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法律状态
2017-10-10
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N9/44 授权公告日:20150715 终止日期:20160820 申请日:20100820
专利权的终止
2015-07-15
授权
授权
2012-10-03
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N9/44 申请日:20100820
实质审查的生效
2012-05-30
公开
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涉及序列表
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涉及生物材料的保藏
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发明背景
发明领域
本发明涉及具有异淀粉酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多 核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞， 以及用于产生和使用所述多肽的方法。
相关领域描述
异淀粉酶是一种脱支酶(E.C.3.2.1.68)，其水解支链淀粉、糖原和β-极限 糊精中的1，6-α-连接。支链淀粉由α-淀粉酶部分降解，所述酶将1，4-α-糖苷连 接水解为支化和直链的寡糖，导致α-极限糊精的形成。不似支链淀粉酶 (pullulanase)，异淀粉酶对支链淀粉和糖原具有高活性，而对芽霉菌糖(pullulan) 具有非常低的活性。支化的寡糖可由脱支酶水解为直链寡糖。剩余的直链寡 糖可由葡糖淀粉酶迅速地解聚为D-葡萄糖。
美国专利号4,335,208公开了通过葡糖淀粉酶和来源于介支淀粉假单胞 菌(Pseudomonas amyloderamosa)的嗜酸性异淀粉酶的酶混合物糖化淀粉水解 物的工艺。
EP1,002,062涉及来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的异淀 粉酶及其在淀粉转化工艺中的用途。
WO 2005/121305(Novozymes)涉及用于产生具有低糖含量的啤酒的工 艺，包括：a)在酶活性的存在下制备醪液；b)过滤醪液以获得麦芽汁，和 c)发酵所述麦芽汁以获得啤酒，其中所述酶活性包括：α-淀粉酶、葡糖淀粉 酶和异淀粉酶。
本发明的目标是提供具有异淀粉酶活性的多肽，和编码所述多肽的多核 苷酸。本发明亦提供所述异淀粉酶用于糖浆制备和其他相关应用中的用途。
发明概述
本发明涉及具有异淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽选自下组：
(a1)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的成熟 多肽具有至少93％，优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更 优选至少97％，更优选至少98％，甚至更优选至少99％的同一性；
(a2)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4的成熟 多肽具有至少94％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更 优选至少98％，甚至更优选至少99％的同一性；
(a3)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：6的成熟 多肽具有至少93％，优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更 优选至少97％，更优选至少98％，甚至更优选至少99％的同一性；
(a4)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：8的成熟 多肽具有至少90％，优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更 优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优 选至少98％，甚至更优选至少99％的同一性；
(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件下与以下 杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的成 熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或 SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长 互补链；
(c1)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少86％，优选至少88％，更优选至少 90％，更优选至少92％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％，且甚至最 优选至少99％的同一性；
(c2)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少86％，优选至少88％，更优选至少 90％，更优选至少92％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％，且甚至最 优选至少99％的同一性；
(c3)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少86％，优选至少88％，更优选至少 90％，更优选至少92％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％，且甚至最 优选至少99％的同一性；
(c4)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列具有至少84％，优选至少86％，更优选至少 87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少92％， 甚至更优选至少95％，最优选至少97％，且甚至最优选至少99％的同一性； 和
(d)SEQ ID NO：2、4、6和/或8的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入 一个或多个(几个)氨基酸的变体。
本发明还涉及包含编码本发明的多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸。 更具体而言，在该方面本发明涉及编码具有异淀粉酶活性的多肽的分离的多 核苷酸，其通过下述方法获得：(a)在至少高严格条件下，优选至少非常高严 格条件下，将DNA群体与(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和/ 或SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列， 或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交；
(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有异淀粉酶活性的多肽。
本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿 主细胞，和产生具有异淀粉酶活性的多肽的方法。
本发明还涉及产生啤酒和糖浆的方法。
本发明还涉及包含编码此种具有异淀粉酶活性的多肽的分离的多核苷酸 的植物。
本发明还涉及产生此种具有异淀粉酶活性的多肽的方法，包括：(a)在有 助于所述多肽产生的条件下，培养包含编码此种具有异淀粉酶活性的多肽的 多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。
定义
异淀粉酶活性：术语“异淀粉酶活性”在本文中定义为具有糖原α-1，6-葡聚 糖水解酶活性(EC编号3.2.1.68)活性的酶，所述活性催化糖原、支链淀粉以及 其β-极限糊精中的(1，6)-α-D-糖苷支链连接的水解。就本发明而言，异淀粉酶 活性是根据如下文中“材料和方法”部分在标题“确定异淀粉酶活性单位 (IAU)”中所述而确定的。
本发明的多肽具有至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选 至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优 选至少95％，且甚至最优选至少100％的SEQ ID NO：2、4、6或8的成熟多 肽分别的异淀粉酶活性。
分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指从来源分离的多肽。在一 个优选的方面，所述多肽如通过SDS-PAGE测定的，为至少1％纯，优选至 少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更 优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。术语“纯” 在此语境下的使用涉及本发明的多肽，且应理解为表明本发明的多肽与多少 其他多肽物质相结合(associated)。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多 肽制备物含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至 多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多 1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的(associated)的其它多 肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料 的重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％ 纯，更优选至少96％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至 少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选 100％纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即，所述多肽制备物基本上 (essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过以下 实现：通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。
成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为以其在翻译和任何翻译后修 饰之后的最终形式存在的具有异淀粉酶活性的多肽，所述修饰例如N-末端加 工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。
在一个优选的方面，SignalP v 3.0程序预测SEQ ID NO：2、4、6和8的 氨基酸-26至-1均为信号肽，根据该预测，成熟多肽分别为SEQ ID NO：2、4、 6和8的氨基酸1至750。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有 异淀粉酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个优选的方面，SignalP v 3.0程 序预测SEQ ID NO：1、3、5和7的核苷酸1至78均编码信号肽，根据该预 测，成熟多肽编码序列分别为SEQ ID NO：1、3、5和7的核苷酸79至2328。
同一性：参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间 的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件 包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等， 2000，Trends in Genetics 16：276-277)(优选3.0.0版或更高版本)的Needle程序 中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol. 48：443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开启罚分(gap open penalty)10， 缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的 EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性(longest identity)”的输 出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如 EMBOSS软件包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，见上文)(优选3.0.0版或更高版本)的Needle程序中所执 行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来测定。 使用的可选参数为缺口开启罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最长同一性”的输出结 果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)
同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为在用Dyella japonica异淀粉 酶(登录号DSM 22712、DSM 22713、DSM 22714和DSM 22715)分别进行的 tfasty搜索(Pearson，W.R.，1999，于Bioinformatics Methods and Protocols中，S. Misener和S.A.Krawetz编，pp.185-219)中给出的E值(或期望值)小于0.001 的预测蛋白质。
多肽片段：术语“多肽片段”在本文中定义为分别从SEQ ID NO：2、4、6或 8的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸 的多肽；其中所述片段具有异淀粉酶活性。涉及多肽而使用的术语“其片段”在 本发明的语境下应理解为与“多肽片段”具有相同含意。
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为分别从SEQ ID NO： 1、3、5或7或其同源序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核 苷酸序列；其中所述亚序列编码具有异淀粉酶活性的多肽片段。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体 基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发 生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无 变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的 等位变体编码的多肽。
