纤溶酶原和纤溶酶的变体

摘要

本发明涉及纤溶酶原和纤溶酶的变体，这些变体在催化结构域中包括一个或多个点突变，这些点突变降低或防止了纤溶酶的蛋白酶活性的自催化破坏。还披露了使用所述纤溶酶原和纤溶酶的变体的组合物、用途和方法。

说明书

发明领域

本发明涉及纤溶酶原和纤溶酶的变体，这些变体在催化结构域中包括一 个或多个点突变，这些点突变降低或防止了纤溶酶的蛋白酶活性的自催化破 坏(autocatylic destruction)。还披露了使用所述纤溶酶原和纤溶酶的变体的 组合物、用途和方法。

发明背景

酶原纤溶酶原(zymogen plasminogen)的激活导致溶解纤维蛋白/溶解 血栓活性丝氨酸蛋白酶纤溶酶的形成。内源性纤溶酶原的激活可以通过给予 一种纤溶酶原激活剂来触发或增强，该纤溶酶原激活剂如尿激酶、链激酶、 葡萄球菌激酶或tPA、或它们的任何变体。经过激活，该纤溶酶原蛋白被以 蛋白水解的方式切割成包括5个kringle结构域的一个重链和包括催化结构域 的一个轻链。这两个链是通过2个二硫键而结合在一起的。在激活后，自溶 裂解从重链中去除了一个N端区段(人纤溶酶的78个氨基酸；牛纤溶酶的 77个氨基酸)并且牛纤溶酶重链可以在kringles 3与4之间进一步自身催化裂 解，由此产生牛中型纤溶酶(midiplasmin)(克里斯滕森等人，1995， Biochem J 305，97-102)。由在人纤溶酶原中的R561-V562肽键的切割所触发 的纤溶酶原到纤溶酶的激活诱导了轻链中大的构象变化，所述变化导致了所 述轻链内的催化三联体的启动或激活。细菌纤溶酶原激活剂如链激酶和葡萄 球菌激酶与纤溶酶原形成一种复合体，并且在没有切割纤溶酶原的R561- V562肽键下，由于在激活剂-纤溶酶原复合体形成后的构象变化，纤溶酶原的 催化部位被激活(纤溶酶原激活机制总结于例如特兹延等人，2004；Proteins 56：277-284的前言部分)。

然而纤溶酶原激活剂充当间接血栓溶解剂，可替代地建议使用纤溶酶本 身作为一种直接纤维蛋白溶解剂/血栓溶解剂。然而这种直接使用被以下事实 阻碍，即纤溶酶与多种蛋白酶一样受到自身催化性蛋白水解性降解，这遵循 经受产物抑制作用的二级动力学(杰斯普森等人，1986，血栓形成研究41 (Thrombosis Research 41)，395-404)。

在1960年代早期，确立了纤溶酶可以在酸性pH下稳定，或可替代地 在中性pH下稳定，倘若存在一种氨基酸如赖氨酸。尽管如此，报道了甚至当 纤溶酶保存在pH 3.8下在Lys104、Arg189以及Lys622(相对于Lys-纤溶酶 而编号)之后的自溶裂解(WO01/36608)。当纤溶酶被保存在甚至更低的 pH 2.2下时，在位置Asp62、Asp154以及Asp346处的Asp-Pro(D-P)之间 发生了非自溶酸裂解(WO01/36608)。这说明pH可以被降低到一个点，在 这个点处不再发生明显的自身催化降解，但是在这个点处，酸水解成为失去 稳定性的一个因素。在WO01/36608中不存在关于纤溶酶中哪一个肽键在中 性pH下易受水解作用(自身催化)影响的信息。已知的纤溶酶稳定剂包括甘 油、足够高的离子强度、纤维蛋白原以及ε-氨基己酸(EACA)，如杰斯普森 等人(1986，血栓形成研究41(Thromb Res 41)，395-404)所披露的。赖氨 酸和赖氨酸衍生物(如EACA和氨甲环酸)以及对氨甲苯酸(PAMBA)是一 些另外的已知稳定剂(Uehsima等人，1996，Clin Chim Acta 245，7-18； Verstraete 1985，Drugs 29，236-261)。US 4,462,980报道了纤溶酶聚集物的形 成促进了纤溶酶降解，尽管在酸性条件下保存。在US 4,462,980中通过加入 一种多羟基化合物提供了对于这个问题的解决方案。稳定纤溶酶的其他方法 包括加入寡肽化合物(例如US 5,879,923)。可替代地，纤溶酶的催化部位可 以通过衍生作用例如酰化而可逆地封闭(EP 0009879)。还提出了纤溶酶的 聚乙二醇化作用作为稳定该酶的一种手段(WO 93/15189)。

