彩色小麦籽粒色素含量无损检测方法

摘要

本发明涉及一种

说明书

技术领域

本发明涉及一种彩色小麦籽粒色素含量无损检测方法，属于生物学领域生理学科。

背景技术

彩色小麦是指籽粒果种皮或者糊粉层颜色与普通粒色小麦不同的小麦。彩色小麦与普通小麦相比，最直观的区别是粒色较深。目前已经报道的彩色小麦有紫粒、黑粒、蓝粒、蓝紫粒、绿粒等。彩色小麦是育种家采用“化学诱变”“物理诱变”和“远缘杂交”“基因导入”等育种方法，经过多年的精心选育而创造出来的。国外在1913年就已报道了不育的六倍体黑小麦，在1938年报道了可育的六倍体黑小麦。国内在1982年报道了著名小麦育种家李振声等从长穗偃麦草和普通小麦的杂交后代中获得了蓝粒小麦。但是，到目前为止，彩色小麦品种少，且单一，用于农业生产的品种就更少。 为了丰富小麦种质资源，促进小麦品种的多元化发展，满足人们对小麦制品的营养特色需求，所以，必须对彩色小麦的种质资源、籽粒色素遗传等展开深入研究。但是，目前关于彩色小麦的研究多仅限于彩色小麦的品质研究，而对于彩色小麦的粒色遗传研究较少。由于彩色小麦品种较少，且多为种质资源保存，种子量少；加之彩色小麦的遗传研究需要多个世代的种子，早代种子量少，每一粒种子包含一类基因型，破坏一粒种子就减少了育种的一个选择机会。因此，对彩色小麦色素遗传研究的同时，也需要保护彩色小麦籽粒的完整性，所以，这种无损检测彩色小麦籽粒色素含量的技术正满足了这种需要。

据研究表明，彩色小麦籽粒中各类营养成分含量均显著高于白粒小麦。彩色小麦富含蛋白质、氨基酸以及碘、硒、钙、铁、锌等多种微量元素或矿物质，具有较高的营养保健价值。彩色小麦籽粒中富含然天然色素，其中以花青素类色素为主。花青素是一类水溶性色素，具有维持血管正常渗透压，减少血管脆性，扩张冠状动脉及抗氧化、 抗突变、抗癌等多种保健功能。同时，天然色素具有纯天然、色泽鲜艳、对人类安全无毒，对食品饮料有较强的着色性及稳定性，可直接用于食品、医药、化妆品等行业。但是，由于不同品系间彩色小麦籽粒所含的色素种类和含量存在着显著差异，在不同条件下种植的小麦籽粒色素的积累也会发生变化。因此，在小麦籽粒上呈现出了不同的颜色及深浅。在彩色小麦籽粒色素含量的研究中，通常采用酸化乙醇法提取彩色小麦麸皮色素。但是用此方法提取色素必须破坏种子，导致经过色素含量测定的籽粒不能进行下一步的研究。因此，无损检测彩色小麦籽粒色素含量不仅保证了彩色小麦籽粒的完整性，而且还保证了彩色小麦籽粒进行下一步的研究或者应用。

综上所述，彩色小麦具有较高的营养品质和良好加工品质，因此，优良彩色小麦品种的选育和应用研究日益受到人们的重视，成为近20年来我国育种工作的一个研究方向。彩色小麦一旦在小麦生产上大面积推广种植，开发成系列的彩色保健食品批量上市，对带动种植业结构调整，促进食品多元化和加工业的发展以及生化药品业的发展具有重要作用。所以，开展彩色小麦籽粒色素研究，无论对人类的生活，还是对小麦育种均具有重要的意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种彩色小麦籽粒色素含量无损检测方法。彩色小麦籽粒特有的营养成分种类和含量与其颜色的深浅有一定的相关性，因此，通过无损测量彩色小麦籽粒色素含量即可反映该籽粒营养价值。用于彩色小麦育种的早代选择和籽粒色素的遗传研究。这种方法是建立在一个直接测量彩色小麦籽粒灰度值的基础上，通过利用数学模型计算而获得彩色小麦籽粒色素含量的方法。

一种彩色小麦籽粒色素含量无损检测方法，是通过以下步骤实现的：

A1：随机选取一定数量的待测彩色小麦种子，并分别对籽粒进行编号，将其放置在扫描仪上。为了使获得的图像大小相同，且整齐，同时都能显示出小麦腹沟的位置。放置时使籽粒间的距离大致相同，籽粒腹沟向下整齐放置，获得整体扫描图像。