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核 苷酸。在一个优选的方面，多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，为至少1％纯， 优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯， 更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。术语“纯” 在此语境下的使用涉及本发明的多核苷酸，且应理解为表明本发明的多核苷 酸与多少其他多核苷酸物质相结合(associated)。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它 外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于 适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核 苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％， 更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并 且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而， 基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终 止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯， 更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％ 纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％ 纯的。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式，即，所述多核苷酸制备 物基本上不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以 是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源的，或它们的任何组合。
编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物 的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读 框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始， 并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、 cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。
核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核 酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或所述核酸分子是合成的。当所述 核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术 语“表达盒”同义。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本 发明多肽的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述多 肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天 然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前 肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启 动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的 接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列 编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调 控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导 多肽编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、 转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其 包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额 外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述 细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转 染、转导等是易感的(susceptible)。
修饰：术语“修饰”在本文的意思是，对分别由SEQ ID NO：2、4、6或8 的成熟多肽组成的多肽或其同源序列的任何化学修饰，以及对编码所述多肽 的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失 和/或插入，以及一个或多个(几个)氨基酸侧链的置换。
人工变体：当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有异淀粉酶活性 的多肽，所述多肽由表达SEQ ID NO：1、3、5或7的成熟多肽编码序列或其 同源序列的修饰的核苷酸序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人 为干预(human intervention)，通过修饰公开于SEQ ID NO：1、3、5和/或7或 它们的同源序列的多核苷酸序列来获得。
发明详述
具有异淀粉酶活性的多肽
在第一个方面，本发明涉及具有异淀粉酶活性的分离的多肽，选自下组：
(a1)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的成熟 多肽具有至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％， 更优选至少97％，更优选至少98％，甚至更优选至少99％的同一性；
(a2)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4的成熟 多肽具有至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％， 更优选至少98％，甚至更优选至少99％的同一性；
(a3)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：6的成熟 多肽具有至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％， 更优选至少97％，更优选至少98％，甚至更优选至少99％的同一性；
(a4)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：8的成熟 多肽具有至少90％，优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更 优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优 选至少98％，甚至更优选至少99％的同一性；
(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件下与以下 杂交：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7的 成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或 SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长 互补链；
(c1)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少86％，优选至少88％，更优选至少 90％，更优选至少92％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％，且甚至最 优选至少99％的同一性；
(c2)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少86％，优选至少88％，更优选至少 90％，更优选至少92％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％，且甚至最 优选至少99％的同一性(下文中称作“同源多肽”)；
(c3)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少86％，优选至少88％，更优选至少 90％，更优选至少92％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％，且甚至最 优选至少99％的同一性；
(c4)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列具有至少84％，优选至少86％，更优选至少 87％，更优选至少88％，更优选至少89％，更优选至少90％，更优选至少92％， 甚至更优选至少95％，最优选至少97％，且甚至最优选至少99％的同一性； 和
(d)SEQ ID NO：2、4、6和/或8的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几 个)氨基酸的变体。
在一个优选的方面，所述同源多肽具有与SEQ ID NO：2、4、6和/或8的 成熟多肽相差十个氨基酸，优选五个氨基酸，更优选四个氨基酸，甚至更优 选三个氨基酸，最优选两个氨基酸，且甚至最优选一个氨基酸的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的多肽包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序 列由SEQ ID NO：2、4、6、8的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO：2、4、6 和/或8的氨基酸序列相差1-70个氨基酸，如1-65个氨基酸，或1-60个氨基 酸，或1-55个氨基酸，或1-50个氨基酸，或1-45个氨基酸，或1-40个氨基 酸，或1-35个氨基酸，或1-30个氨基酸，或1-25个氨基酸，或1-20个氨基 酸，或1-15个氨基酸，或1-10个氨基酸，或1-9个氨基酸，或1-8个氨基酸， 或1-7个氨基酸，或1-6个氨基酸，或1-5个氨基酸，或1-4个氨基酸，或1-3 个氨基酸，或1-2个氨基酸或1个氨基酸的氨基酸序列组成，其中术语“相差” 意指与SEQ ID NO：2、4、6、8的氨基酸序列相比取代、缺失和/或插入了给 定数量的氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明的多肽包含氨基酸序列，其中所述氨基酸 序列由SEQ ID NO：2、4、6、8的成熟多肽组成，和/或由与SEQ ID NO：2、4、 6和/或8的成熟多肽相差1-70个氨基酸，如1-65个氨基酸，或1-60个氨基 酸，或1-55个氨基酸，或1-50个氨基酸，或1-45个氨基酸，或1-40个氨基 酸，或1-35个氨基酸，或1-30个氨基酸，或1-25个氨基酸，或1-20个氨基 酸，或1-15个氨基酸，或1-10个氨基酸，或1-9个氨基酸，或1-8个氨基酸， 或1-7个氨基酸，或1-6个氨基酸，或1-5个氨基酸，或1-4个氨基酸，或1-3 个氨基酸，或1-2个氨基酸或1个氨基酸的氨基酸序列组成，其中术语“相差” 意指与SEQ ID NO：2、4、6、8的氨基酸序列相比取代、缺失和/或插入了给 定数量的氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明的多肽包含氨基酸序列，其中所述氨基酸 序列由SEQ ID NO：2、4、6、8的氨基酸1至750组成，或由与SEQ ID NO：2、 4、6和/或8的氨基酸1至750相差1-70个氨基酸，如1-65个氨基酸，或1-60 个氨基酸，或1-55个氨基酸，或1-50个氨基酸，或1-45个氨基酸，或1-40 个氨基酸，或1-35个氨基酸，或1-30个氨基酸，或1-25个氨基酸，或1-20 个氨基酸，或1-15个氨基酸，或1-10个氨基酸，或1-9个氨基酸，或1-8个 氨基酸，或1-7个氨基酸，或1-6个氨基酸，或1-5个氨基酸，或1-4个氨基 酸，或1-3个氨基酸，或1-2个氨基酸或1个氨基酸的氨基酸序列组成，其中 术语“相差”意指与SEQ ID NO：2、4、6、8的氨基酸序列相比取代、缺失和/ 或插入了给定数量的氨基酸。
本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2、4、6和/或8的氨基酸序列或其变 体，或它们具有异淀粉酶活性的片段。所述变体可具体而言为等位变体、人 工变体，或包含SEQ ID NO：2、4、6和/或8的成熟多肽取代、缺失和/或插 入一个或多个(几个)氨基酸的变体。在一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：2、4、6和/或8的氨基酸序列。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：2、4、6和/或8的成熟多肽。在另一个优选的方面，所述多肽分别包 含SEQ ID NO：2、4、6和/或8的氨基酸1至750，或其变体；或它们的具有 异淀粉酶活性的变体。所述变体可具体而言为等位变体、人工变体，或包含 SEQ ID NO：2、4、6和/或8的成熟多肽取代、缺失和/或插入一个或多个(几 个)氨基酸的变体。在另一个优选的方面，所述多肽包含SEQ ID NO：2、4、6 和/或8的氨基酸1至750。在另一个方面，所述多肽由SEQ ID NO：2、4、6 和/或8的氨基酸序列或其变体，或它们具有异淀粉酶活性的片段组成。所述 变体可具体而言为等位变体、人工变体，或包含SEQ ID NO：2、4、6和/或8 的成熟多肽取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。在另一个 优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：2、4、6和/或8的氨基酸序列组成。在 另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：2、4、6和/或8的成熟多肽组成。 在另一个优选的方面，所述多肽由SEQ ID NO：2、4、6和/或8的氨基酸1至 750，或其变体；或它们的具有异淀粉酶活性的片段组成。所述变体可具体而 言为等位变体、人工变体，或包含SEQ ID NO：2、4、6和/或8的成熟多肽取 代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。在另一个优选的方面， 所述多肽由SEQ ID NO：2、4、6和/或8的氨基酸1至750组成。
在第二个方面，本发明涉及编码具有异淀粉酶活性的多肽的分离的多核 苷酸，其通过下述方法获得：(a)在至少高严格条件下，优选至少非常高严格 条件下，将DNA群体与(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和/ 或SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列， 或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有异淀粉酶活性的多肽。
