3F3Rmg重组融合蛋白及其制备方法与在犬狂犬病抗体检测中的应用

摘要

本发明公开了一种3F3Rmg重组融合蛋白及其制备方法，该重组融合蛋白由3F3ScFv和Rmg基因拼接而成的3F3Rmg融合基因所编码，具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。它的双功能特性使得其既能与人红细胞结合但不会发生凝集，又能与狂犬病G抗体反应，在抗体桥联作用下发生肉眼可观察到的凝集现象。应用该重组融合蛋白制备的检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒，其操作简单、灵敏度高且特异性强，特别适合犬狂犬病抗体的检测，满足了基层现场使用快速、简便的要求。

说明书

技术领域

本发明涉及犬狂犬病病毒防治诊断领域，尤其是一种3F3Rmg重组融合蛋白及其制备 方法与在犬狂犬病抗体检测中的应用。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的所有温血动物都易感的人兽共患病， 一旦发病，病死率几乎100％，它是人类病死率最高的急性传染病之一。狂犬病病毒G基因 编码的糖蛋白(glycoprotein，GP)是病毒唯一暴露在表面的蛋白，也是唯一既能刺激机 体产生中和抗体又能刺激机体产生细胞免疫的保护性抗原，同时还是狂犬病毒与宿主细胞 受体结合的结构域，并与病毒毒力有关，在狂犬病毒致病和免疫中起着关键的作用。目前， 尚无有效治疗狂犬病的药物，控制狂犬病主要以暴露前和暴露后的免疫为主，因此暴露前 的有效诊断及监测狂犬疫苗接种后是否产生有效的保护抗体，开展疫苗免疫效果评估都显 得十分重要。

用于血清狂犬病毒抗体的检测方法主要有荧光抗体试验(FAT)、酶联免疫吸附试验 (ELISA)、快速荧光灶抑制试验(RFFIT)、荧光抗体病毒中和试验(FAVNT)、小鼠中和试验 (MNT)等，但是，这些检测方法要求较高，需要配备专门的仪器和专业技术人员，检测成 本昂贵，而且耗时相对较长，这极大地限制了其在基层单位的应用。我国幅员辽阔，农村 散养犬较多，在开展狂犬病免疫效果评估中，急需快速、简便、可以现场使用的诊断试剂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种3F3Rmg重组融合蛋白及其制备方法。

本发明要解决的另一技术问题是提供一种上述3F3Rmg重组融合蛋白在制备检测犬狂 犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒中的应用，该试剂盒操作简单、灵敏度高、特异性强， 适合犬狂犬病抗体的检测。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：3F3Rmg重组融合蛋白，由3F3ScFv和 Rmg基因拼接而成的3F3Rmg融合基因所编码。

3F3Rmg融合基因具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。

上述3F3Rmg重组融合蛋白，具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。

上述3F3Rmg重组融合蛋白的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

<1>利用特异性引物分别从pMD-3F3ScFv和pMD-RV-G重组基因中分别扩增出3F3ScFv 和Rmg基因，采用SOE-PCR方法拼接成3F3Rmg融合基因；

<2>将3F3Rmg融合基因插入到原核表达载体pET-Trx中，构建重组质粒 pET-Trx-3F3RmG，转化表达菌株BL21(DE3)PlysS中，在IPTG的诱导下表达出3F3RmG融 合蛋白。

特异性引物为

3F3ScFv-U：cgc gga tcc cag gtg cag ttg gga gtg tca，

3F3ScFv-D：ggt gca tcc ttc atc tat ttc caa ctt tgt ccc cga；

Rmg-U：aca aag ttg gaa ata gat gaa gga tgc acc aat ctg，

Rmg-D：ccg gaa ttc tat aat gcc gtt gaa aat cac。

该制备方法还包括以下步骤：

<3>通过Ni⁺亲和层析纯化、谷胱甘肽法复性、透析和浓缩后获得了具有生物学活性的 3F3Rmg融合蛋白，经红细胞凝集试验证实该融合蛋白既能够与人红细胞结合但不会发生凝 集，又能够与Rmg抗体反应，具有双功能特性。

