表达和显性抑制载体转化拟南 芥和棉花，已经获得6个株系的过量表达转基因拟南芥植株，7个株系的显性抑制转基因 拟南芥植株(KNAT7AtDR)，9个株系的显性抑制转基因棉花植株(KNAT7GhDR)。初步的 表型分析结果显示，显性抑制的转基因拟南芥和棉花在表型上与野生型有一定程度的差异 (如图6和图7)。

本发明的优点：

1、提供了一个棉花新基因KNAT7的全长cDNA序列及其编码的蛋白质序列，分析亚细 胞定位，并通过酵母双杂交系统检测转录因子的转录活性，证实了该基因编码的蛋白属于 KONX转录因子家族。

2、棉花KNAT7的转录产物在处于次生壁加厚期的棉纤维细胞中大量积累，而且该基因 的表达能显著促使酵母细胞纵向伸长。

3、棉花KNAT7显性抑制转基因拟南芥和棉花与野生型表型上存在差异，这些实验结果 表明KNAT7参与了棉纤维的发育，在纤维伸长以及次生壁加厚过程中起重要作用。

本发明通过以下附图和实施进行进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

附图说明

图1.棉花KNAT7编码蛋白结构分析

图中：MEINOX(KNOX1和KNOX2亚结构域)、GSE、ELK和HD(homeodomain)。

图2.棉花KNAT7蛋白亚细胞定位分析

图中：A-明场下KNAT7：GFP-转基因拟南芥根的局部放大；B-暗视野下的荧光照片；C- 光照片和细胞叠加后的图像。

图3.棉花KNAT7转录激活活性分析

图中：A为SD/-Ade/-Trp平板上划线检测：转入pGBKT7空载体的AH109(BD)和 Y187(BD)菌株，转入pGBKT7-KNAT7融合载体的AH109(BD-KNAT7)和Y187(BD-KNAT7) 菌株；B为X-gal滤纸显色：依次为阴性、阳性菌株、转入pGBKT7空载体的Y187和AH109 菌株，转入pGBKT7-KNAT7的Y187和AH109菌株。

图4.棉花KNAT7基因的表达以及受激素诱导分析

图中：A为实时荧光定量RT-PCR分析KNAT7基因在棉花不同组织/器官中的差异表达 (R根；C，子叶；L，叶片；H，下胚轴；P，花瓣；A，花药；0-10O，0-10天龄胚珠； 3-20F，3-20天龄纤维)；B为将50μM ABA、5μM IAA、5μM KT、5μM GA、0.1μM BL、 500μM ACC和100μM SA添加到BT培养基中，离体胚处理15DPA纤维4小时，以不添 加激素的15DPA纤维作为对照。

图5.过量表达棉花KNAT7基因的裂殖酵母细胞形态分析

图中：(A-C)在非诱导(A)或诱导(B和C)培养基上生长的包含pREP5N空质粒的对照酵 母细胞；

(D-F)在非诱导(D)或诱导(E和F)培养基上生长的包含pREP-KNAT7质粒的酵母细胞；

(C和F)DAPI特异性对细胞核染色。

对诱导前后酵母长度测量统计：“**”指经过生物统计学分析，过量表达KNAT7的转 基因酵母细胞长度与对照有极显著差异(P值＜0.01)，n＝50。

图6.转基因拟南芥表型分析

T3代KNAT7AtDR转基因拟南芥与野生型相比，莲座叶的叶片卷曲。

图中：A、B和E为野生型拟南芥；C和D为KNAT7AtDR转基因拟南芥；F为 KNAT7AtDRL1-1-1；G为KNAT7AtDRL23-1-1。

图7.转基因棉花表型分析

T1代KNAT7GhDR转基因棉花与野生型相比叶片扭曲变形。

图中：A-野生型棉花；B-KNAT7GhDR转基因棉花；C-野生型与转基因棉花叶片比较。

表1KNAT7基因全长DNA序列克隆引物及RT-PCR引物

具体实施方式：

1、棉花KNAT7基因的全长cDNA分离克隆

从棉纤维cDNA文库(按Li XB等，2002，Molecular characterization of the cotton  GhTUB1 gene that is preferentially expressed in fiber.Plant Physiol 130：666-674中的方法进 行)中分离一个KONX家族的新基因，命名为KNAT7。