因此，本发明涉及具有异淀粉酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码， 所述多核苷酸在优选高严格条件下，优选非常高严格条件下，与下述杂交： (i)SEQ ID NO：1、3、5和/或7的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1、 3、5和/或7的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列， 或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis， 1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor， New York)。SEQ ID NO：1、3、5和/或7的成熟多肽编码序列的亚序列，分别 含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。而且，所述 亚序列可编码具有异淀粉酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，所述互补 链是SEQ ID NO：1、3、5和/或7的成熟多肽编码序列的全长互补链。
SEQ ID NO：1、3、5和/或7的核苷酸序列，或其亚序列，以及SEQ ID NO：2、 4、6和/或8的氨基酸序列，或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域 内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有异淀粉酶活性的多肽 的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感 兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以从其中鉴定和分离相应的基因。这 些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至 少35，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针是至少100 个核苷酸长度。
例如，所述核酸探针的长度可为至少200个核苷酸，优选至少300个核 苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。可使用甚至 更长的探针，例如长度为优选至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸， 甚至更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个氨基酸的核酸探针。DNA 和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32p、 3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。
因而，可从由这些其它菌株制备的基因组DNA文库中筛选DNA，所述 DNA与上述探针杂交并且编码具有异淀粉酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或 聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组 或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至并且固定于硝 化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料。为了鉴定与SEQ ID NO：1、 3、5和/或7，或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用于 Sounthern印迹中。
就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在高至非常高的严格条件下与标记 的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1、3、5和/或7的成熟多 肽编码序列；包含SEQ ID NO：1、3、5和/或7的成熟多肽编码序列的基因组 DNA序列；其全长互补链；或它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film) 检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1、3、5和/或7的成熟多肽 编码序列。在另一个优选方面，核酸探针分别为SEQ ID NO：1、3、5和/或7 的核苷酸79至2328。在另一个优选方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2、4、 6和/或8的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选方面，核酸探 针是SEQ ID NO：1、3、5和/或7。在另一个优选方面，核酸探针是包含于并 可得自保藏的菌株Dyella japonica DSM 22712、Dyella japonica DSM 22713、 Dyella japonica DSM 22714和/或Dyella japonica DSM 22715中的多核苷酸序 列之一，其中其多核苷酸序列编码具有异淀粉酶活性的多肽。在另一个优选 的方面，核酸探针是包含于并可得自保藏的菌株Dyella japonica DSM 22712、 Dyella japonica DSM 22713、Dyella japonica DSM 22714和/或Dyella japonica DSM 22715的成熟多肽编码区。
对于长度至少100个核苷酸的长探针，高至非常高的严格条件定义为在 42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中， 以及对于高和非常高严格性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹步骤 进行预杂交和杂交最佳12至24小时。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选 在65℃(高严格性)，并且最优选在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤 三次，每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定 义为在比使用根据Bolton和McCarthy的计算法(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48：1390)计算的Tm低大约5℃至大约10℃， 在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt 溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标 准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材 料在6×SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的Tm低 5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。
在第三个方面，本发明涉及由多核苷酸编码的具有异淀粉酶活性的分离 的多肽，所述多核苷酸包含下述，或由下述组成：
(c1)核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少 86％，优选至少88％，更优选至少90％，更优选至少92％，甚至更优选至少 95％，最优选至少97％，且甚至最优选至少99％的同一性；
(c2)核苷酸序列，其与SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列具有至少 86％，优选至少88％，更优选至少90％，更优选至少92％，甚至更优选至少 95％，最优选至少97％，且甚至最优选至少99％的同一性；
(c3)核苷酸序列，其与SEQ ID NO：5的成熟多肽编码序列具有至少 86％，优选至少88％，更优选至少90％，更优选至少92％，甚至更优选至少 95％，最优选至少97％，且甚至最优选至少99％的同一性；
(c4)核苷酸序列，其与SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列具有至少 84％，优选至少86％，更优选至少87％，更优选至少88％，更优选至少89％， 更优选至少90％，更优选至少92％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％， 且甚至最优选至少99％的同一性。
在第四个方面，本发明涉及SEQ ID NO：2、4、6和/或8的成熟多肽或其 同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的人工变体。 优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸 取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个 氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多 至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化 的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope) 或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨 酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、 疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色 氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。 通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例 如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins，Academic Press，New York中 描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、 Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、 Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
野生型多肽中的氨基酸取代既包括用20个标准氨基酸的取代，也还包括用 非标准氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α- 甲基丝氨酸)的取代。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和 非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修 饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够 以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸， 和3，3-二甲基脯氨酸。
能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法 (Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需 氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且 测试所得突变分子的生物活性(即，异淀粉酶活性)以鉴定对于所述分子的活性 关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。 酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如 通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推 定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255： 306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Lett.309：59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来 推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选 方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie 和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插 入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991， Biochem.30：10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和区域定 向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞 表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17： 893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用 本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨 基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。
SEQ ID NO：2、4、6和/或8的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的 总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4， 甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。
具有异淀粉酶活性的多肽的来源
本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与 给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源 产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选 的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。可自其获得本发明的多肽的 来源的实例包括但不限于任何如下所述的。
