棉纤维初始发育相关基因及转录因子的克隆与鉴定

摘要

棉纤维是重要的纺织工业原料，在国民经济和人民生活中占有重要的位置。棉花纤维实质上是种皮毛，是由胚珠外珠被上的表皮细胞发育分化而成的一种单细胞结构，是迄今为止发现的最长的植物细胞。作为植物表皮毛发育伸长研究的理想模式植物，科学家们一直致力于发现棉纤维发育的机理。纤维形成的起始期(表皮细胞突起)，决定着种皮细胞是否能发育成为纤维。研究认为一类转录因子(如MYB基因)在这一时期起至关重要的作用。本研究利用棉纤维发育cDNA文库和纤维突变体材料进行棉花起始发育相关基因及转录因子的克隆与鉴定，发掘与棉纤维发育相关的重要基因并阐述棉花中MYB基因的特征与作用。 1.对陆地棉新乡小吉(无绒无絮)和新乡小吉突变体(无绒有絮)开花当天的胚珠材料进行mRNA差异显示(DD-PCR)，分离到8条差异片段。 RT-PCR验证有两条片段为阳性，其中的一条在无纤维材料中不表达、有纤维的材料中表达，可能与纤维的发育有密切的关系。另一条差异片段经过5’方向上的序列延伸后被预测为一个棉花细胞色素P450基因。 2.筛选优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库，分离出三个转录因子基因，并进行序列分析、蛋白功能预测和转录水平研究。GhTF1与MYB转录因子同源，GhTF2与编码锌指蛋白的转录因子同源，GhTF3与编码bZIP的转录因子同源。利用72 35材料不同时期和组织进行表达分析，结果显示GhTF1与GhTF3是组成型表达基因；GhTF2在根、叶中不表达，茎和纤维材料中特异表达，表达量在纤维发育初期最高，并随着时间推移逐渐下降。 3.利用在Genebank中释放的棉花MYB基因设计全长ORF扩增引物，在二倍体材料非洲棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉中扩增其序列，并进行了序列差异分析和SNP研究，发现在基因编码区中序列的变异不大且变异的位点上多数是发生了碱基的替换。利用亚洲棉根、茎、叶和不同纤维发育时期材料进行的转录水平研究发现Ghmyb10、Ghmyb25、Ghmyb36是纤维特异表达基因，且都在纤维发育前期高表达。针对纤维突变体材料的基因表达分析表明，Ghmyb25应该是一个调控棉纤维发育的关键基因。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的140个BC<,1>作图群体，我们将GhTF1，GhMYB6、Ghmyb9和Ghmyb36四个基因分别定位在第10、第11、第15和第16号染色体上。

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第一部分文献综述

1棉花纤维的形成

1.1棉花纤维细胞的发育过程

1.2纤维原始细胞的分化和突起

2棉花的种类和基因型

3棉花纤维发育突变体

4模式植物拟南芥表皮毛发育的研究概况

4.1 MYB-bHLH-WD40蛋白复合体调控表皮细胞分化的命运

4.2拟南芥中调控表皮毛发育的重要基因

5植物中的转录因子基因

5.1 MYB转录因子的结构特征

5.2棉纤维发育相关基因及转录因子的研究进展

第二部分研究报告

引言

1实验材料

1.1植物材料

1.2菌种和质粒

1.3试剂

1.4棉花MYB基因信息

1.5引物

2实验方法

2.1棉花RNA的提取

2.2 RACE步骤

2.3差异显示PCR(DDRT-PCR)

2.4扩增产物的电泳，回收，克隆及测序

2.5 RT-PCR

2.6棉花基因组DNA的提取

2.7 Southern杂交分析

2.8植物表达载体的构建

2.9序列分析与进化树的构建

3结果与讨论

3.1棉纤维突变体的0DPA胚珠mRNA差异显示(DDRT-PCR)

3.2三个转录因子基因的克隆与研究

3.3棉花MYB类基因的结构、表达及染色体定位研究

全文结论

参考文献

致谢