在糖原积累生物体内使PHA生产最大化的方法

摘要

提供在混合的培养生物质中提高PHA产量的方法。在该方法的第一阶段，将与底物结合的有机材料转化为挥发性脂肪酸，在废水处理方法的情况下，如果所述废水包含足够的挥发性脂肪酸(VFAs)以支持该方法，则不需要把有机材料转化为VFAs。在该方法的第二阶段，利用无氧-有氧筛选过程来筛选糖原积累生物体，这导致这些生物体增殖和以开放性混合的培养生物质为主。通过在所述筛选过程的无氧处理阶段以VFAs的形式提供相对高的有机加载，产生了具有相对高水平的储存糖原的糖原积累生物体。在第三个阶段，实施PHA积累过程，其中在无氧或有氧条件或其联合的情况下向糖原富集生物体中进料VFAs。通过消耗外部提供的VFAs和内在储存的糖原，在所述生物质中产生相对高水平的PHA。此后从残留生物质中分离出PHA。

说明书

临时申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.$119(e)要求以下美国临时申请的优先权：申请系列 号61/151,940，提交于2009年2月12日。该申请在本文以其整体引入作为参 考。

发明背景

聚羟基链烷酸酯(PHAs)已被认为是环境友好的聚合物材料的有希望的候选 者。这些聚合物显示了宽范围的材料特性，并且可以从可再生资源生产。但是， 与使用纯微生物培养进行的传统PHA生产方法相关联的高生产成本限制了这些 聚合物的广泛应用。已经提议了基于使用混合培养的可选的PHA生产策略。因 为不需要无菌条件，PHA生产中使用混合培养可能是更具成本效益的。另外， 它允许使用廉价底物例如废物或废弃副产物。

发明概述

本发明涉及在混合培养生物质中提高PHA产量的方法。在该方法的第一阶 段，与底物相关的有机材料被转化为挥发性脂肪酸(VFAs)。在第二阶段，采用 无氧-有氧筛选过程来筛选糖原积累生物体(GAOs)，并导致GAOs增殖和以开放 性的混合培养生物质为主。通过在所述筛选过程的无氧阶段以VFAs的形式提 供相对高的有机加载，产生了具有相对高水平的储存糖原的GAOs。在第三个 阶段，在无氧或有氧条件或其联合的情况下向糖原富集GAO生物质提供VFAs， 进行PHA积累过程。通过消耗外部提供的VFA富集的底物和内在储存的糖原， 在所述生物质中产生相对高水平的PHA。此后从残留生物质中分离出PHA。

在一些方法中，所有三个步骤可能不是全部必须的。例如，底物可能已经 有足够丰富的VFAs以确保在进行GAO筛选之前不需要有机转化步骤。另外， 在一些情况下将PHA积累方法整合进步骤二GAO筛选方法是可行的。

更具体地，本发明的方法涉及通过筛选的或富集的GAO的开放性混合培养 来生产PHA，其中在筛选过程的无氧阶段，维持相对高的VFA与生物质的加 载比例。已经发现这使得细胞内糖原升高至相对高水平，相应地有利于提供积 累相对高含量的PHA的机制。虽然在筛选过程的无氧阶段期间VFA加载量可 以变化，但是已经发现VFA与生物质(干重)的加载比例在0.075-0.126g-VFA/g- 生物质范围内有效地生产包含大约17％到大约60％PHA的生物质。这一比例范 围不是限制性的。通过实验测试假定超过0.126g-VFA/g-生物质的更高比例也有 效地产生相当量的糖原，这反过来导致产生相当量的PHA。