本发明具有异淀粉酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以 是具有异淀粉酶活性的革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球 菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、 肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、 梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属 (Oceanobacillus)多肽；或具有异淀粉酶活性的革兰氏阴性细菌多肽，如 Dyella、Fulvimonas、弗拉特氏菌属(Frateuria)和Rhodanobacter，大肠杆菌(E. coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属 (Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆 菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体 属(Ureaplasma)属多肽。
在一个优选方面，所述多肽是具有异淀粉酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌 (Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、 灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢 杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有异淀粉酶活性的似马链球菌 (Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌 (Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有异淀粉酶活性的不产色链霉菌 (Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉 菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌 (Streptomyces lividans)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有异淀粉酶活性的介支淀粉假单胞菌 (Pseudomonas amyloderamosa)多肽，例如，(Harada等，1968；Sugimoto等， 1974)中所述的多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有异淀粉酶活性的金黄弗拉特氏菌 (Frateuria aurantia)多肽。
在另一个优选的方面，所述多肽是具有异淀粉酶活性的Dyella japonica 和Dyella koreensis多肽。
在一个更优选的方面，所述多肽是具有异淀粉酶活性的Dyella japonica 多肽。在一个最优选的方面，所述多肽是具有异淀粉酶活性的Dyella japonica DSM 22712、DSM22713、DSM22714和/或DSM22715多肽，例如，分别包 含SEQ ID NO：2、4、6或8的成熟多肽的多肽。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect and imperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)， 而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将容易地识别适合的等同物的 身份(identity)。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保 藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection) (ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心 (Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏 中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection， Northern Regional Research Center)(NRRL)。
此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆 肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离 微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因 组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多 核苷酸序列，就能够通过使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷 酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。
本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽 融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷 酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。 产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使 它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。
融合多肽还可以包括切割位点。一旦分泌了融合蛋白，就切割所述位点， 从融合蛋白质释放具有异淀粉酶活性的多肽。切割位点的实例包括，但不限 于，编码二肽Lys-Arg的Kex2位点(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol. Biotechnol.3：568-76；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76：245-251； Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：3488-3493；Ward等， 1995，Biotechnology 13：498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology 9： 378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位点，其在精氨酸残基后通过Factor Xa 蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25：505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位 点，其在赖氨酸后通过肠激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology 13： 982-987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其通过Genenase I切割(Carter 等，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics 6：240-248)； Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其在Arg后通过凝血酶切割(Stevens，2003， Drug Discovery World 4：35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其在Gln 后通过TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，见上文)；和 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其在Gln后通过基因工程形式的人鼻 病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，见上文)。
多核苷酸
本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有异淀粉酶活性的 多肽的核苷酸序列，或由编码本发明具有异淀粉酶活性的多肽的核苷酸序列 组成。
本发明的多肽可具体而言由下述多核苷酸编码，所述多核苷酸包含任何 SEQ ID NO：1、3、5和/或7的核苷酸序列，或其编码具有异淀粉酶活性的片 段的亚序列，或者所述多核苷酸由任何SEQ ID NO：1、3、5和/或7的核苷酸 序列，或其编码具有异淀粉酶活性的片段的亚序列组成。
在一个优选的方面，核苷酸序列分别包含SEQ ID NO：1、3、5和/或7或由 SEQ ID NO：1、3、5和/或7组成。在另一个更优选的方面，核苷酸序列包含下 述序列，或由下述序列组成，所述序列包含于保藏的菌株：Dyella japonica NN060811(DSM 22712)；Dyella japonica NN060812(DSM 22713)；Dyella japonica NN060813(DSM 22714)；Dyella japonica NN060814(DSM 22715)。
在另一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、3、5和/或7的成熟 多肽编码序列或由SEQ ID NO：1、3、5和/或7的成熟多肽编码序列组成。
本发明还涵盖了编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽分别包含SEQ ID NO：2、4、6和/或8的氨基酸序列，或其成熟多肽，或者所述多肽分别由SEQ ID NO：2、4、6和/或8的氨基酸序列，或其成熟多肽组成，其中所述核苷酸序列 与SEQ ID NO：1、3、5和/或7，或其成熟多肽编码序列由于遗传密码的简并性 而有差异。本发明还涉及SEQ ID NO：1、3、5和/或7的亚序列，其分别编码 SEQ ID NO：2、4、6和/或8的具有异淀粉酶活性的片段。
本发明还涉及突变多核苷酸，所述突变多核苷酸在SEQ ID NO：1、3、5 和/或7的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，或由在SEQ ID NO：1、3、 5和/或7的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变的组成，其中所述突变核 苷酸序列编码SEQ ID NO：2、4、6和/或8的成熟多肽。
用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基 因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链 式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片 段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis 等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可 以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从Dyella 属菌株，或其它或相关生物体克隆多核苷酸，并且因此可为例如所述核苷酸序 列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。
本发明还涉及包含下述核苷酸序列或由下述核苷酸序列组成的分离的多 核苷酸，所述核苷酸序列分别与SEQ ID NO：1、3、5和/或7的成熟多肽编码 序列具有一定程度的同一性。
本发明还涉及编码具有异淀粉酶活性的多肽的分离的多核苷酸，其由下 述方法获得：
(a)在至少高严格条件下，优选至少非常高严格条件下，将DNA群体与(i) SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7的成熟多肽编 码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链 杂交；
(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有异淀粉酶活性的多肽。
本发明的分离的多核苷酸可为SEQ ID NO：1、3、5和/或7的核苷酸 79-2328中的成熟多肽编码序列。
修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽 可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些 多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比 活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ ID NO：1、 3、5和/或7的成熟多肽编码序列存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上， 和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列 编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子 选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见， 例如，Ford等，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。
对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要 的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸 编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本 领域公知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham 和Wells，1989，见上文)来鉴定。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个 荷正电的残基处，并且测试所得突变分子的异淀粉酶活性，以鉴定对于所述 分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维 结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参 见，例如，de Vos等，1992，见上文；Smith等，1992，见上文；Wlodaver等，1992， 见上文)。
在一个优选的方面，所述互补链是SEQ ID NO：1、3、5和/或7的成熟多 肽编码序列的全长互补链。
核酸构建体
本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的 多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的 宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。
本发明还涉及包含分离的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸包含编 码本发明的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与一个或多个(几个)调控序列 可操作地连接，所述调控序列在表达宿主中指导多肽的产生。
可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。 依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的 或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。