人红细胞为人A型、B型、AB型、O型红细胞。

上述3F3Rmg重组融合蛋白在制备检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒中的 应用。

检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒，该诊断试剂盒包括0.2ug/ul的重组 融合蛋白的诊断液和2％的人红细胞溶液。

该诊断试剂盒每剂包括诊断液50ul和人红细胞溶液20ul。

1988年，Kemp等首先报道了建立检测HIV抗体的自体红细胞凝集试验快速检测方法。 只需采集待检人一滴血，5min内即可得知结果，操作程序简单，目测诊断结果，无需昂贵 的特殊仪器和专门人员。其基本原理是：以红细胞作为指示剂，利用重组双功能融合蛋白 既能与红细胞结合又能与被检抗体/抗原结合，通过被检样品中抗体/抗原的桥联作用，使 红细胞发生肉眼可见的凝集，根据红细胞的凝集情况即可快速进行结果判定。基于上述原 理，本发明获得了具有双功能特性的狂犬病病毒3F3Rmg重组融合蛋白，它由抗人红细胞 表面抗原单链抗体基因(3F3ScFv，见序列表SEQ.ID.No.7的碱基序列)和犬狂犬病病毒G 基因主要抗原表位区基因(Rmg，见序列表SEQ.ID.No.8的碱基序列)拼接而成的3F3Rmg 融合基因所编码。3F3Rmg重组融合蛋白既能与人红细胞结合但不会发生凝集，又能与狂犬 病G抗体反应，在抗体桥联作用下发生肉眼可观察到的凝集现象。应用该重组融合蛋白， 发明人又制备了检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒，其操作简单、灵敏度高且 特异性强，特别适合犬狂犬病抗体的检测，满足了基层现场使用快速、简便的要求。

具体实施方式

一、3F3Rmg重组融合蛋白的制备

1.重组PCR引物设计(引物均由北京博迈德公司合成)

根据重叠延伸PCR的原理和狂犬病毒G基因与3F3ScFv基因序列，设计4条重组PCR 引物(见表1)。其中引物3F3ScFv-U/3F3ScFv-D用于扩增合成3F3ScFv基因，引物 Rmg-U/Rmg-D用于扩增合成Rmg基因。3F3ScFv 3’末端15个碱基(ggt gca tcc ttc atc) 和Rmg 5’端15个碱基(aca aag ttg gaa ata)为互补序列用于基因的拼接，拼接顺序 为3F3Rmg。3F3ScFv-U中“gga tcc”和Rmg-D中“gaa ttc”的部分为引入的BamHI、EcoRI 酶切位点。

表13F3ScFv、Rmg基因引物序列

2.3F3Rmg融合基因原核表达载体的构建及鉴定

从pMD-3F3ScFv和pMD-RV-G重组基因中分别扩增出3F3ScFv和Rmg基因。PCR扩增条 件均为：95℃5min，95℃1min，60℃1min，72℃70s，30个循环，最后72℃10min。 以纯化后的3F3ScFv和Rmg基因为模板，采用(SOE)PCR方法拼接成3F3Rmg融合基因(见 序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列)。第一轮PCR反应体系为：3F3ScFv和Rmg基因各0.5μL、 10×Buffer 2.5ul、5U/ul kod-plus高保真酶0.5ul，10mmol/L dNTPs 2.5ul、用灭 菌双蒸水加至总体积25ul。PCR反应条件为：95℃5min，95℃1min，60℃1min，72℃2min， 7个循环。反应结束后，在反应体系中加入引物3F3ScFv-U和Rmg-D各0.5ul，然后95℃ 5min；95℃1min，60℃1min，72℃2min，30个循环；最后72℃10min。将PCR产物 纯化回收后与pMD18-T Simple载体连接，转化DH_5α感受态细胞，提取质粒，经PCR及BamHI、 EcoRI双酶切鉴定后送检测序。测序正确后将融合基因3F3Rmg克隆至原核表达载体 pET-Trx中，构建了原核表达质粒pET-Trx-3F3Rmg。