描述了除了截短形式纤溶酶以外的许多纤溶酶变体，并且包括一种嵌合 微纤溶酶(WO 2004/045558)以及在双链切割位点处(US 5,087,572)或在一 个催化性三联体氨基酸处(Mhashilkar等人，1993，Proc Natl Acad Sci美国90， 5374-5377；Wang等人，2001，J Mol Biol 295，903-914)具有一个点突变的变 体。Wang等人(1995，蛋白质科学4(Protein Science 4)，1758-1767和1768- 1779)报道了一个广泛系列的在氨基酸位置545、548、550、555、556、 558、560-564、585、740以及788处的微纤溶酶原突变体。林德等人(1998， Eur J Biochem 251，472-479)报道了一个双重突变体，其中在氨基酸位置558 和566处半胱氨酸置换丝氨酸。武田-志鷹等人(1999，Chem Pharm Bull 47， 322-328)提及了一种具有活性降低的纤溶酶变体，其变异涉及在氨基酸位置 601处的丙氨酸置换为苏氨酸。以上所有的氨基酸位置是指相对于在氨基酸位 置1处以Glu开始的Glu-纤溶酶原。一种不可切割的纤溶酶原变体(重链与 轻链之间的切割受损)描述于WO 91/08297中。道森等人(1994，生物化学 (Biochemistry)33，12042-12047)描述了一种Glu-纤溶酶原变体(其中在位 置719处以Glu代替了Arg)(R719E)对于链激酶降低的亲和力。杰斯普等 人(1998，生物化学(Biochemistry)37，6380-6386)在丙氨酸扫描(Ala- scan)中产生了噬菌体展示微纤溶酶原单位点突变体系列H569A、R610A、 K615A、D660A、Y672A、R712A、R719A、T782A、R789A，并且发现位置 719处的精氨酸对于与链激酶的相互作用是关键的；该D660A突变体由于非 常低的表达而没有被进一步表征；只有R719A突变体以可溶态被另外产生。 这些突变体中没有任何一个展示出在蛋白水解活性方面的重大变化(底物S- 2403)。杰斯普等人(1998)在他们的分析中还包括一种活性位点突变体 S741A；这种突变体的晶体结构披露于Wang等人(2000，J Mol Biol 295，903- 914)中。在阐明链激酶/纤溶酶原相互作用位点的进一步尝试中，特兹延等人 (2004，Proteins 56，277-284)报道了在已经突变的背景(R561A)下的多种微 纤溶酶原突变体(K698M、D740N、S741A)，后者抑制了纤溶酶原的蛋白 质分解性激活并且因此抑制了活性微纤溶酶的形成(这将使得对于链激酶-微 纤溶酶原复合体的接触活化机理的研究复杂化)。特兹延等人(2004)进一 步提及了一种“不经意的”三倍突变体R561A/H569Y/K698M，这种突变体显然 与双重突变体R561A/K698M相比在功能上无重要性。Wang等人(2000，Eur J Biochem 267，3994-4001)，在研究链激酶/纤溶酶(原)相互作用中，产生 了一组微纤溶酶原(Glu-纤溶酶原的氨基酸530-791)突变体(在Cys536Ala 和Cys541Ser背景下)。这些突变体包括如以上所述的R561A突变(特兹延 等人(2004))连同R561A/K698G、R561A/K698A以及R561A/K698Q双重突 变体。在相同的C536A/C541S背景下，还引入了单个K698G和K698A突 变，其中K698G由于难以纯化而没有被进一步表征。以上研究针对获得对于 纤溶酶原/纤溶酶分子的特征的更好理解并且没有报道纤溶酶原/纤溶酶突变体 的任何临床有用性或益处或推定的临床优点。Peisach等人(1999，生物化学 38(Biochemistry 38)，11180-11188)成功确定了含有M585Q、V673M和 M788L突变的微纤溶酶原的晶体结构。

Nguyen & Chrambach(1981，Preparative Biochem 11，159-172)报道了 10.0kDa的“一种较次要的并且未鉴定的蛋白质组分”的存在，它是一种基于还 原SDS-PAGE的尿激酶激活的纤溶酶(同种溶素)的粗制商业制品。依赖于 pH的人纤溶酶在自溶方面的差异已经详细描述于Shi & Wu(1988，血栓形成 研究51(Thrombosis Research 51)，355-364)中。大山等人(2004，Eur J Biochem 271，809-820)提出了在癌症的治疗中使用非赖氨酸类似物纤溶酶原 调节剂(由于纤溶酶的自溶被此类化合物增强)，纤溶酶自溶的增强导致了 血管生成抑制素的形成(在纤溶酶原激活剂尿激酶的存在下)。大山等人 (2004)的表3中列出了经受增强自溶的化合物的纤溶酶内多达15个切割位 点。在鉴于现有技术讨论他们的观察时，看起来增强自溶的化合物或多或少 地选择性地增强了B/轻链的蛋白水解，然而发现在缺乏这些增强自溶的化合 物下A/重链和B链两者的降解最少。

所清楚的是以上多种方法/变体中没有任何一种解决了提供在分子水平 稳定的纤溶酶的问题。提供一种具有内在抗自身催化降解的催化结构域的纤 溶酶变体(或纤溶酶可以从其衍生的一种相应的纤溶酶原变体))将是迈向 纤溶酶的有效和安全的长期保存并且对于有效和安全的治疗用途(如在血栓 溶解疗法或在眼中诱导玻璃体后部脱离或玻璃体液化中的重要一步。

发明内容

本发明涉及分离的纤溶酶原变体或从其获得的纤溶酶，或涉及分离的纤 溶酶变体，或涉及任何所述纤溶酶的蛋白水解活性的或可逆的无活性的衍生 物，其特征在于所述纤溶酶原或纤溶酶变体或所述衍生物在它们的催化结构 域内包括在位置P处至少一个内部氨基酸(该内部氨基酸与位置P+1的内部 氨基酸的肽键易于自溶)突变成这样一个氨基酸，该氨基酸与位置P+1的内 部氨基酸的肽键较不或不易于自溶。

