具有提高的L-缬氨酸生产能力的微生物及利用该微生物生产L-缬氨酸的方法

摘要

本发明涉及具有提高的L-缬氨酸生产能力的微生物及利用该微生物生产L-缬氨酸的方法。更具体地，本发明涉及耐L-缬氨酸及其衍生物，从而具有提高的L-缬氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变株，以及利用该微生物生产L-缬氨酸的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及具有提高的L-缬氨酸生产能力的微生物及利用该微生物生产L-缬氨酸的方法。 

背景技术L-氨基酸应用于人类医学中，特别是用于制药工业、食品工业和动物营养等。具体而言，支链氨基酸是指九种必需氨基酸中的三种氨基酸：L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸。不同于主要在肝脏中代谢的其它氨基酸，支链氨基酸主要在肌肉组织中代谢，并作为运动时的能量来源。由于已知支链氨基酸在运动过程中对肌肉的维护和生长发挥了重要作用，它们的用途也越来越多。具体来说，L-缬氨酸被用作饲料成分，因为据报道，L-缬氨酸可高效降低功耗并且有助于改善母猪的泌乳性能。L-缬氨酸也被用于医疗目的的输液和氨基酸复合物，以及用于保健品和饮料添加剂。 

棒形细菌是用于生产L-氨基酸的代表性微生物，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。由于棒形细菌在工业生产中的重要性，利用该微生物生产L-氨基酸的方法在不断地进行改进。例如，正在改善与搅拌和通入氧气有关的方法，或改善在发酵过程中培养基的组成如糖浓度。为了改善这些微生物的L-氨基酸生产能力，筛选和突变体筛选的方法被广泛使用。例如，有一种筛选和利用耐抗代谢药物的微生物的方法，，所述抗代谢药物为如异亮氨酸衍生物，异亮氨酸羟肟酸(Kisumi M等，(1972)细菌学杂志(Journal of Bacteriology)110：761-763)，L-缬氨酸衍生物，2-噻唑丙氨酸(Tsuchida T等，(1975)农业和生物化学(Agricultural and Biological Chemistry)，日本39：1319-1322)或亮氨酸衍生物，α-氨基丁酸酯(Ambe-Ono Y等，(1996) 生物科学，生物技术与生物化学(Bioscience Biotechnology Biochemistry)60：1386-1387)，或为与调节相关的代谢产物的营养缺陷型以及生产L-氨基酸(Eva Radmacher等，(2002)应用和环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology)，卷.682246-2250页)。 

同时，支链氨基酸之一的L-缬氨酸，在微生物中从丙酮酸开始经过乙酰乳酸、二羟基异戊酸和酮异戊酸进行生物合成。这些中间代谢产物是通过乙酰羟酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶和转氨酶B的催化活性而产生的。然而，这些酶也参与从酮基丁酸和丙酮酸开始的L-异亮氨酸的生物合成，且L-亮氨酸也从中间代谢产物，酮异戊酸经过2-异丙基苹果酸、3-异丙基苹果酸和酮基异己酸生物合成。因此，由于支链氨基酸，即L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的生物合成途径中使用的酶是相同的，很难通过工业发酵只生产一种支链氨基酸。此外，由于终产物L-缬氨酸或其衍生物导致反馈抑制的发生，使得L-缬氨酸的工业化大规模生产变得困难。 

为解决这些问题，已经进行了许多研究以开发耐L-缬氨酸或其衍生物的生产L-缬氨酸的微生物，用于生产L-缬氨酸，例举的方法有，使用耐D，L-氨基丁酸的微生物的方法(日本专利公开号S63-160592)，使用耐噻唑丙氨酸以及亮氨酸、异亮氨酸或苏氨酸营养缺陷型的微生物的方法(日本专利公开号S52-116)，使用耐氨乙基半胱氨酸的微生物的方法(日本专利公开号S58-2678)，使用在补加乙酸的培养基中耐L-缬氨酸且在补加葡萄糖的培养基中对丙酮酸敏感的微生物的方法(美国专利号5,521,074，韩国专利号1995-0005133)，使用耐聚酮的微生物的方法(韩国专利号1996-0016871)等。 