3.3F3Rmg融合基因的诱导表达

将鉴定正确的pET-Trx-3F3Rmg原核表达质粒转化入BL21(DE3)PlysS中进行诱导表 达，表达后经SDS-PAGE电泳，用BandScan软件测定目的蛋白(见序列表SEQ.ID.No.2的 氨基酸序列)相对含量为23.5％。取诱导表达菌液500ml用溶菌酶30℃作用30min后用细 胞破碎仪破碎处理，收集沉淀，沉淀用1mol/L NaCl洗涤后，再用5.0g/L Tritonx-100 洗涤，依次洗涤两遍后再用8mol/L尿素溶解12h，12000rpm离心15min，得到50ml上清 液。

4.3F3Rmg融合蛋白的纯化与复性

将50ml上清液采用Ni⁺亲和层析法和谷胱甘肽再氧化法对融合蛋白进行纯化和复性， 复性24h后，用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)透析48h，每6h换液一次；用PEG20000浓 缩复性蛋白30ml，并用BCA蛋白定量试剂盒测定浓度1.7mg/ml。

二、3F3Rmg重组融合蛋白双功能特性的验证

分别取犬狂犬病阴、阳性血清各7份，每孔取50μL滴加于血凝板中，再滴加50μL/ 孔3F3Rmg重组融合蛋白(0.2ug/ul)，最后每孔加入20μL 2％O型人红细胞进行红细胞 凝集试验，结果7份阳性血清均可观察到强凝集现象，而7份RV阴性血清未观察到凝集 现象。同时采用50μL/孔3F3Rmg重组融合蛋白(0.2ug/ul)分别与2％O、A、B、AB 型人红细胞(20μL/孔)均匀混合后加入标准犬狂犬病阳性血清，30min后观察结果，结果各 种血型均可观察到强凝集现象。

结论：经红细胞凝集试验证实该融合蛋白既能够与人不同血型红细胞结合，又能够与 Rmg抗体反应，具有双功能特性。

三、检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断试剂盒

1.诊断试剂盒的装配

将上述1.7mg/ml的重组融合蛋白溶液按1∶8稀释成浓度0.2ug/ul的重组融合蛋白的 诊断液。

配制浓度2％的人红细胞溶液。

该诊断试剂盒每剂包括上述诊断液50ul和人红细胞溶液20ul。

2.诊断试剂盒的使用方法及诊断结果判断

每孔取50ul生理盐水滴于96孔血凝板中，于第1孔滴加50ul被检血清，同时设阳 性对照(标准阳性血清)和阴性对照(标准阴性血清)；混匀3-5次后取出50ul混合液到 第2孔，这样倍比稀释到最后一孔，多余的液体弃去；然后滴加50ul重组融合蛋白诊断 液，最后加入20ul 2％的人红细胞溶液，30min内观察结果；以50％红细胞发生凝集作为判 定标准，血凝价大于或等于1∶16(相当于荧光抗体病毒中和试验中和效价0.5IU/m1)为免 疫抗体合格，血凝价小于1∶16为免疫抗体不合格。

3.诊断试剂盒的临床应用实例

用上述诊断试剂盒检测犬血清1075份，结果有556份免疫抗体大于或等于1∶16，519 份免疫抗体小于1∶16。择取50份样本测试结果列表(表2)如下：

表2本发明诊断试剂盒检测狂犬病免疫抗体结果

FAVA试验系荧光抗体病毒中和试验，它是国际兽医局(OIE)推荐的检测方法；狂犬病 抗体中和效价≥0.5IU/ml为阳性。