调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的 多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的 转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷 酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞 同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适 启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂 糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀 粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆 菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌 xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer 等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。亦可 使用启动子的组合，如描述于WO99/43835或本申请实施例1中的三重启动子 系统(triple promoter system)，其由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)，解 淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子和包含稳定序列的苏云金芽孢杆 菌cryIIIA启动子组成。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见 上文中描述。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的 实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉 (Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α- 淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Asperillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉 脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶 片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢 Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β- 葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉 内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏 木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏 木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自对于黑曲霉 中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合体)；和它们的 突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶 (ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱 氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫 蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启 动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转 录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地 连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。
用于细菌宿主细胞的终止子的实例包括但不限于从地衣芽孢杆菌BPN’ 和地衣芽孢杆菌amyl的基因获得的那些。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉 TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α- 葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化 酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母 宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的 mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末 端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉 TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇 化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱 氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作 地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转 录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列 在本发明中使用。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米 曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰 孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995， Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基 酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’ 端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌多肽的编码序列片段一起天 然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编 码序列异源的信号肽编码序列。异源信号肽编码序列在编码序列不天然地含 有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取 代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选 宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明 中使用。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号 肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α- 淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、 嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)、克劳氏芽孢杆菌alcaline蛋 白酶(aprH)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993， Microbiological Reviews 57：109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的 信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀 粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、 特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的 基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上文描述。
在一个优选的方面，信号肽分别包含SEQ ID NO：2、4、6和/或8的氨基酸 -26至-1，或者分别由SEQ ID NO：2、4、6和/或8的氨基酸-26至-1组成。在 另一个优选方面，信号肽编码序列分别包含SEQ ID NO：1、3、6和/或8的核苷 酸1至78，或者分别由SEQ ID NO：1、3、6和/或8的核苷酸1至78组成。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序 列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下 称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催 化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶 (aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬 氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)的 基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽序列置于 紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽区置于紧接着前肽区的氨基末 端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽 的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节 化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac、 xyl和trp操纵基因系统。
在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使 用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启 动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真 核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶 酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些 情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的核酸构建体的重组表达载体。
本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、 启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在 一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限 制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是， 可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸 构建体来表达本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序 列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重 组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载 体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体， 其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体 (minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段 (means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并 且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或 质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整 DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经 转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒 抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因， 或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯 霉素或四环素抗性。