然而，目前开发的生产L-缬氨酸的微生物只对L-缬氨酸或其衍生物的单一种类物质或有限物质具有抗性，因此仍然有必要开发对参与L-缬氨酸生物合成的反馈调控的各种物质具有抗性的生产L-缬氨酸 的微生物。 

基于这些原因，本发明人已付出许多努力去开发较其它常规菌株高产L-缬氨酸的微生物。结果是，他们发现了从谷氨酸产生菌获得的突变株可高产L-缬氨酸，并对多种L-异亮氨酸衍生物和L-缬氨酸衍生物，具体为α-氨基丁酸(ABA)、α-羟基缬氨酸(AHV)、噻唑丙氨酸(TA)和正缬氨酸(NV)具有抗性，从而完成了本发明。 

发明概述 

本发明的目的是提供生产L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株KCCM11201P。 

本发明的另一目的是提供利用该突变株生产L-缬氨酸的方法。 

附图说明

图1为本发明以L-缬氨酸为终产物的生物合成途径。 

优选实施方案详述 

在一个实施方案中，本发明提供生产L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株KCCM11201P。 

本文中使用的术语“L-缬氨酸”是指化学式为(CH₃)₂CHCH(NH₂)COOH的L-氨基酸，其为人体必需的氨基酸之一，与L-亮氨酸和L-异亮氨酸一起在结构上属于支链氨基酸。 

同时，微生物的L-缬氨酸生物合成示于图1，其中L-缬氨酸是从丙酮酸起始经过乙酰乳酸、二羟基异戊酸和酮异戊酸进行生物合成。此外，该生物合成途径是由酶如乙酰羟酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶和转氨酶B催化的。然而，这些酶被同样地用于支链氨基酸，即L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的生物合成途径，因而通过工业发酵很难只生产一种支链氨基酸。尤其是终产物L-缬氨酸或其衍生物导致反馈抑制的发生，使得很难进行工业化大规模生产L-缬氨酸。为了解决这个问题，本发明的突变株是一种耐L-缬氨酸或其 衍生物的新微生物，以消除反馈抑制从而具有提高的L-缬氨酸生产能力。 

优选地，本发明的突变株可对缬氨酸或其衍生物、异亮氨酸或其衍生物具有抗性。

本文中使用的术语“衍生物”是指已知的诱导与终产物L-缬氨酸生物合成相关的反馈抑制，从而减少微生物生产L-缬氨酸的产量的化合物，L-异亮氨酸衍生物的实例可以是α-氨基丁酸和L-缬氨酸衍生物，α-羟基缬氨酸、噻唑丙氨酸、正缬氨酸等，但不限于此。优选地，突变株可对选自下组的一种或多种物质具有抗性：缬氨酸、α-氨基丁酸、α-羟基缬氨酸、噻唑丙氨酸和正缬氨酸。更优选地，其可对所有的缬氨酸、α-氨基丁酸、α-羟基缬氨酸、噻唑丙氨酸和正缬氨酸具有抗性。 

一般来说，已知当L-缬氨酸在细胞中积累到一定程度时，L-缬氨酸生物合成受到抑制。因此，耐受该衍生物的菌株缓解了L-缬氨酸的抑制，从而甚至可以高浓度生产。根据本发明的一个实施方案，发明人采用了一种筛选通过利用该衍生物能够产生高水平L-缬氨酸的微生物的方法。此外，由于L-异亮氨酸是一种其生物合成途径与L-缬氨酸生物合成途径相同的氨基酸，通过分析菌株是否获得了异亮氨酸衍生物抗性，也可筛选出能够产生高水平L-缬氨酸的菌株。因此，异亮氨酸衍生物也可用于筛选能够产生高水平L-缬氨酸的菌株。 

根据本发明，具有提高的L-缬氨酸生产能力的突变株选自进行了突变的亲本菌株。在这方面，微生物突变可采用本领域广泛公知的各种技术来诱导，并可以使用任何一种物理和化学诱变因子。适合本发明的化学诱变因子的实例包括N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、二环氧丁烷、乙基甲烷磺酸盐、芥菜类化合物(mustard compounds)、肼和亚硝酸，但不限于此。此外，物理诱变因子的实例可包括紫外线和γ射线，但不限于此。 