：依据每粒籽粒测定形状大小且包含小麦腹沟的原则，利用计算机软件设置网格线间隔和子网格，确定一个测定区域，依次测定每粒小麦种子的灰度值Xg。

本步骤所述的计算机软件采用的是Photoshop CS4。

：利用酸化乙醇法提取经过A2测定灰度值后的彩色小麦籽粒单粒的色素。单粒籽粒编号与A2中测定灰度值的编号相同，即灰度值测定编号为“1”的籽粒，酸化乙醇法提取时亦编号为“1”，以此类推。

利用酸化乙醇方法提取彩色小麦籽粒色素的步骤是：

① 用感量为万分之一的天平称量彩色小麦籽粒单粒粒重（m/g）并编号记录。

② 准备10ml 95％乙醇与1.5 mol/L盐酸的混合液（85:15）。

③ 将称重后的彩色小麦单粒籽粒于研钵中，加入少许95％乙醇与1.5mol/L盐酸的混合液，进行充分研磨，转移至试管，然后分次加入混合液，使剩余的研磨物全部转移至试管。

④ 最后将10ml混合液的剩余部分全部倒入试管，在室温下充分振荡。

⑤ 将试管置于60℃水浴中提取5h。

⑥ 转速4 800 r/min离心10 min，将上清液转移至另一试管中。

：用紫外分光光度计测定提取液530nm处的吸光度值：

取步骤A3得到的上清液于比色皿中，用UV - 2450型紫外分光光度计测定530nm处的吸光度值。重复三次，取其平均值作为该籽粒色素提取液的吸光度值。

：根据比吸光度法，计算彩色小麦籽粒色素含量E。

我国食品添加剂标准化委员会建议采用比吸光度 E^1%_1cm ( λmax)表示色素含量：

E = A / m     式中:  

A — A4步骤得出的吸光度值/10；

m — 样品质量/g（即A3步骤中称量的单粒彩色小麦粒重）。

按照A3—A5所述的步骤根据彩色小麦的编号依次测定、计算每粒小麦的色素含量E。

：建立彩色小麦籽粒灰度值与色素含量的数学模型。

根据生物统计学中相关分析的原理，若一变量随另一变量的变化呈接近等比例的形式变化，则称两变量间呈线性相关。两变量之间存在相关关系的密切程度，可以用相关系数来度量。

             相关系数                                                 

相关系数绝对值的大小反映了变量之间关系的密切程度，而相关系数的正负反映了相关关系的性质。彩色小麦籽粒灰度值与色素含量之间存在负相关，当负相关达到显著水平时，其负相关才有意义。那么，这个负相关是否显著，需要进行显著性检验。只有当样本较大时，才能采用t检验方法检验相关系数r的显著性。显著性检验说明彩色小麦籽粒灰度值Xg与色素含量E两者间呈极显著相关。因此，可以建立彩色小麦籽粒灰度值与色素含量值之间的一元线性回归模型，即可得出彩色小麦的色素含量Eg。 

为使酸化乙醇法测出的彩色小麦籽粒色素含量与根据灰度值利用回归模型计算得出的色素含量相区别，将根据灰度值利用回归模型计算得出的色素含量定义为Eg。

Eg=b+aXg

式中a、b的计算：将按照步骤A2至 A5测出的小麦籽粒灰度值Xg与色素含量E（酸化乙醇法测得）代入下列公式计算回归系数a和常数项b：

根据生物统计学，得回归系数         常数项

             

本步骤中相关系数r、回归系数a、常数项b的计算所涉及的x为灰度值Xg，y为色素含量E。

本发明提供的彩色小麦籽粒色素含量无损检测方法是，首先进行籽粒图像采集，然后测定籽粒特定部位的灰度值，将灰度值输入数学模型，经过计算，即得到该粒种子的色素含量。

本发明的依据是测量的彩色小麦籽粒的灰度值与该籽粒色素含量呈极显著负相关。即随着彩色小麦籽粒颜色的加深，其灰度值减小。通过这种显著的负相关关系，建立了一种通过测定彩色小麦籽粒的灰度值而表示出色素含量的数学模型。

利用本发明，只需建立不同颜色彩色小麦灰度值与色素含量的数据模型，便可仅测定该种彩色小麦籽粒的灰度值而计算出其色素含量。该方法与酸化乙醇法相比，可以在不破坏种子的前提下，快速测定单粒彩色小麦籽粒色素含量。这保证了彩色小麦籽粒的完整性，以便下一步进行彩色小麦的研究与应用；同时，该方法还具有使用仪器少，步骤简单、快捷特点，减少了由于破碎籽粒、研磨提取等试验过程中操作造成的测定误差。