对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、 TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙 酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转 移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG (乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸 腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的 等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或米曲霉 的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或允许 载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或 用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体 可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组 染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选 含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对， 并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增 强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目 标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面， 可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的 宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子 (replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定 义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、 pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒 pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4， ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等， 1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175； WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公 开于WO 00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物 的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝 的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷 酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有 选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有所述多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人 员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，可有利地 用于多肽的重组产生中。将包含本发明多核苷酸的载体导入宿主细胞，使载体 如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细 胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细 胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。
本发明还涉及包含本发明的核酸构建体的重组宿主细胞。
宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如， 原核或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性 细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌 属、乳酸菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏 阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、 螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本发明的实施中有用的芽 孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、 环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢 杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热 脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方 面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，细菌宿主 细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣 芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实施中有用的链 球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球 菌兽瘟亚种细胞。
在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面， 细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是乳房链 球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实施中有用的链 霉菌属细胞包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色 链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选 的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主 细胞是天蓝链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌 细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化 (参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)， 使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81： 823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56： 209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751) 或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169： 5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体 转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例 如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将 DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等， 2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989， J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞： 例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)或接 合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可通 过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)， 原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿 孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合 (参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可以使用本领 域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门： 子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota) 和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press， Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见 上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth 等，1995，见上文)。
在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括 产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母 (basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲 (Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言， 将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和 Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。
在一个甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属 (Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉 属细胞。
在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道 格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方 面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最 优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包 括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所 定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、 葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过 菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒 酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可 以是发酵的。
在甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、 烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属 (Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、 毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、 射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属 (Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属 (Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma) 细胞。
在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本 曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主 细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、 异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰 孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一 个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡 菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、 虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌 (Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质 霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫 青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、 刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色 栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉 (Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的 方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法 在EP 238023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由 Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下 文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I. 编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology， Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条 件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。 在一个优选的方面，所述细胞是Dyella属的细胞。在一个更优选的方面，所述 细胞是Dyella japonica。在一个更优选的方面，所述细胞分别为Dyella japonica DSM 22712、Dyella japonica DSM 22713、Dyella japonica DSM 22714和/或 Dyella japonica DSM 22715。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)如本文所述，在有 助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条 件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核 苷酸序列；和(b)回收所述多肽。本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包 括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包 含突变核苷酸序列，其在SEQ ID NO：1、3、5和/或7的成熟多肽编码序列中 具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码多肽，该多肽分别包含SEQ ID NO：2、4、6和/或8的成熟多肽或由SEQ ID NO：2、4、6和/或8的成熟 多肽组成，和(b)回收所述多肽。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的 条件下培养包含编码所述多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回 收所述多肽。在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生 所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许 表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中 的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。 使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包 含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公 开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到 营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培 养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测所述多肽。这些 检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如， 酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方 法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷 雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多 肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和 大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如， 硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson 和Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。