进行诱导突变时，亲本菌株在足以留下相当数量的存活群体的强度下受到诱变因子的影响。该数量的变化取决于诱变因子的类型，并取决于在给定杀灭率下存活群体中诱导的突变体的数量。例如，NTG所需的杀灭率应留下约10％-50％的初始群体。亚硝酸诱变应留下约0.01％-0.1％的初始群体，以及紫外线诱变应留下约1.0％。根据本发明的一个实施方案，为了制备具有提高的L-缬氨酸生产能力的突变株，NPG被用于诱导亲本菌株的突变。 

在本发明的一个实施例中，生产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌KFCC-10661(韩国专利公开号1990-007948)被用作亲本菌株，以制备具有提高的L-缬氨酸生产能力的突变株，这是由于在L-缬氨酸生物合成中需要1分子(molecule)谷氨酸的特性。因此，对作为亲本菌的产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌KFCC-10661进行随机突变，并将该微生物涂布于添加异亮氨酸衍生物、α-氨基丁酸(ABA)和缬氨酸衍生物、α-羟基缬氨酸(AHV)、噻唑丙氨酸(TA)和正缬氨酸(NV)的基本培养基上。随后，挑选出在各浓度即20mM、20mM、40mM和50mM下对该衍生物具有共同抗性(common resistance)的突变株，命名为谷氨酸棒杆菌CA08-0072。进一步地，据证实，具有共同抗性的L-缬氨酸突变株的L-缬氨酸产量是亲本菌株的4倍或更高(见表1)。谷氨酸棒杆菌突变株CA08-0072保藏于国际保藏机构，韩国微生物菌种保藏中心，其位于361-221，弘济-1-洞(Hongje-1-dong)，西大门区(Seodaemon-gu)，首尔，韩国，保藏日期2011年7月13日，保藏号KCCM11201P。 

在另一个实施方案中，本发明提供生产L-缬氨酸的方法，其包括在培养基中培养所述突变株的步骤。 

优选地，生产L-缬氨酸的方法可进一步包括从突变株的培养基中回收L-缬氨酸的步骤。 

本文中使用的术语“培养”是指在人工控制的条件下培养微生物。 在本发明中，培养产L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌CA08-0072突变株(KCCM11201P)的方法可根据本领域公知的谷氨酸棒杆菌的培养方法进行。具体来说，培养方法的实例包括分批培养、连续培养和补料分批培养，但不限于此。这些不同的方法公开于，例如，“生化工程”(James M.Lee，Prentice-Hall International Editions，138-176页，1991)等。 

用于培养的培养基必须满足特定菌株培养的要求。已有棒状杆菌菌株培养基的描述(例如，普通细菌学方法手册(Manual of Methods for General Bacteriology)，美国微生物学会，华盛顿，美国，1981)。可能的碳源可包括糖和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，油和脂肪如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，以及有机酸如乙酸。这些物质可单独使用或作为混合物使用。可能的氮源可包括蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独使用或作为混合物使用。可能的磷源可包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的钠盐。此外，培养基中必须包括生长所必需的金属盐类如硫酸镁和硫酸铁。除上述物质之外，可包括必需的生长物质，如氨基酸和维生素。可在培养基中添加适当的前体。在培养过程中，可适当向分批培养或连续培养的培养基中补充上述物质。 

可通过适当地加入碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾和氨水，或酸性化合物如磷酸和硫酸来调节培养基的pH值。可通过使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制气泡产生。为了保持有氧的条件，可将氧气或含氧气体(例如，空气)注入培养基中。一般情况下，培养基的温度是20-45℃。培养可一直持续，直到L-缬氨酸的产量达到理想水平。这个目的通常在10-160小时内实现。L-缬氨酸可释放到培养基中或包含在细胞内。 

本发明生产L-缬氨酸的方法，包括从细胞或培养基中回收L-缬氨酸的步骤。从细胞或培养基中回收L-缬氨酸的方法可采用本领域已知的常规方法，例如，离心、过滤、阴离子交换层析、结晶和HPLC，但不仅限于此。根据本发明的一个实施方案，将经低速离心培养基而去除生物质后获得的上清液，通过离子交换层析分离。 