2、KNAT7基因的DNA全长序列的克隆

在KNAT7基因ORF两端设计一对引物(见表1)，以棉花基因组DNA为模板，在94℃-5 分钟，1个循环；94℃-1分钟，58℃-1分钟，72℃-2分钟，32个循环的PCR反应条件下得 到了一个约1kb的DNA片段，将该片段插入到PBS-T载体中。利用PBS质粒上的T3和T7 启动子对目的DNA片段进行测序。再用DNAstar软件分析所得的序列，与cDNA序列进行 比较，分析内含子的大小和插入位置。

3、KNAT7蛋白亚细胞定位分析

1)、构建pBI121-KNAT7：GFP融合表达载体转化农杆菌LBA4404。

2)、农杆菌介导的棉花转化：农杆菌与棉花外植体共培养后生长出的新的愈伤组织在 抗生素上筛选2-3个月。

3)、荧光观察：在激光共聚焦显微镜(Leica公司TCS SP5)下观察筛选培养的阳性愈 伤组织，并记录荧光分布情况。

4、KNAT7转录激活活性检测

1)、将转入pGBKT7空载体的AH109(BD/Y187(BD)菌株和转入pGBKT7-KNAT7融 合载体的AH109(BD-GhKNAT7)/Y187(BD-GhKNAT7)菌株SD/-Ade/-Trp平板上划线 待生长2-3天后观察是否有新的菌落生长；

2)、X-gal滤纸显色：阴性、阳性菌株、转入pGBKT7空载体的Y187/AH109菌株和转 入pGBKT7-KNAT7的Y187/AH109菌株集菌后在液氮中反复冻融三次后在加有β-巯基乙 醇和X-gal的Z-buffer中显色。

5、实时荧光定量RT-PCR分析

1)、棉花各组织总RNA的提取(按蒋建雄、张天真，2003，利用CTAB/酸酚法提取 棉花组织总RNA。棉花学报，15：166-167进行)；

2)、逆转录：按M-MLV逆转录酶(Promega公司)的使用说明书操作；

3)、实时荧光定量PCR：按荧光定量PCR试剂盒(TOYOBO)的使用说明书操作。以 棉花持家基因GhUBI1作为内参，计算基因表达的相对值。为了得到最佳的实验效果， PCR扩增条件及引物效率都以目的基因的cDNA为模扳进行优化。该实验中每个组织采集 3次样品，分别提取RNA，每个样品的RNA重复3次实时定量RT-PCR实验，最后统计9次 实验结果，计算其平均值和标准差。

6、酵母转化、培养及形态观察

根据分子克隆技术，在KNAT7基因开放阅读框(ORF)两端引物加上BamHI和NotI酶 切位点的回文序列，用于PCR扩增基因ORF片段。用相应的内切酶酶切该目的DNA片段后， 重组到pREP-5N质粒中。酵母转化、培养及形态观察均按Li L等，2007，Molecular  characterization of cotton GhTUA9gene specifically expressed in fiber and involved in cell  elongation.J Exp Bot，58：3227-3238中的方法进行。