本发明的多肽可在一个具体实施方案中通过淀粉亲和层析来纯化，例如， 通过使用淀粉酶琼脂糖作为亲和材料。其实施方法包括但不限于下文实施例 2中所述的方法。
植物
本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含 分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明具有异淀粉酶活性的多肽，从而 以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者， 同样可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量， 例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)， 或用于破坏抗营养因子。
本发明还涉及用编码本发明的多肽的多核苷酸转化的转基因植物、植物 部分或植物细胞。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子 叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)， 早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)； 寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、 燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)， 马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的 (cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油 菜籽(rape seed)和紧密相关的模式生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实 (fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮 (epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vascular tissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体 (chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧 化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何 植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分， 如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚 (embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。
同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。
表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构 建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽 的一个或多个(几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将 所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所 述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该核苷酸序列所需的适当的调 节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的 选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述 植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。
调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的 选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编 码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶 段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子 或叶。调节序列由例如Tague等，1988，Plant Physiology 86：506所述。
对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动 子(Franck等，1980，Cell 21：285-294，Christensen等，1992，Plant Mo.Biol.18： 675-689；Zhang等，1991，Plant Cell 3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例 如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子 (Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织 (metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24： 863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、 球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等，1998，Plant and Cell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的 种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA 启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄 的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102：991-1000)，小球藻病毒 (chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和 Higgins，1994，Plant Molecular Biology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子 (Kagaya等，1995，Molecular and general genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启 动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。 同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、 干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、 雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)和赤 霉酸(gibberellic acid)，和重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例 如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核 苷酸序列之间。例如Xu等，1993，见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第 一内含子以增强表达。
选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的 那些。
将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包 括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射 (microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science 244： 1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature 338：274)。
目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(gene transfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和 Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且它也可以用于转化 单子叶植物，虽然对于这些植物常常使用其他的转化方法。目前，产生转基 因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒 子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos) (Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单 子叶植物的可供选择的方法基于原生质体转化，如由Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所描述的。
转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体 并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或 在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建 体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的 条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发 明具有异淀粉酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。
组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这 种多肽。术语“富含”表示所述组合物的异淀粉酶活性，例如，以至少1.1的富 集因数(enrichment factor)增加。
所述组合物可以包含本发明的异淀粉酶作为主要酶成分，例如，单成分 组合物。在一个实施方案中，所述组合物可进一步包含一种或多种葡糖淀粉 酶，具体而言其来源于曲霉属、木霉属、踝节菌属(Talaromyces)或栓菌属菌株， 包括黑曲霉、里氏木霉、埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)和瓣环栓菌 (Trametes cingulata)。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含一种或多 种选自下组的其他的酶：蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶 (maltogenic amylase)、α-葡糖苷酶、支链淀粉酶(pullulanase)、己糖基转移酶 (hexosyltransferase)和分支酶。
其他的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，优选棘 孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲 霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰 孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接 骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉 属，优选特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、 长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。
可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组 合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒 (microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法将包括于所述组合物中 的多肽稳定化。
本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域 内已知的方法确定。
用途
本发明还涉及使用具有异淀粉酶活性的多肽或其组合物的方法。
在一个实施方案中，本发明的异淀粉酶可用于饮料如啤酒的糖化 (mashing)工艺。
在一个实施方案中，本发明的异淀粉酶可用于从淀粉产生食物成分。异 淀粉酶通常与其他淀粉水解酶如α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡糖淀粉酶组合使用。 取决于具体的应用，异淀粉酶以50-5000IAU每克淀粉的水平使用。