可替代地，根据本发明的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物 在它的催化结构域内包括位置P和P’处至少两个内部氨基酸(这些内部氨基 酸与位置P+1和P’+1的内部氨基酸的肽键易于自溶)突变成这样的氨基酸， 这些氨基酸与位置P+1和P’+1的内部氨基酸的肽键较不或不易于自溶。

具体地，在位置P或P和P’处的所述内部氨基酸是赖氨酸或精氨酸。

更确切地说，在位置P处或在位置P和P’处的至少一个或两个内部氨 基酸可以是以下各项中的至少一项或至少两项：

(i)在人纤溶酶催化结构域的位置137处的赖氨酸，或一种非人类纤 溶酶催化结构域的相应的赖氨酸或精氨酸；

(ii)在人纤溶酶催化结构域的位置147处的赖氨酸，或一种非人类纤 溶酶催化结构域的相应的赖氨酸或精氨酸；或

(iii)在人纤溶酶催化结构域的位置158处的精氨酸，或一种非人类纤 溶酶催化结构域的相应的精氨酸或赖氨酸；

其中所述人纤溶酶催化结构域以位置1处的氨基酸缬氨酸开始，它是在人 Glu-纤溶酶原的位置562处出现的相同的缬氨酸氨基酸。

可替代地，在位置P处的所述至少一个内部氨基酸是人纤溶酶催化结构 域的位置147处的赖氨酸，或是一种非人类纤溶酶催化结构域的相应的赖氨 酸或精氨酸，其中所述人纤溶酶催化结构域以位置1处的氨基酸缬氨酸开 始，它是在人Glu-纤溶酶原的位置562处出现的相同的缬氨酸氨基酸。任选 地，在人纤溶酶催化结构域的位置147处的赖氨酸(或一种非人类纤溶酶催 化结构域的相应的赖氨酸或精氨酸)具有一个突变的纤溶酶原变体、纤溶酶 变体、或纤溶酶衍生物可以进一步包括一个在人催化结构域的位置137和/或 158处的内部氨基酸的突变或一个非人类纤溶酶催化结构域的相应的赖氨酸和 /或精氨酸的突变，其中所述人纤溶酶催化结构域以位置1处的氨基酸缬氨酸 开始，它是在人Glu-纤溶酶原的位置562处出现的相同的缬氨酸氨基酸。

在另一个替代方案中，根据本发明的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤 溶酶衍生物是这样的：

(i)如果所述的在位置P处的至少一个内部氨基酸的突变是在人纤溶 酶催化结构域的位置137处(相对于人Glu-纤溶酶原是氨基酸位置698)的赖 氨酸突变成这样一个氨基酸，该氨基酸使得氨基酸137与138之间的肽键更 加抵抗自溶，则所述纤溶酶原变体、纤溶酶变体或纤溶酶衍生物在氨基酸位 置561和562处(相对于人Glu-纤溶酶原)包括一个完整的激活位点并且当 存在催化结构域之外的在位置536和541处(相对于人Glu-纤溶酶原)的氨 基酸时，所述氨基酸是野生型半胱氨酸，或

(ii)如果所述的在位置P处的至少一个内部氨基酸的突变是在人纤溶 酶催化结构域的位置158处(相对于人Glu-纤溶酶原是氨基酸位置719)的精 氨酸突变成一个丙氨酸或谷氨酸，则在位置P’处在人纤溶酶催化结构域的至 少一个其他内部氨基酸(该内部氨基酸与位置P’+1的内部氨基酸的肽键易于 自溶)突变成这样一个氨基酸，该氨基酸与位置P’+1的内部氨基酸的肽键较 不或不易于自溶。

根据以上的(i)或(ii)的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物 可以进一步包括在人催化结构域的位置147处的内部氨基酸的一个突变或一 种非人类纤溶酶催化结构域的相应的赖氨酸或精氨酸的一个突变，其中所述 人纤溶酶催化结构域以位置1处的氨基酸缬氨酸开始，它是在人Glu-纤溶酶 原的位置562处出现的相同的缬氨酸氨基酸。

根据本发明的任何纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物的进一 步特征可以在于它的自溶常数是野生型纤溶酶的自溶常数的至多95％。

根据本发明的任何纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物的进一 步特征可以在于催化常数k_cat是在野生型纤溶酶的k_cat的10％至200％的范围 内。

根据本发明的任何纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物的进一 步特征可以在于它的自溶常数是野生型纤溶酶的自溶常数的至多95％并且它 的催化常数k_cat是在野生型纤溶酶的k_cat的10％至200％的范围内。

不强加任何限制，根据本发明的任何以上纤溶酶原变体、纤溶酶变体、 或纤溶酶衍生物可以是Glu-纤溶酶原或Glu-纤溶酶、Lys-纤溶酶原或Lys-纤 溶酶、中型纤溶酶原或中型纤溶酶、小纤溶酶原或小纤溶酶、微纤溶酶原或 微纤溶酶、δ-纤溶酶原或δ-纤溶酶中的一种。

本发明进一步涉及根据本发明的分离的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或 纤溶酶衍生物、或它们的任何组合用作一种药物。