附图概述

图1是图示了在GAO筛选过程中典型的无氧-有氧循环的图。

图2是图示了无氧PHA积累过程的图。

图3是图示了有氧PHA积累过程的图，其中两个脉冲的50C-mmol/L乙酸 酯被加入到生物质中。

图4是图示了有氧PHA积累过程的图，其中三个脉冲的50C-mmol/L乙酸 酯被加入到生物质中。

图5是图示了GAO筛选过程和引入到废水处理系统的PHA积累过程的一 个实施方案的示意图。

示例性实施方案的描述

聚羟基链烷酸酯(PHAs)是一类在细菌中作为细胞内碳和能量储存物而合成 的生物聚合物。在生物质中发现了一类生物体，称为糖原积累生物体(GAOs)， 在一定条件下生产PHA。GAOs代谢外源碳源，通常是挥发性脂肪酸(VFAs)， 并以PHAs的形式储存碳。

本发明涉及在富集GAOs的混合培养中提高PHA生产。本文描述的方法可 以包含至少三个步骤。在第一阶段，包含底物的有机物质被转化为挥发性脂肪 酸(VFAs)。第二阶段是使用交替的无氧-有氧条件并且在无氧阶段消耗VFA的 GAO筛选过程。尽管VFAs通常被视为优选的GAOs底物，其它类型的有机化 合物也可以用作底物。在该阶段GAOs生长并增殖，并且如果不以超过生长需 要来提供磷源的话将主导生物质。在第三阶段，在GAOs中生产PHA并积累至 尽可能高的程度。本发明的目标是生产高含量的PHA，因为这将改进整个方法 的生产性能，并显著改进下游加工，使从残留生物质中分离PHA更便宜和更具 成本效益。本文描述的方法正日益更经济地和在技术上更可行地在积累阶段达 到更高的PHA水平。

如前所述，该方法的第一阶段包括将有机物质转化为VFAs。这通过在通常 称为产酸阶段的无氧条件下向发酵生物质提供碳源来实现。碳源可能变化，但 是得到的VFAs可以包括乙酸酯、丙酸酯、丁酸和戊酸酯的混合物。然而，在 一些情况下，用于富集GAOs的底物可能已经具有足够的VFA含量，或者由于 各种原因将有机物质转化为提高VFA含量是不可能实现或不可行的。在这些情 况下，该方法的第一阶段可能不是必须的。在任何一种方案中，包含VFAs的 底物在第二阶段的无氧阶段期间加入到GAO生物质之中，以这种方式，驱动并 维持稳定的GAO筛选压力。

GAO筛选过程可以在第二阶段进行，在一个实施方案中可以是序批式反应 器(sequencing batch reactor，SBR)。然而，在其它实施方案中，GAO筛选可以类 似地在推流式反应器、串联混合釜、或其它连续流动反应器构造中实现。在GAO 筛选过程的无氧阶段，VFAs加入到GAOs中。GAOs水解并消耗细胞内储存的 糖原，而在这些反应期间产生的能量被用于消耗VFAs以生产和储存PHA。在 无氧条件下，没有氧气供给生物质，而在混合液中的溶解氧水平是不存在的或 至少相对较低。在接下来的GAO筛选过程的有氧阶段，不再给予VFA供应， 并且因此内在储存的PHA被用于活性生物质的生长和细胞内糖原的产生。该方 法选择性地富集含有GAOs的生物质，因为GAOs能在这样的无氧-有氧条件下 很好地生长，而很多其它非糖原积累生物体在这种条件下不能生存。在有氧条 件下，氧或另一种电子受体可供给生物质，以促进PHA消耗作为碳源用于细胞 生长和糖原储存。氧可以使用例如通风装置或混合器来提供。在另一个实施方 案中，GAO筛选阶段可以包括与有氧阶段连接的缺氧阶段。在另外一个实施方 案中，GAO筛选过程可以包含无氧-缺氧条件。当使用缺氧阶段时，NO₃^-(硝酸 盐)或NO₂(硝酸酯)可以用作适宜的缺氧电子受体。

在第三阶段，产生在GAOs中的PHA并积累至尽可能高的水平。如果在无 氧阶段期间从GAO选择器来采集生物质，则GAOs具有来自代谢的VFAs的高 水平的储存的PHA。因此，如果在无氧阶段之后采集，则生物质可能不需要进 一步处理。然而，如果在有氧阶段从GAO选择器来采集生物质，则GAOs已 经将显著量的储存的PHA氧化为糖原。因此，如果在GAO筛选过程的有氧阶 段期间采集生物质并具有很少或没有储存的PHA，则需要额外的处理以产生和 积累PHA。在单独的无氧条件或有氧条件，或者其联合之下，可以在这种类型 的生物质中加入VFAs以刺激PHA生产。