以下将参考下面的实施例对本发明进行详细描述。然而，这些实施例仅用于说明目的，并非用来限制本发明。 

实施例1：通过人工诱变筛选突变株 

为了获得具有提高的L-缬氨酸生产能力的突变株，采用下面的方法诱导微生物的突变。 

具体来说，先将亲本菌株，产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌KFCC-10661(韩国专利公开号1990-007948)在活化培养基中活化培养16小时，再使其在121℃灭菌15分钟的种子培养基中培养14小时。然后，收集5mL培养基并用100mM柠檬酸缓冲液洗。向其中加入NTG(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)至终浓度为200mg/L。20分钟后，用100mM磷酸盐缓冲液洗。将用NTG处理后的菌株涂布于基本培养基上，测定死亡率。结果是，死亡率为85％。 

为了获得对α-氨基丁酸(ABA)、α-羟基缬氨酸(AHV)、噻唑丙氨酸(TA)和正缬氨酸(NV)具有共同抗性的突变株，将用NTG处理后的菌株涂布于含ABA、AHV、TA和NV的基本培养基上至终浓度分别为20mM、20mM、40mM和50mM。然后，将菌株在30℃培养5天，获得对ABA、AHV、TA和NV具有共同抗性的突变株。 

获得的突变株命名为谷氨酸棒杆菌CA08-0072，保藏于韩国微生物菌种保藏中心，保藏日期2011年7月13日，保藏号KCCM11201P。 

实施例1和2中使用的培养基组成如下： 

<活化培养基> 

牛肉提取物1％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，酵母提取物1％，琼脂 2％，pH值7.2 

<种子培养基> 

葡萄糖5％，细菌蛋白胨1％，氯化钠0.25％，酵母提取物1％，尿素0.4％，pH值7.2 

<基本培养基> 

葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，硫胺素0.001％，生物素200μg/L，琼脂2％，pH值7.0 

实施例2：生产L-缬氨酸的突变株的L-缬氨酸生产能力检测 

将实施例1中获得的，对高浓度ABA、AHV、TA和NV具有共同抗性的谷氨酸棒杆菌CA08-0072(KCCM11201P)通过下面的方法培养，以检测其L-缬氨酸的生产能力。 

将亲本菌株谷氨酸棒杆菌KFCC-10661和突变株分别接种到含25ml种子培养基的250ml角挡板烧瓶(corner baffle flasks)中，在30℃，200rpm摇床培养20小时，以获得种子培养基。此后，将1ml各自种子培养基接种到含有24ml下述生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃，200rpm摇床培养72小时，生产L-缬氨酸。 

实施例2中使用的生产培养基组成如下： 

<生产培养基> 

葡萄糖5％，硫酸铵2％，磷酸二氢钾0.1％，七水硫酸镁0.05％，CSL(玉米浆)2.0％，生物素200μg/L，pH值7.2 

培养完成后，采用高速液相色谱法测定产生的L-缬氨酸的量。实验菌株培养基中的L-缬氨酸浓度列于下表1中。 

表1：谷氨酸棒杆菌CA08-0072(KCCM11201P)L-缬氨酸生产能力的比较 

如表1中所示，亲本菌株谷氨酸棒杆菌KFCC-10661产生了0.5g/L的L-缬氨酸，而本发明的突变株谷氨酸棒杆菌CA08-0072产生了 2.1g/L的L-缬氨酸，表明其L-缬氨酸的生产能力是亲本菌株的4倍左右或更高。 

上述结果表明，具有耐L-缬氨酸、L-异亮氨酸及它们的衍生物的突变株不受反馈抑制的影响，从而高效而高产量地生产L-缬氨酸。 

发明效果 

本发明的棒形微生物对L-缬氨酸、L-异亮氨酸及它们的衍生物具有抗性，从而不受L-缬氨酸反馈抑制影响，因此具有提高的L-缬氨酸生产能力。因此，用本发明的微生物生产L-缬氨酸的方法可用于高效而高产量地生产L-缬氨酸。