本发明还涉及包括根据本发明的一种分离的纤溶酶原变体、纤溶酶变 体、或纤溶酶衍生物、或它们的任何组合以及至少一种药学上可接受的稀释 剂、载体或助剂的组合物。这种组合物可以任选地进一步包括至少一种抗凝 剂、一种血栓溶解剂、一种抗炎剂、一种抗病毒剂、一种抗细菌剂、一种抗 真菌剂、一种抗血管生成剂、一种抗有丝分裂剂、一种抗组织胺剂或一种麻 醉剂。

本发明还包括根据本发明的一种分离的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或 纤溶酶衍生物的任何有益应用。不强加任何限制，这些包括：在受试者体内 诱导或促进一种病理性纤维蛋白沉积的溶解，在眼中诱导玻璃体后部脱离和/ 或在眼中诱导玻璃体液化，协助在受试者的眼中的外科玻璃体切割术，受试 者体内的受损组织的酶清创术，降低受试者体内的循环纤维蛋白原，降低受 试者体内的α2-抗纤溶酶水平，降低病理性纤维蛋白沉积的风险。

本发明进一步涉及用于筛选一种自溶稳定性纤溶酶变体的方法，所述方 法包括以下步骤：

(i)在野生型纤溶酶的催化结构域内鉴定位置P处的至少一个内部氨 基酸，该内部氨基酸与位置P+1的内部氨基酸的肽键易于自溶，

(ii)将在(i)中鉴定的位置P处的氨基酸突变成这样一个氨基酸，该 氨基酸与位置P+1的内部氨基酸的肽键较不或不易于自溶，

(iii)确定从(ii)获得的突变体的自溶稳定性，并且

(iv)从(iii)中选择一种自溶稳定性突变体作为自溶稳定性变体。

可替代地，用于筛选一种自溶稳定性纤溶酶变体的此类方法可以包括以 下步骤：

(i)将人纤溶酶催化结构域的位置137、147和158处的一个或多个 精氨酸或赖氨酸氨基酸、或一种非人类纤溶酶的相应精氨酸或赖氨酸突变成 不同于天然氨基酸的一个氨基酸，

(ii)确定从(i)获得的突变体的自溶稳定性，并且

(iii)从(ii)中选择一种自溶稳定性突变体作为自溶稳定性纤溶酶变 体；

其中所述人纤溶酶催化结构域以位置1处的氨基酸缬氨酸开始，它是在人 Glu-纤溶酶原的位置562处出现的相同的缬氨酸氨基酸。

任何上述筛选方法可以任选地进一步包括一个其中确定该自溶稳定性纤 溶酶变体的蛋白水解活性的步骤。

本发明进一步包括用于增强一种包括纤溶酶的组合物的长期保存稳定性 的方法，所述方法包括鉴定一种能够长期保存而没有显著损失蛋白水解活性 的自溶稳定性纤溶酶变体的步骤。

本发明进一步包括用于产生一种根据本发明的纤溶酶原变体的方法，所 述方法包括以下步骤：

(i)将编码一种根据本发明的纤溶酶原的核酸导入适合的能够表达所 述纤溶酶原的宿主细胞中；

(ii)使在(i)中获得的宿主细胞在足以使所述纤溶酶原在所述宿主细 胞中表达的条件和时间下生长；并且

(iii)收获在(ii)中表达的纤溶酶原。

此类方法可以任选地进一步包括一个步骤(iv)，其中将在(iii)中收获的 纤溶酶原进行纯化。

本发明同样包括用于产生一种根据本发明的纤溶酶变体的方法，所述方 法包括以下步骤：

(i)将编码一种根据本发明的纤溶酶原的核酸导入适合的能够表达所 述纤溶酶原的宿主细胞中；

(ii)使在(i)中获得的宿主细胞在足以使所述纤溶酶原在所述宿主细 胞中表达的条件和时间下生长；

(iii)收获在(ii)中表达的纤溶酶原；

(iv)将(iii)的纤溶酶原激活成纤溶酶。

此类方法可以进一步任选地包括一个步骤，其中将在(iii)中收获的纤溶 酶原在(iv)的激活之前进行纯化。另外，在用于产生一种根据本发明的纤溶 酶变体的任何方法中，可以任选地将在(iv)中获得的活性纤溶酶纯化。仍然 另外地，可以任选地将根据本发明的方法产生的活性纤溶酶衍生和/或可逆地 灭活。

本发明进一步涉及编码根据本发明的一种纤溶酶原变体或纤溶酶变体的 分离的核酸序列。包括此类核酸的重组载体也是本发明的一部分，正如用这 种核酸或重组载体转化的宿主细胞也是本发明的一部分。

图注

图1.具有野生型人Glu-纤溶酶原的氨基酸位置(1到791)和纤溶酶 催化结构域(1到230，氨基酸序列和编号是粗体)的双重编号的氨基酸序 列。用于证明本发明所使用的微纤溶酶原开始于氨基酸位置543(相对于 Glu-纤溶酶原而编号)。在氨基酸位置137、147和158(相对于纤溶酶催化 结构域而编号)处突出显示的氨基酸被确定为是这样的氨基酸，这些氨基酸 分别与位置138、148和159处的氨基酸的肽键对于自身催化裂解是敏感的。 将Kringle结构域(如从GenBank登录号AAA36451中所包含的信息所得到 的)加框并且它们的氨基酸序列用普通字母和斜体字母交替打字。催化三联 体氨基酸被圈住。