通过控制如上所述的GAO筛选阶段的各种参数，可以增加GAOs中PHAs 的积累。例如，如果在采集的GAOs中的糖原含量足够高，则在积累阶段加入 的VFAs被消耗，并伴随着糖原的消耗和PHA的生产。GAOs在无氧和有氧条 件下依赖于糖原来合成PHA。因此，在GAO筛选阶段确保GAOs中高的糖原 含量，能通过无氧或有氧策略增加积累期间的PHA生产潜力。

若干个参数对GAOs在GAO筛选阶段期间的最大化糖原含量做出贡献。 用于最大化糖原含量的一个参数是VFA对生物质的重量比。在连续流系统中， 这个参数经常称为“絮凝-负载(floc-loading)”。VFA的量定义为在底物中存在的 所有单独的挥发性脂肪酸的加和总量。表示被进料的生物质的量的一种方法是 通过测量总悬浮固体(total suspended solid，TSS)。对SBRs，VFA对生物质的比 例可以定义为在无氧期间进料到生物质的VFA的质量除以在无氧阶段开始时以 TSS测量的生物质(g VFA/g TSS)。对于具有简单或分布进料反应器构造的连续 流，VFA对生物质的比例可定义为供给无氧区域的VFA的速率(g VFA/h)除以 供给无氧区域的生物质的速率(g TSS/h)。控制该参数增加了GAO生物质中的糖 原水平，以便随后最大化生物质中的PHA积累潜力。如下面所讨论的，VFA 对TSS的比例在0.075-0.126g-VFA/g-TSS的范围内证明产生了细胞内高水平的 糖原，这能够积累高水平的PHA。一般地，VFA对生物质的比例应该是0.08g VFA/g TSS或以上。

GAO筛选过程的无氧阶段期间的高有机加载在生产具有高水平的细胞内 糖原的GAOs中是重要的，其反过来导致在随后的在无氧和/或有氧条件下的 PHA积累阶段的高PHA产量。进行了VFA对TSS的比例在0.075-0.126范围 的大量实验并证实了VFAs对TSS的高比例导致了PHA的高积累。

在一个实例中，GAO筛选过程采用SBR及VFA对生物质的比例为0.075g VFA/g TSS来进行。在有氧阶段的末尾，GAOs包含总悬浮固体的18％的糖原。 当在PHA积累阶段向该生物质进料过量VFAs时，在无氧条件下获得了所得 TSS的17％的PHA。

在另一个实例中，GAO筛选过程采用SBR及VFA对生物质的比例为0.084 g VFA/g TSS来进行。在有氧阶段的末尾，GAOs包含总悬浮固体的24％的糖原。 当在PHA积累阶段向该生物质进料过量VFAs时，在无氧条件下获得了所得 TSS的30％的PHA，而在有氧条件下获得了所得TSS的25％的PHA。

在另一个实例中，GAO筛选过程采用SBR及VFA对生物质的比例为0.126 g VFA/g TSS来进行。在有氧阶段的末尾，GAOs包含总悬浮固体的36％的糖原。 当在PHA积累阶段向该生物质进料过量VFAs时，在无氧条件下所得TSS的 49％是PHA的形式，而在有氧条件下所得TSS的60％是PHA的形式。

对于GAO筛选过程和PHA积累的更详细的解释见展示1(Exhibit 1)。

在GAO筛选阶段对最大化糖原含量做出贡献的其它参数包括温度和固体 保留时间(solid retention time，SRT)。然而，GAO筛选过程的策略可以在很大范 围的温度和SRTs之下进行。