附图说明

图1 彩色小麦籽粒灰度值（Xg）与色素含量（E）之间关系的散点图

由散点图可以看出两变量间存在的数量关系可以用一条直线来描述。

具体实施方式

以下实施方式用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：

本实施例选取的彩色小麦样品为红紫粒小麦与普通粒色小麦杂交产生的F2代粒色分离群体，该群体粒色变异范围从比普通粒色小麦稍深的红色至红紫色。这有利于验证发明的适用范围。

．红紫粒小麦的图像获取

选取155粒红紫粒小麦籽粒并分别对籽粒进行编号，然后均匀的放置在扫描仪上，获得扫描图像。在测量彩色小麦籽粒灰度值时，外界条件对灰度值的影响较大。本测定在外界光源等条件基本一致的条件下进行，以消除因外界环境不同而造成灰度值测量的误差。在扫描仪上放置彩色小麦籽粒时，应将籽粒放置整齐，籽粒间的距离大致相同；籽粒腹沟向下。前者使扫描的图像大小基本一致，便于分析；后者使扫描出的图像都包含小麦籽粒的腹沟位置，以便对彩色小麦籽粒相同部位的灰度值进行比较。

．红紫粒小麦的灰度值测定

利用计算机软件（Photoshop CS4）对扫描图像里的每粒小麦特定部位进行灰度值测量。

具体灰度值测量的步骤如下：

（1） 将图像打开至一定的大小。

（2） 打开“编辑”，找到“首选项”窗口，在窗口中选择“参考线、网格、切片”，在出现的窗口中设置网格线间隔、子网格大小，然后点击“确定”。

（3）显示网格，在图像中选取单个网格，确定一个测定区域，把测定区域拖动至小麦的腹沟部位，使测定区域尽量包含小麦的腹沟。

（4） 点击“分析”，然后选择“数据点”，点击“自定义”，在出现的窗口中选择“灰度值最大值”、“灰度值最小值”、“灰度值平均值”，然后点击“确定”。

（5） 打开测量窗口，点击“记录测量”。

（6） 导出，存入计算机。

（7） 同法，再做两次重复，保证每个籽粒做3次重复。

（8）依次完成籽粒灰度值测定，取三次灰度值的平均值为籽粒灰度值Xg。

利用酸化乙醇法提取经过步骤A2测定灰度值后的红紫粒小麦籽粒单粒的色素。单粒籽粒编号与步骤A2中测定灰度值的编号相同，即灰度值测定编号为“1”的籽粒，酸化乙醇法提取时亦编号为“1”，以此类推。

利用酸化乙醇方法提取彩色小麦籽粒色素的步骤是：

① 用感量为万分之一的天平称量彩色小麦籽粒单粒粒重（m/g）并编号记录。

② 准备10ml 95％乙醇与1.5 mol/L盐酸的混合液（85:15）。

③ 将称重后的彩色小麦单粒籽粒于研钵中，加入少许95％乙醇与1.5mol/L盐酸的混合液，进行充分研磨，转移至试管，然后分次加入混合液，使剩余的研磨物全部转移至试管。

④ 最后将10ml混合液的剩余部分全部倒入试管，在室温下充分振荡。

⑤ 将试管置于60℃水浴中提取5h。

⑥ 转速4800 r/min离心10 min，将上清液转移至另一试管中。

用紫外分光光度计测定提取液530nm处的吸光度值

取上清液于比色皿中，用UV - 2450型紫外分光光度计测定530nm处的吸光度值。重复三次，取其平均值作为该籽粒色素提取液的吸光度值。

根据比吸光度法，计算彩色小麦籽粒色素含量E。

E = A / m     式中:  

A — 步骤A4中得出的吸光度值/10；

m — 样品质量/g（即A3步骤中称量的单粒彩色小麦粒重）。

按照彩色小麦的编号根据步骤A3—A5依次测量计算每粒小麦的色素含量。

. 根据生物统计学中相关分析的原理，若一变量随另一变量的变化呈接近等比例的形式变化，则称两变量间呈线性相关。两变量之间存在相关关系的密切程度，可以用相关系数来度量。

                   相关系数  

将步骤A2实测的每粒红紫粒小麦籽粒灰度值Xg（x）与A3—A5步骤所测的色素含量E（y），以及分别由x、y计算得到的x²、y²和xy值列于表1：

 表1

籽粒编号xx²yy²xy145.552074.800.180.038.20243.291874.020.170.037.36346.012116.920.130.025.98 ┋┋┋┋┋ ┋┋┋┋┋ ┋┋┋┋┋15343.821920.190.180.037.8915445.302052.090.180.038.1515548.752376.560.170.038.287982.67423783.6220.162.721019.25