图2.大规模产生的微纤溶酶的尺寸排阻层析(SEC)特征曲线。收集 相应于部分编号5(前峰1)、部分编号7&8(前峰2)、部分编号10-12 (微纤溶酶峰)、以及部分编号15&16(后峰)的洗脱液并且使其中的材料 经受N端氨基酸测序(埃德曼降解)。在部分编号17-18附近洗脱的峰相应 于缓冲液峰。AU：吸收单位。

图3.大规模产生的微纤溶酶的还原SDS-PAGE分析。泳道1：分子量 梯状条带，左侧指出了分子量。泳道2：微纤溶酶原。泳道3：在pH 3.1的微 纤溶酶。泳道4：在pH 4.0的微纤溶酶。泳道5：在pH 5.0的微纤溶酶。泳 道6：在pH 6.0的微纤溶酶。泳道7：在pH 7.0的微纤溶酶。将所有样品 (最终蛋白质浓度为0.6mg/mL)在20℃下在所指出的pH下放置4小时， 然后在-70℃下冷冻。将凝胶用考马斯亮蓝染色。μPlg＝微纤溶酶原，μPl＝ 纤溶酶，前面＝引导凝胶前面。

图4.将微纤溶酶在一种中性pH的缓冲液中孵育，然后在所指出的时 间后收集样品并且用SDS-PAGE(A)或蛋白质印迹(B)进行分析。箭头“a” 指示完整的微纤溶酶，而箭头“b”和“c”分别指示通过自身催化产生的大约15 kDa和大约10kDa的片段。

图5.通过蛋白质印迹评定的微纤溶酶自溶的动力学(圆圈)相应于微 纤溶酶活性的损失(方块)。

图6.(A)将微纤溶酶在PBS(方块)或在猪眼玻璃体(圆圈)中稀释 到1.53μM的终浓度，并且在不同的时间点测定活性微纤溶酶的剩余浓度。

(B)在所指示的时间点收集猪眼玻璃体样品并且通过蛋白质印迹进行分析。箭 头指示了一个大约15kDa的片段。

图7.(A)微纤溶酶变体Lys137Met(K137M)在固定的抗纤溶酶抗体 上的免疫亲和层析。将收集的洗脱部分在X轴(洗脱体积)上编号为1-11。 (B)在(A)中进行的免疫亲和层析的洗脱部分的还原SDS-PAGE分析。泳道 1：分子量梯状条带。泳道2：洗脱液部分2。泳道3：洗脱液部分3；泳道 4：洗脱液部分4；泳道5：洗脱液部分5；泳道6：洗脱液部分6；泳道7： 粗上清液。凝胶是考马斯染色了的。

图8.(A)用重组葡萄球菌激酶激活K137M变体。10分钟后，活性达 到最大值(箭头所指示的)，然后随着自溶灭活发生而下降。(B)K137M变 体的还原SDS-PAGE表明，用葡萄球菌激酶的激活在10分钟内几乎完全，并 且活性的丧失是由于自溶降解，如由大约17kDa和大约8kDa的两个片段的 积累所证明。泳道1-7表示在加入葡萄球菌激酶之后0分钟、10分钟、1小 时、2小时、3小时、6小时和24小时收集的样品。(▲)微纤溶酶原，微 纤溶酶，自溶降解片段。(C)在加入葡萄球菌激酶之后0分钟、10分钟和 6小时收集的样品的HPLC分析。在加入葡萄球菌激酶之后10分钟获得的 HPLC特征曲线表明，大约85％的无活性微纤溶酶原已经转化成活性的微纤 溶酶种类，并且在t＝6小时处的HPLC特征曲线显示出存在自溶降解片段 与(B)中所示的SDS凝胶一致。通过与用高度纯化的微纤溶酶(没 有示出)确立的标准曲线进行比较，使用在t＝10分钟(箭头)处的微纤溶酶 峰面积来计算活性种类的浓度。所有的HPLC数据都是使用一种Acquity UPLC仪器(Waters)来获得的。典型地，将微纤溶酶样品在0.1％三氟乙酸 (TFA)、5％乙腈中稀释5倍并且注射到一个BEH300 C18 Acquity UPLC柱 (Waters)中，该柱预先平衡在0.1％TFA、34％乙腈中。然后用34％到44％ 的乙腈、0.1％TFA中的1.5-mL线性梯度进行洗脱，并且将蛋白质通过在214 nm处的吸光度进行检测。将柱温维持在75℃，并且在100μL/min的流速下 进行所有实验。(D)将通过HPLC在t＝10分钟处的K137M的微纤溶酶的量 化与后续的剩余活性的降低组合来计算在每个时间点的样品中存在的完整的 活性微纤溶酶的摩尔浓度。将数据代入方程1(参见实例3)来计算对于自溶 的二级速率常数(k)。空心圆圈(○)代表对于K137M变体的数据。为了 比较，还表示了用另一种变体(K147A-R158A)获得的一个类似的数据集 (●)。

图9.对于K137M微纤溶酶变体的动力学参数的确定。在不同的底物 (S-2403)浓度根据初始水解速率(v_i)的测量来确定k_cat和K_m。将数据代入 方程2(参见实例4)。

图10.从GenBank检索的哺乳动物纤溶酶原蛋白的氨基酸序列比对。序 列比对是用通过国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology  Information，NCBI)网站可得的具有默认设置的COBALT软件(基于约束的 多重对比工具；Papadopoulos & Agarwala，Bioinformatics 23：1073-79，2007)来 进行的。指示Glu-纤溶酶原的开始。氨基酸编号是相对于人纤溶酶原 的。