关键重要的是设计在GAO筛选过程中生物质暴露于交替的无氧和有氧阶 段的时间长度。GAO筛选过程的无氧阶段应当足够长以允许VFA消耗，但是 足够短以避免储存的PHA的不当无氧消耗。无氧阶段时间的典型范围是在1到 4小时之间。GAO筛选阶段的有氧阶段的时间应当足以降低细胞内PHA浓度， 但是足够短以避免储存的糖原的不当消耗。一般地，有氧时间足够长以使得储 存的PHA含量变得少于以TSS测量的生物质的10％。有氧阶段时间的典型范 围是在2到20小时之间。

在一个实例里，GAO筛选过程采用SBR进行，进料乙酸酯作为VFA来源， 并在大约30℃下在交替无氧-有氧条件下运行450天。在此期间，Candidatus  Competibacter phosphatis以生物质的54％-70％在培养中占主导。典型的无氧-有 氧循环描绘于图1。如图1所示，在GAO筛选过程的无氧阶段，乙酸酯和糖原 被消耗，同时产生PHA。在随后的有氧阶段，PHA被消耗而产生了活性生物质 和糖原。

GAO筛选过程以VFA对生物质的比例为0.126g VFA/g TSS来实现。在无 氧阶段的末尾，PHA含量为TSS的17±3％而糖原含量为TSS的17±2％。在有 氧阶段的末尾，糖原含量为TSS的36±4％。GAO筛选过程中高的VFA对生物 质的比例促进了有氧阶段末尾GAOs中糖原含量的提高。

在分离的批实验中研究了在无氧和有氧条件下PHA的积累。因此，来自 SBR的生物质在有氧阶段的末尾移除出来并转入批式反应器。以1或2g乙酸 酯或丙酸酯每升的单一或多次脉冲向生物质中加入VFA源，例如乙酸酯或丙酸 酯。PHA的积累在有氧或无氧条件下进行，只要糖原存在于GAO生物质中。 在消耗外部提供的VFA和内在储存的糖原的同时生产出PHA。

当在PHA积累阶段向生物质进料过量的VFAs时，以TSS测量的所得生物 质的49％是PHA的形式，并在无氧条件下在4小时之内获得。积累的PHA包 括3-羟基丁酸酯(3HB)和3-羟基戊酸酯(3HV)。如图2所示，当细胞内糖原含量 降至低于TSS的3％时PHA积累停止，表明PHA积累被储存的糖原的量所限 制。

在有氧条件下的PHA积累阶段，两个脉冲的50C-mmol/L乙酸酯被加入到 生物质中。在这些条件下，以TSS测量的所得生物质的60％是PHA的形式。 在有氧条件下的分离实验中，三个脉冲的50C-mmol/L乙酸酯被加入到生物质 中。在这些条件下，以TSS测量的所得生物质的59％是PHA的形式。在两个 有氧积累实验中，积累的PHA仅包含3HB。另外，图3和图4显示在两个有氧 积累实验中，PHA生产速率和糖原消耗速率随着时间而降低，如同在无氧条件 下观察到的一样。因此，细胞内糖原水平在有氧条件下和在无氧条件下都控制 PHA生产。

在4小时无氧随后4小时有氧条件下进行一次实验，其中脉冲式供应乙酸 酯。当由于无氧PHA积累而糖原池被用尽(TSS的3％)时，在有氧条件下没有更 多PHA积累发生，即使生物质未被PHA饱和，如由PHA含量(TSS的47％)低 于从培养中观察到的最高PHA含量(TSS的60％)所证实。这显示在有氧条件下 在GAOs中PHA合成也是糖原消耗依赖性的。

上文描述的GAO筛选和PHA积累过程可以引入到废水处理系统，通常以 图5中的数字10来表示。在本文所描述的实施方案里，废水处理系统可以用于 处理各种类型的水和废水。如本文所用的术语“废水”表示任何水流，其可以由 工厂和/或家用方法、过程或活动的出口所产生。在普通情况下，出口水流包含 有机和无机化合物，这些化合物是作为所述方法、过程或活动的副产物得到的。 然而在其它情况中，例如淤泥发酵，含水出口拟指富含挥发性脂肪酸的流体， 并且是所述方法、过程或活动的主要产物。因此，如本文所用的术语“废水”是 指对本方法合适的流体并典型地不会未经一些形式的处理而直接排泄进入环境 者。