利用表1中数据和上述公式计算得到相关系数r=-0.540。

 

                       

相关系数绝对值的大小反映了变量之间关系的密切程度，而相关系数的正负反映了相关关系的性质。r=-0.540说明红紫色小麦籽粒灰度值与色素含量之间存在负相关。当负相关达到显著水平时，其负相关才有意义。那么，这个负相关是否显著，需要进行显著性检验。只有当样本较大时，才能采用t检验方法检验相关系数r的显著性。

为涵盖籽粒颜色的变化范围，采用大样本，本实施例选用的样本数为155。所以，可以采用t检验方法检验相关系数r的显著性。

相关系数r=，n=155。假设H₀：ρ=0，检验统计量 

               

代入数值

             

T_∞0.01(双侧)=2.576，t>t_0.01，即P<0.01，拒绝H₀

说明彩色小麦籽粒灰度值Xg与色素含量E两者间呈极显著相关。

. 建立彩色小麦籽粒灰度值与色素含量的数学模型

由上述两个变量的相关系数表明，这一对数据存在内在联系。因此，用表1中数据做出散点图（图1），直观的表示彩色小麦籽粒灰度值与色素含量之间的关系。

在散点图中，两变量构成了一个近似于直线的散点带，在散点带上，可以划出无数条直线。因此，彩色小麦籽粒灰度值Xg与色素含量E间的关系可以用一元线性回归模型来表示。为区别酸化乙醇法测出的彩色小麦籽粒色素含量与根据灰度值利用回归模型计算得出的色素含量，将根据灰度值利用回归模型计算得出的色素含量定义为Eg。

                            Eg=b+aXg

要获得能最佳反映彩色小麦籽粒灰度值与色素含量之间关系的一条直线，必须首先确定回归系数a和常数项b，根据生物统计学得：

回归系数         常数项

   将表1数据代入公式计算回归系数a和常数项b。

            

         因此                  

根据回归系数a= -0.0015，代入公式，得常数项b。

                                      

                      

因此，可得紫红粒彩色小麦籽粒灰度值与色素含量之间的一元线性回归模型为：

          Eg=0.2072-0.0015Xg     式中：Eg—籽粒的色素含量

                                      Xg—籽粒的灰度值（0﹤Xg﹤138.13）

从上式可以看出，回归系数为-0.0015，红紫色小麦籽粒色素含量与灰度值呈反比关系，即随着灰度值的增加，色素含量减少。常数项为0.2072，表示了直线在Y轴上的截距，即当灰度值为0时，小麦籽粒的色素含量为0.2072。当灰度值为最大值138.13时，小麦籽粒的色素含量为0，所以籽粒的灰度值Xg应在0-138.13之间。本发明测定的小麦籽粒灰度值在20至100之间，几乎没有达到100以上的。因此本发明建立的数学模型符合彩色小麦粒色实际变化情况。

综上所述，根据彩色小麦籽粒灰度值与色素含量建立的数学模型，涵盖现有的小麦籽粒色素含量的变化范围。只要测定出彩色小麦籽粒的灰度值即可利用数据模型计算出彩色小麦的色素含量。

实施例2. 利用本发明方法测定另一种红紫粒小麦样品的灰度值，将数据代入数学模型，计算每一粒籽粒色素含量：

按照本发明内容步骤A1所述方法依次测定每粒红紫粒小麦的灰度值，彩色小麦中红紫粒小麦灰度值Xg与色素含量Eg的数学模型为：

     Eg=0.2072-0.0015Xg     式中：Eg—籽粒的色素含量

                                  Xg—籽粒的灰度值（0﹤Xg﹤138.13）

例如：

1号籽粒灰度值Xg = 38.08      Eg=0.2072-0.0015×38.08 = 0.1501

2号籽粒灰度值Xg = 44.04      Eg=0.2072-0.0015×44.04 = 0.1411

3号籽粒灰度值Xg = 51.19      Eg=0.2072-0.0015×51.19 = 0.1304

4号籽粒灰度值Xg = 60.17      Eg=0.2072-0.0015×60.17 = 0.1169

5号籽粒........ .. ..... 

6号籽粒........ .. .....

本发明建立的模型用于彩色小麦籽粒色素含量的测定。只要改变模型中的回归系数与常数项，可用于测定其他颜色小麦籽粒的色素含量。因此，在不脱离本发明的精神和范围的情况下做出的各种变化和变型、所有等同的技术方案也属于本发明的范畴。