发明详细说明

本发明是基于研究纤溶酶在中性pH下的蛋白水解活性的非强迫性自身 灭活所依赖的机理的结果，本发明人选择该研究集中于主要由纤溶酶的催化 结构域组成的微纤溶酶。对于纤溶酶裂解敏感的肽键位于赖氨酸或精氨酸的 C端(Weinstein & Doolittle，1972，Biochim Biophys Acta 258，577-590)。纤溶 酶催化结构域(在人Glu-纤溶酶原中，开始于氨基酸位置562处的一个缬氨 酸)中几乎10％(230个中有22个)的氨基酸是赖氨酸或精氨酸。理论上， 在一个纤溶酶分子中这些赖氨酸和精氨酸的所有肽键C端可以被另一个纤溶 酶分子以蛋白水解的方式切割。

因此，本发明的一个方面涉及纤溶酶分子并且涉及纤溶酶原分子、特别 是可激活/可能被激活成纤溶酶的纤溶酶原分子，在它们的催化结构域内包括 一个或多个这样的氨基酸突变，使得在野生型纤溶酶或纤溶酶原中的易受自 溶性降解的肽键在本发明的主题纤溶酶和纤溶酶原分子中较不受到或不受到 自溶性降解。

换言之，本发明涉及一种分离的纤溶酶原变体或从其获得的纤溶酶，或 一种分离的纤溶酶变体，或任何所述纤溶酶的一种蛋白水解活性的或可逆的 无活性的衍生物，其特征在于所述纤溶酶原或纤溶酶变体或它们的衍生物在 它的催化结构域内包括位置P处至少一个内部氨基酸(该内部氨基酸与位置 P+1的内部氨基酸的肽键易于(或敏感于、易感于、或易受)自溶)突变成 这样一个氨基酸，该氨基酸与位置P+1处的内部氨基酸的肽键较不或不易于 (或较不或不敏感于、易感于、或易受)自溶。具体地，所述的在位置P处 的内部氨基酸是一个赖氨酸或精氨酸。如在此所引用的(除非另外指明)， 纤溶酶的催化结构域是相对于人纤溶酶而编号的，它以位置P＝1处的缬氨酸 开始，与人Glu-纤溶酶原的位置562处的缬氨酸相同(参见图1)。在此还可 以参照在纤溶酶催化结构域中的两个不同的氨基酸位置，它们分别被称为P 和P’。

可替代地，根据本发明的纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物 在它的催化结构域内可以包括位置P和P’处至少两个内部氨基酸(这些内部 氨基酸与位置P+1和P’+1的内部氨基酸的肽键易于自溶)突变成这样的氨基 酸，这些氨基酸与位置P+1和P’+1的内部氨基酸的肽键较不或不易于自溶。

在已经鉴定位置P处的氨基酸之后，本领域的普通技术人员能够容易地 决定在位置P处的野生型氨基酸可以突变成哪一种其他氨基酸。这样的决定 可以、但是不必须必定隐含指标如氨基酸大小、氨基酸电荷、氨基酸极性、 和/或氨基酸亲水指数(参见表1)。具体地，对于纤溶酶和纤溶酶原，在位 置P处的所述内部氨基酸极有可能是一个赖氨酸或精氨酸，这意味着这些可 以被突变成分别不同于精氨酸和赖氨酸的氨基酸。而且，纤溶酶原和纤溶酶 催化结构域的晶体结构的可用性(MMDB ID：12717；PDB ID：1DDJ；Wang等 人，2001，J Mol Biol 295，903-914)在帮助鉴定突变体氨基酸(这样生成的突 变体纤溶酶或纤溶酶原分子保持蛋白水解活性)方面具有重要价值。此外， 可以预料到在所述位置P处一个野生型氨基酸突变成一个给定组的任一氨基 酸将产生类似的效果。基于表1，所述给定组可以如以下所定义：

-疏水性脂肪族氨基酸：Met、Ile、Leu以及Val

-疏水性芳香族氨基酸：Phe

-亲水性酸性氨基酸：Asp、Glu、Asn以及Gln

-亲水性碱性氨基酸：Arg、Lys以及His

-中度疏水性脂肪族氨基酸：Gly、Ala、Ser、Thr、Cys、Pro

-中度疏水性芳香族氨基酸：Tyr以及Trp。

在这些氨基酸之中，出于突变的目的，Cys和Pro可能是野生型纤溶酶 和纤溶酶原氨基酸的较不有利的置换氨基酸，这是由于Cys产生了可能的游 离硫醇基，或由于Pro引起更广泛的蛋白质结构紊乱。其他氨基酸置换包括 一个纤溶酶(原)催化结构域的所述位置P处的一个野生型氨基酸突变成一 个非天然的或非经典氨基酸、或突变成氨基酸类似物，如正亮氨酸、正缬氨 酸、鸟氨酸或瓜氨酸(对于更广泛的列表，请参见例如亨德里克森等人，2004， Annu Rev Biochem 73，147-176)。

表1.氨基酸特征。

本发明人观察到，在测试条件下，仅有有限数目的自溶性裂解发生在纤 溶酶催化结构域内部。如在实例部分所描述的，本发明鉴定了3个热点的自 溶。然而，这不排除存在易于自溶裂解的其他肽键的可能性。