更详细地观察废水处理系统10，废水流体12指向酸阶段消化器(Acid Phase  Digester，APD)14。在所述方法的该阶段中，废水中的有机材料在无氧条件下 转化为VFAs。允许进行有机材料转化为VFAs而不允许VFAs进一步转化为甲 烷和二氧化碳。为了控制APD 14中的固体保留时间和pH，APD 14中可以分别 包括生物质出口16和pH调节入口20。另外，APD 14可以包括气体出口18。 APD 14可以是批式反应器、序批式反应器、或连续流动反应器。另外，APD 14 可以是悬浮生长反应器或生物膜生长反应器。取决于进入的废水流体的特征， APD 14可能不需要。也就是，如果废水流体有足够丰富的VFAs，则APD 14 可以不用。

在废水中产生足够量的VFAs之后，废水被从APD 14导入废水处理反应器 (WWT)22。在WWT 22中，有机材料(VFAs占主导)转化为生物质和二氧化碳。 生物质与废水混合以形成混合液。生物质经历实施GAO筛选过程的交替的无氧 -有氧条件。在另一个实施方案中，可以使用缺氧条件替换或联合有氧条件。相 对高的VFAs对生物质的加载比例促进了GAOs中糖原水平的提高。WWT 22 可以是序批式反应器、连续流动反应器、串联釜、推流式反应器、常规进料反 应器、或阶段进料反应器。WWT 22也可以包括化学添加入口24、通风入口26 和气体出口28。

包含GAOs富集的生物质的废水然后被导入分离器30，在这里生物质从处 理过的废水流体32中分离出来。在一个实施方案中，GAOs富集的生物质被导 入下游加工系统(DSP)34，如果生物质具有足够水平的PHA。也即是，如果在 GAO筛选过程的无氧阶段采集生物质，则生物质的PHA含量可能已经足够， 而不需要进一步的PHA积累。然而，如果在GAO筛选过程的有氧阶段采集生 物质，则生物质将只具有很少或没有PHA含量。因此，这种类型的生物质可以 被导入PHA生产过程(PPP)36以用于进一步处理。

在PPP 36中，VFAs被加入到生物质中。在一个实施方案中，离开APD 14 的VFAs富集的废水可以被导入PPP 36。在另一个实施方案中，富含VFAs的 输入废水流38被导入PPP 36。在又另一个实施方案中，来自APD 14的富含 VFAs的废水和富含VFAs的输入的废水流38都被导入PPP 36。PPP 36中的生 物质经历有氧条件、无氧条件、或无氧-有氧循环。PPP 36可以是批式反应器， 序批式反应器，或连续流动反应器。另外，PPP 36可以包括提供化学添加、通 风入口40和气体出口42。

在无氧和有氧PHA积累中，PPP 36中的PHA积累均依赖于GAOs中的糖 原含量。这些糖原水平可以通过WWT 22中GAO筛选中的VFA加载来控制。

在GAO生物质中产生了足够水平的PHA之后，生物质被导入分离器44， 在这里生物质与废弃水相分离。在一个实施方案中，废弃水可以再循环进入APD 14。分离的生物质然后导入下游加工(DSP)34过程。DSP 34包括从残留生物质 中分离PHA的任何方法。这可以包括通过入口46添加化学品和机械能量以从 PHA中移除非PHA生物质，然后分离和干燥PHA。然后DSP 34从PHA 50中 分离残留的生物质，或者“非PHA细胞材料”(NCPM)48。NCPM可以用于沼气 生产或可以回到APD 14或WWT 22。

本发明当然可以以本文描述的方法之外的其它特定的途径来实现而不脱离 本发明的范围和其本质特征。因此本发明的实施方案应当从所有方面来解释为 示例性的而不是限制性的，并且来自所附的权利要求的含义和等同范围之内的 任何改动都拟包括于其中。