1.棉花KNAT7基因的cDNA序列如下：

GCGGTGGCGG CCGCTCTAGA ACTAGTGGAT CCCCCGGGCT GCAGGAATTC GATCTTGAAT    60

TCATGCAAGA ACCAGGGTTA GGTATGATGA GTAGTGGTGG TGGGAGTGGT GGAATTGGAG    120

GGTTAAGCAG CGGAGAAGTG TCGGTTTCCG GTGAGCAGAA CCGACAGCTG AAGGCTGAGA    180

TAGCTGTTCA TCCGCTATAT GAGCAGCTAT TAGCAGCTCA TGTTTCTTGT CTCCGTGTGG    240

CAACGCCAAT CGACCAGTTG CCTTTGATTG ACGCACAGTT AGCACAATCT CATAACCTTC    300

TTAGATCTTA TGCTTCACAG CATCATCAAC ATGGTCATTC CCTATCACCC CATGAAAGAC    360

AGGAGCTCGA CAACTTCTTG GCACAATATT TGATAGTTCT GTGTACTTTC AAAGAACAGC    420

TTCAACAACA TGTCAGAGTC CATGCCATTG AAGCTGTCAT GGCTTGCCGT GAAATCGAAA    480

ATAACTTGCA AGCTCTTACT GGAGTCACAT TGGGTGAAGG AACAGGTGCA ACAATGTCAG    540

ATGATGAGGA TGATATGCAG ATGGACTTCT CTTTGGATCA ATCCGGCACC GATGGGCACG    600

ATTTAATGGG TTTTGGTCCC TTGATTCCTA CTGAATCCGA AAGATCTTTA ATGGAGAGGG    660

TTCGCCAGGA GCTCAAGATT GAATTGAAAC AGGGTTTTAA ATCTAGAATC GAAGATGTGA    720

GGGAGGAAAT TTTACGGAAA AGAAGGGCTG GGAAATTACC AGGTGACACA ACTACGGTGC    780

TAAAGAACTG GTGGCAACAA CACTCAAAGT GGCCATACCC AACTGAAGAT GATAAGGCCA    840

AACTTGTGGA GGAAACAGGA TTGCAGCTAA AGCAAATCAA CAACTGGTTC ATCAACCAGA    900

GGAAGCGTAA CTGGCATAGC AACTCTCAAT CTGTCACCTC TTTAAAGTCG AAGCGAAAAC    960

GGTAGAGGTG AATAAATTCA ATGAGAAATG GAGAAGAAGA AAGTTTGAGC ATGTTGATGT    1020

CAACTTCTTG CGGTAAATAG CTGTGGGCTA ACATTTTGTG AAGGTAAAGT GGGAAGTGAG    1080

GTGGTTTCAA GAAACCTAAG TACATAGATT GAGTTTTATA TGGCTTACAT GTTGTTTAGT    1140

GTGTAGAGTG GATTCGAGTT TCTAACAAAG TAAACATACT ATCAGACCTC ATTATTGTGA    1200

TGTATGTCTC ATCAAGCTTA TCGATACCGT CGACCTCGAG GGGG                     1260

2.棉花KNAT7基因编码的蛋白质序列如下：

Met Gln Glu Pro Gly Leu Gly Met Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

 1               5                  10                  15

Ile Gly Gly Leu Ser Ser Gly Glu Val Ser Val Ser Gly Glu Gln Asn Arg

        20                   25                30

Gln Leu Lys Ala Glu Ile Ala Val His Pro Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Ala

 35                 40                  45                 50

Ala His Val Ser Cys Leu Arg Val Ala Thr Pro Ile Asp Gln Leu Pro Leu

             55                  60                  65

Ile Asp Ala Gln Leu Ala Gln Ser His Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Ala Ser

    70                  75                  80                  85

Gln His His Gln His Gly His Ser Leu Ser Pro His Glu Arg Gln Glu Leu

                90                  95                 100

Asp Asn Phe Leu Ala Gln Tyr Leu Ile Val Leu Cys Thr Phe Lys Glu Gln

        105                 110                 115

Leu Gln Gln His Val Arg Val His Ala Ile Glu Ala Val Met Ala Cys Arg

120                 125                130                 135

Glu Ile Glu Asn Asn Leu Gln Ala Leu Thr Gly Val Thr Leu Gly Glu Gly

1           40                  145                 150

Thr Gly Ala Thr Met Ser Asp Asp Glu Asp Asp Met Gln Met Asp Phe Ser

    155                 160                 165                170

Leu Asp Gln Ser Gly Thr Asp Gly His Asp Leu Met Gly Phe Gly Pro Leu

                175                 180                185

Ile Pro Thr Glu Ser Glu Arg Ser Leu Met Glu Arg Val Arg Gln Glu Leu

        190                 195                200

Lys Ile Glu Leu Lys Gln Gly Phe Lys Ser Arg Ile Glu Asp Val Arg Glu

205                 210                215                 220

Glu Ile Leu Arg Lys Arg Arg Ala Gly Lys Leu Pro Gly Asp Thr Thr Thr

            225                230                 235

Val Leu Lys Asn Trp Trp Gln Gln His Ser Lys Trp Pro Tyr Pro Thr Glu

    240                 245                 250                255

Asp Asp Lys Ala Lys Leu Val Glu Glu Thr Gly Leu Gln Leu Lys Gln Ile

                260                 265                270

Asn Asn Trp Phe Ile Asn Gln Arg Lys Arg Asn Trp His Ser Asn Ser Gln

        275                280                 285

Ser Val Thr Ser Leu Lys Ser Lys Arg Lys Arg

290                 295                 300