因此，在以上所述中，在位置P处的所述至少一个内部氨基酸、或在位 置P和P’处的所述至少两个内部氨基酸更特别地是选自以下的至少一项或至 少两项：

(i)在人纤溶酶催化结构域的位置137处的赖氨酸，或一种非人类纤 溶酶的相应的赖氨酸或精氨酸；

(ii)在人纤溶酶催化结构域的位置147处的赖氨酸，或一种非人类纤 溶酶的相应的赖氨酸或精氨酸；或

(iii)在人纤溶酶催化结构域的位置158处的精氨酸，或一种非人类纤 溶酶的相应的赖氨酸或精氨酸；

其中所述人纤溶酶催化结构域以位置1处的氨基酸缬氨酸开始，它是在人 Glu-纤溶酶原的位置562处出现的相同的缬氨酸氨基酸。为了阐明人纤溶酶原 和人纤溶酶催化结构域中的氨基酸编号，参照在此的图1。

在一种非人类纤溶酶(原)序列中鉴定一个“相应于”(即鉴定一个“相 应的”氨基酸)人纤溶酶(原)中的一个氨基酸首先意味着两个氨基酸序列的 比对。这种比对可能要求一些优化，如在一个或两个比对的序列中引入较小 的空位，从而导致最高的一致性和同源性。其次，与人纤溶酶(原)中的氨 基酸比对的非人类纤溶酶(原)中的氨基酸被鉴定并且在此称为“相应的”氨 基酸。在此，图10描绘了公共可得的哺乳动物纤溶酶原蛋白序列的比对，并 且突出显示了在人纤溶酶原序列中的本发明的特别感兴趣的氨基酸(第一 行)连同在非人类纤溶酶原序列中的相应氨基酸(第2-18行)。特别感兴趣 的氨基酸是位置698(催化结构域中的位置137，参见图1)处的Lys、位置 708处(催化结构域中的位置147，参见图1)的Lys以及位置719(催化结 构域中的位置158，参见图1)处的Arg。

根据本发明的所述纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物可以是 这样一种，其中在位置P处所述至少一个内部氨基酸是人纤溶酶催化结构域 的位置147处的赖氨酸、或是一种非人类纤溶酶催化结构域的相应的赖氨酸 或精氨酸。它可以任选地进一步包括在人催化结构域的位置137和/或158处 的内部氨基酸的一个突变或一种非人类纤溶酶催化结构域的相应赖氨酸和/或 精氨酸的一个突变。在此所述的人纤溶酶催化结构域以位置1处的氨基酸缬 氨酸开始，它是在人Glu-纤溶酶原的位置562处出现的相同的缬氨酸氨基 酸。

根据本发明的所述纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物可以可 替代地是这样一种，其中：

(i)如果所述的在位置P处的至少一个内部氨基酸的突变是在人纤溶 酶催化结构域的位置137处(相对于人Glu-纤溶酶原是氨基酸位置698)的赖 氨酸突变成这样的一个氨基酸，该氨基酸使得氨基酸137与138之间的肽键 抵抗或更加抵抗自溶，则所述纤溶酶原变体、纤溶酶变体或纤溶酶衍生物在 氨基酸位置561和562处(相对于人Glu-纤溶酶原)包括一个完整的激活位 点，并且当存在催化结构域之外的在位置536和541处(相对于人Glu-纤溶 酶原)的氨基酸时，所述氨基酸是野生型半胱氨酸，或

(ii)如果所述的在位置P处的至少一个内部氨基酸的突变是在人纤溶 酶催化结构域的位置158处(相对于人Glu-纤溶酶原是氨基酸位置719)的精 氨酸突变成一个丙氨酸或谷氨酸，则在位置P’处在人纤溶酶催化结构域的至 少一个其他内部氨基酸(该内部氨基酸与位置P’+1的内部氨基酸的肽键易于 自溶)突变成这样一个氨基酸，该氨基酸与位置P’+1的内部氨基酸的肽键较 不或不易于自溶。

根据以上的(i)或(ii)所述的变体可以任选地进一步包括在人催化结构 域的位置147处的内部氨基酸的一个突变或一种非人类纤溶酶催化结构域的 相应的赖氨酸或精氨酸的一个突变，其中所述人纤溶酶催化结构域以位置1 处的氨基酸缬氨酸开始，它是在人Glu-纤溶酶原的位置562处出现的相同的 缬氨酸氨基酸。

在任何上述纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物中，人催化结 构域的位置137处的所述赖氨酸、或一种非人类纤溶酶催化结构域的相应的 赖氨酸或精氨酸可以突变成下组的一个氨基酸，该组为：疏水性脂肪族氨基 酸、疏水性芳香族氨基酸、亲水性酸性氨基酸、亲水性碱性氨基酸(除赖氨 酸之外)、中度疏水性芳香族氨基酸、以及中度疏水性脂肪族氨基酸。具体 地，所述赖氨酸可以例如被突变成选自Ala、Glu、Phe、His、Ile、Met、Gln 或Arg的一个氨基酸。