在从淀粉产生葡萄糖糖浆中，使用α-淀粉酶如细菌α-淀粉酶，例如一种 或多种芽孢杆菌属α-淀粉酶来液化淀粉。接着，可添加葡糖淀粉酶以将淀粉 水解物转化为葡萄糖糖浆。本发明的异淀粉酶的添加可随之导致具有较高葡 萄糖含量的糖浆，同时减少了添加的葡糖淀粉酶的量。
因此本发明还涉及本发明的异淀粉酶或本发明的组合物用于产生葡萄糖 糖浆的用途。
本发明还涉及本发明的异淀粉酶或本发明的组合物用于产生高果糖糖 浆，特别是产生HFCS的工艺中的用途。
对于使用葡糖淀粉酶和异淀粉酶的混合物产生高DX葡萄糖糖浆(例如 97-98DX)所涵盖的方法的具体实例描述于美国专利4,335,208-A，特别是实施 例1、3、4、5、6和7，其通过提述并入本文。
本发明还涉及本发明的异淀粉酶或本发明的组合物在用于产生麦芽糖或 麦芽糖醇的工艺中的用途。
本发明的异淀粉酶还可用于产生麦芽糖和麦芽糖醇。在此种实施方案中， 将异淀粉酶添加至经α-淀粉酶处理之后的液化的淀粉。与此同时，可添加β- 淀粉酶。水解可在大约50-60℃，例如在50-55℃的温度，和大约pH 4-6，例 如约5.0的pH实施。可接着纯化并浓缩所得的高麦芽糖糖浆，并对其进行结 晶以获得结晶麦芽糖。然后可通过催化氢化将麦芽糖转化为麦芽糖醇。麦芽 糖醇在非致龋的(non-cariogenic)硬糖果(hard candy)、口香糖和其他糖果 (confectionary)的生产中用作糖替代物。
本发明的异淀粉酶亦可与环糊精葡聚糖转移酶(CGTase)、麦芽寡糖基海 藻糖合酶(malto-oligosyl trehalose synthase)和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶 (malto-oligosyl trehalose trehalohydrolase)一同用于从液化的淀粉产生二糖海 藻糖。其反应产物为海藻糖糖浆，然后将其纯化并浓缩。海藻糖在食品中(例 如，在烘烤产品、饮料、糖果和早餐谷物食品(breakfast cereal))中用作组织形 成剂、稳定剂、保湿剂和增甜剂。
本发明的异淀粉酶亦可与CGTase一同用于增强从淀粉产生环糊精。举例 而言，通过在大约pH 6和25℃施用异淀粉酶、CGTase和环癸酮的混合物， 从支链淀粉获得了90％收率的β-环糊精。环癸酮是络合剂，其与环糊精分子 形成不可溶的包合络合剂。环糊精作为成胶囊剂(encapsulating agent)用于食物 添加剂、调味料和维生素。
一般而言，异淀粉酶活性优选以1至1,000,000,000IAU/kg DS，更优选 10至100,000,000IAU/kg DS，甚至更优选100至10,000,000IAU/kg DS，且 最优选50,000至5,000,000IAU/kg DS的量使用，或以0.001mg至100000mg EP/kg DS，优选以0.01mg至10000mg EP/kg DS的量，更优选以0.1mg至 1000mg EP/kg DS的量，最优选以1mg至100mg EP/kg DS的量使用。
本发明还涉及使用异淀粉酶、分支酶和淀粉麦芽糖酶(EC 2.4.1.25)产生糖 原的方法，例如，Kajuura等(2008)，Biocatalysis and Biotransformation，26(1-2)： 133-140所述的方法。
材料和方法
材料
α-淀粉酶LS：两份杂合α-淀粉酶与一份嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的混 合物，前者包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C端氨基酸残基(示于WO 99/19457的SEQ ID NO：4)和来源于解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶的37个N端 氨基酸残基(示于WO 99/19467的SEQ ID NO：5)，具有下述取代： G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S；后者具有 下述突变：I181*+G182*+N193F。
葡糖淀粉酶AN：来源于黑曲霉的葡糖淀粉酶。
葡糖淀粉酶T：来源于埃默森踝节菌的葡糖淀粉酶，其公开于WO 99/28448中的SEQ ID NO：7，并可从Novozymes A/S，Denmark获得。
生物材料的保藏
下述的生物材料已经依据布达佩斯条约的条款保藏于德意志微生物和细 胞培养保藏中心(DSMZ)，Inffenstr.7B，D-38124 Braunschweig，Germany，并给 予下述的登录号：
所述菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，依据该外国 专利法律的授权的人能够获得所述培养物。所述保藏物为所保藏菌株的基本 上纯的培养物。在提交了该申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国 专利法律进行要求可以获得所述保藏物。然而，应当理解，保藏物的可获得 性并不构成对实施本发明的许可，实施本发明是对政府行为所授予的专利权 的侵犯。
保藏的供体株的来源
方法：
确定异淀粉酶活性单位(IAU)
淀粉的脱支是作为碘结合的增加，以及由此由于直链葡聚糖比支化的葡 聚糖(支链淀粉)对碘的结合更强而致的蓝色的增加来测量的。
1单位(U)异淀粉酶活性(IAU)为在40℃，pH 4.5，每分钟导致在610处的 吸光度增加0.01的酶的量。
底物：75mM乙酸钠pH 4.5，2mM CaCl2中的1％蜡状玉米淀粉(waxy corn starch)(支链淀粉)。底物应煮沸10-15分钟以溶解淀粉。
碘/中止试剂(stop reagent)：MQ H2O中的10mM I2/KI
硫酸溶液：MQ H2O中的20mM H2SO4
测定法步骤：
混合
1.600微升底物
2.100微升酶溶液(包括应为100微升MQ H2O的对照)
3.在40℃温育30分钟
4.在30分钟之后，取50微升至已经含有50微升碘溶液的Eppendorf试 管。
5.接着添加1.5mL硫酸溶液并将200微升转移至MTP平板。
6.在5分钟之后，在610nm读取吸光度。
活性计算：
U/mL＝OD610(样品)-OD610(对照)/0.01/30分钟/50微升*1000微升
葡糖淀粉酶活性(AGU)
Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2 mM，缓冲液：乙酸0.1M，反应时间5分钟的标准条件下，每分钟水解1微 摩尔麦芽糖的酶量。
可使用自动分析仪系统。将变旋酶添加至葡糖脱氢酶试剂从而使得任何 存在的α-D-葡萄糖转变为β-D-葡萄糖。葡糖脱氢酶与β-D-葡萄糖在上述提及 的反应中特异性反应，形成NADH，使用光度计在340nm处确定NADH作 为起始葡萄糖浓度的量度。
以更多细节描述该分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可应要求从 Novozymes A/S，Denmark获得，该文件夹通过提述并入本文。
本发明进一步通过下述实施例加以描述，其不应视为对本发明范围的限 制。
实施例
用作缓冲液和底物的化学品为至少试剂级的商业产品。
实施例1
在枯草芽孢杆菌中克隆和表达四种来自Dyella japonica的异淀粉酶
使用直链的整合载体系统以供表达克隆四种异淀粉酶基因。所述直链整 合构建体为PCR融合产物，其通过两个枯草芽孢杆菌同源染色体区之间的每 个基因与强启动子和氯霉素抗性标记的融合而制成。所述融合是通过SOE PCR(Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.N.，Pullen，J.K.和Pease，L.R.(1989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes，gene splicing by overlap extension Gene 77：61-68)完成的。该SOE PCR方法亦描述于WO 2003/095658。每个基因是在三重启动子系统(如描述于WO 99/43835)的调控 下表达的，所述系统由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyl)，解淀粉芽孢 杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子和包含稳定序列的苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动 子组成。编码氯霉素乙酰转移酶的基因用作标记。(描述于，例如， Diderichsen，B.；Poulsen，G.B.；Joergensen，S.T.；A useful cloning vector for Bacillus subtilis.Plasmid 30：312(1993))。将最终的基因构建体通过同源重组入 果胶酸裂合酶(pectate lyase)基因座而整合在芽孢杆菌染色体上。
通过QIAmp Tissue Kit(Qiagen，Hilden，Germany)分离四种不同Dyella japonica菌株的染色体DNA。对于每种基因构建体，PCR扩增三个片段：来 自四种Dyella japonica菌种的基因组DNA的基因片段(所有使用的引物列于 下文表1)，上游侧翼片段是用引物#01-iMB1362和iMB1362Uni2，而下游侧 翼片段是用引物#20-iMB1362和oth435从菌株iMB1362(描述于WO 2003/095658)的基因组DNA扩增的。
使用校读(proofreading)聚合酶(PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase， (New England Biolabs，Inc.))扩增所述基因片段。两个侧翼的DNA片段是用 “Expand High Fidelity PCR System”(Roche-Applied-Science)扩增的。PCR反应 是根据标准步骤(遵循生产商的推荐)完成的。PCR条件如下所述：94℃进行2 分钟，接着进行10个循环的(94℃进行15秒，50℃进行45秒，68℃进行4 分钟)，接着进行20个循环的(94℃进行15秒，50℃进行45秒，68℃进行4 分钟(每循环+20秒延伸))并最后在68℃进行一个循环10分钟。将3个所得的 片段以等摩尔比混合，并在下述条件下运行新的PCR反应：首先在94℃进行 2分钟，接着进行10个循环的(94℃进行15秒，50℃进行45秒，68℃进行5 分钟)，10个循环的(94℃进行15秒，50℃进行45秒，68℃进行8分钟)，15 个循环的(94℃进行15秒，50℃进行45秒，68℃进行8分钟，此外每循环多 进行20秒)。在第一个循环之后，添加两个末端引物#01-iMB1362：和 #20-iMB1362(每个20pMol)。将两个微升的PCR产物转化入枯草芽孢杆菌， 并在含有氯霉素(6微克/mL培养基)的LB平板上选择转化体。选择含有不具 有导致氨基酸变化的突变的构建体的克隆以供在液体培养基中进行发酵。
表1.使用的引物
发酵
将克隆从-80℃储备与6微克/mL氯霉素划线于LB-琼脂平板，并在37℃ 生长过夜。将菌落转移至500mL摇瓶中的100mL Cal-18培养基。将培养物 在26℃以170rpm振荡2或3日。将细胞旋下(spin down)，并通过实施例2 中所述的方法从上清纯化酶。
实施例2
通过淀粉亲和层析纯化Dyella异淀粉酶
通过由下述级别的Whatman滤纸：D、A、B、C和F组成(其中F在底 部)的双滤纸夹层(sandwich layer)来过滤粗发酵物。然后在该粗过滤之后用具 有0.2微米孔径截取值的真空吸盘过滤器(vacuum cup filter)进行真空过滤。
记录滤过物的容积，并在缓慢搅拌下添加CaCl2以得到1mM的最终浓 度。向900mL的滤过物添加100mL的1M磷酸钠缓冲液pH 6.5以获得0.1M 的终浓度。检查pH为6.5，并视需要进行调整。缓冲液的添加可能造成一些 沉淀，在此事件下，使用具有0.2微米截取值的真空吸盘过滤器重复进行真 空过滤步骤。
与此同时准备柱(12x2.6cm)，其用0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.5平衡的直 链淀粉-琼脂糖亲和柱材料(购自New England Biolabs)。将200mL经缓冲的培 养滤过物混合物加载于柱(5mL/分钟)，并收集流过物(flow through)。用0.1M 磷酸盐缓冲液洗涤柱直至UV吸光度稳定(收集洗涤物)。通过用0.1M磷酸盐 缓冲液+20％麦芽糖洗涤柱将异淀粉酶从柱洗脱。当吸光度开始升到基线水平 之上时，收集峰直至基线再次稳定(大约50-100mL总体积)。用0.1M磷酸盐 重新调适柱，直至达到稳定的基线，并重复加载、洗涤、洗脱循环直至用尽 所有的异淀粉酶上清。在第一次运行之后，进行4-20％Tris-甘氨酸SDS PAGE 凝胶以检查异淀粉酶在加载物、柱流过物、柱洗涤物和洗脱级分中的存在。
将20微升样品与20微升样品缓冲液混合，并加热至95℃10分钟。将 20微升上样于每条泳道，并以35mA运行凝胶1小时。使用来自Invitrogen 的简单Blue safe染色呈现蛋白条带。Dyella异淀粉酶表现为80KD处的单一 条带。
一旦达到了纯净，汇集异淀粉酶级分，然后使用配置有30KD截取值的 膜的Amicon Ultra超离心单元对其进行浓缩(以3000rpmxg旋转30分钟， 弃去滤过物，并继续加载/浓缩循环直至用尽所有汇集的级分)。一旦经浓缩， 将浓缩物用0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.5洗涤数次以去除20％麦芽糖。用移液 管移取浓缩的异淀粉酶并储藏。用0.1M磷酸盐缓冲液洗涤内膜数次，并将 每次所得的洗涤物与浓缩物汇集(这是重要的，因为非特异性结合会导致显著 的样品丧失)。记录最终体积。
使用磷酸盐缓冲液将分光光度计置零(zero)在280nm处测量吸光度。若 吸光度大于2.0，则在0.1M磷酸盐缓冲液中稀释样品使得吸光度读数落入 0.5-1.5。
如此计算蛋白浓度：A280值/摩尔吸光度(从氨基酸序列计算)x稀释因子。 获得的值以mg/ml为单位。
通过添加甘油将样品配置为50％的最终浓度。
实施例3
将经喷雾干燥的从用α-淀粉酶LS液化的普通玉米淀粉产生的DE11麦芽 糊精溶解于去离子水，并将pH和固形物水平调整至分别为大约4.3和30％。 将含有15g干固形物的底物等分试样转移至配置有磁性搅拌器的50mL蓝盖 (blue-cap)烧瓶，然后将所述烧瓶置于58℃的水浴中。然后根据下述方案添加 不同量的葡糖淀粉酶AN和Dyella japonica异淀粉酶(NN060812)，并将pH调 整至4.3。
以固定时间间隔取样，并通过加热样品至沸腾来中止反应。在稀释和灭 菌过滤之后，通过HPLC就D-葡萄糖对样品进行分析。
这些数据显示当将Dyella异淀粉酶与黑曲霉葡糖淀粉酶组合时可以获得 更高的D-葡萄糖收率。与此同时，可显著减少葡糖淀粉酶剂量。
实施例4
如实施例2中所述制备DE11麦芽糊精底物。根据下述方案添加不同量 的葡糖淀粉酶AN、葡糖淀粉酶T和Dyella japonica异淀粉酶(NN060812)。 糖化反应在58℃，pH 4.3进行。以固定时间间隔取样，并通过将样品加热至 沸腾来中止反应。在稀释和灭菌过滤之后，通过HPLC就D-葡萄糖对样品进 行分析。
这些数据显示可通过使用0.24AGU/g DS葡糖淀粉酶T(埃默森踝节菌 葡糖淀粉酶)和100-200IAU/g DS Dyella japonica异淀粉酶来获得与葡糖淀粉 酶AN(黑曲霉葡糖淀粉酶)相当的性能。
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只用于受理局
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机译： 具有异淀粉酶活性的多肽及其编码多核苷酸
机译： 具有异淀粉酶活性的多肽及其编码多核苷酸
机译： 具有异淀粉酶活性的多肽和编码相同的多核苷酸