在任何上述纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物中，人催化结 构域的位置147处的所述赖氨酸、或一种非人类纤溶酶催化结构域的相应的 赖氨酸或精氨酸可以突变成下组的一个氨基酸，该组为：疏水性脂肪族氨基 酸、疏水性芳香族氨基酸、亲水性酸性氨基酸、亲水性碱性氨基酸(除赖氨 酸之外)、中度疏水性芳香族氨基酸、以及中度疏水性脂肪族氨基酸。具体 地，所述赖氨酸可以例如被突变成选自Ala、Glu、Gln、His、Ile或Phe的一 个氨基酸。

在任何上述纤溶酶原变体、纤溶酶变体、或纤溶酶衍生物中，人催化结 构域的位置158处的所述精氨酸、或一种非人类纤溶酶催化结构域的相应的 赖氨酸或精氨酸可以突变成下组的一个氨基酸，该组为：疏水性脂肪族氨基 酸、疏水性芳香族氨基酸、亲水性酸性氨基酸、亲水性碱性氨基酸、中度疏 水性芳香族氨基酸、以及中度疏水性脂肪族氨基酸。具体地，所述精氨酸可 以例如被突变成选自Ala、Glu、Gln、Ile、Phe或His的一个氨基酸。

“纤溶酶”，还称为纤维蛋白溶酶或溶纤维蛋白酶(lysofibrin)是一种丝 氨酸类型的蛋白激酶，它来自酶原纤溶酶原的激活。激活是氨基酸561与562 (相对于人Glu-纤溶酶原而编号)之间的蛋白水解性裂解的结果。纤溶酶携 带了包括5个kringle结构域的一个重链以及包括该催化结构域的一个轻链。 纤溶酶原可以从血浆中富集，例如通过赖氨酸亲和层析(多伊奇&默茨，1970， 科学(Science)170，1095-1096)。纤溶酶分子的平截(在纤溶酶催化结构域 外部和/或内部)是可能的，只要该催化结构域保持功能，这样的平截因此导 致形成纤溶酶的一种“蛋白水解活性衍生物”。这样，5个kringle结构域中的 一个或多个可以被完全地或部分地删除。本发明因此设想了缺少一个或多个 kringle结构域的和/或缺少一个或多个kringle结构域的一部分的截短的纤溶酶 作为纤溶酶的蛋白水解活性衍生物的实例。纤溶酶的截短变体的实例包括但 不局限于，“中型纤溶酶”、“小纤溶酶”、“微纤溶酶”、和“δ-纤溶酶”。中型纤 溶酶基本上缺少kringle结构域1至3(例如克里斯滕森等人，1995，Biochem J 305，97-102)。小纤溶酶最初是通过用弹性蛋白酶有限地消化纤溶酶而获得 的并且基本上缺少kringle结构域1至4(例如克里斯滕森等人，1979，Biochim  Biophys Acta 567，472-481；鲍威尔&卡斯泰林诺，1980，J Biol Chem 255， 5329)。随后重组生产小纤溶酶(WO 2002/050290)。微纤溶酶最初是通过 在升高的pH下孵育纤溶酶而获得的并且基本上缺少所有kringle结构域(例 如WO 89/01336)。然而从在升高的pH下孵育纤溶酶而获得的微纤溶酶含有 重链的30-31个羧基端氨基酸，一种重组生产的微纤溶酶变体含有重链的19 个羧基端氨基酸(WO 2002/050290)。δ-纤溶酶是一种重组型式的纤溶酶， 其中kringle结构域1直接与催化结构域相连(WO 2005/105990)。纤溶酶的 上述截短变体是通过分别激活“中型纤溶酶原”、“小纤溶酶原”、“微纤溶酶 原”、和“δ-纤溶酶原”而获得的。为了是可激活的，一种截短的纤溶酶原需要 在kringle 5结构域与催化结构域之间包括一个最小数目的氨基酸接头(参 见，例如Wang等人，1995，蛋白质科学(Protein Science)4，1758-1767)。在 本发明的背景下，所希望的是该纤溶酶原包括一个“完整的激活位点”，这意 味着至少氨基酸561和562(相对于人Glu-纤溶酶原；或非人类纤溶酶原中相 应的氨基酸)是这样的，使得纤溶酶原到纤溶酶的激活/转化可以发生，虽然 可能具有与在野生型纤溶酶中的发生的动力学不同的动力学。作为对于纤溶 酶或它的一种活性的截短变体的替代方案，可以在本发明的背景下使用一种 可激活的纤溶酶原或它的一种截短变体(参见例如EP 0480906；US 5,304,383；EP 0631786；US 5,520,912；US 5,597,800；US 5,776,452)。“纤 溶酶原”是指任何形式的纤溶酶原，例如Glu-纤溶酶原或Lys-纤溶酶原(以位 置68处的Arg或位置77或78处的Lys开始)。当使用可激活的纤溶酶原或 它的一种可激活的截短变体时，激活成纤溶酶可以被延迟并且将典型地在使 它与一种器官、组织或体液接触之后发生，即在给予受试者之后发生。在又 另一个替代方案中，在本发明的背景下，纤溶酶或它的一种活性的截短变体 可以置换一种可激活的纤溶酶原或它的一种可激活的截短变体，其与一种纤 溶酶原激活剂(例如组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶、链激酶或葡萄球 菌激酶、或它们的任何变体；参见例如US 6,733,750；US 6,585,972；US 6,899,877；WO 03/33019)相结合。在又另一个替代方案中，在本发明的背景 下，可以使用任何(i)纤溶酶或它的衍生物，(ii)可激活的纤溶酶原或它的一 种可激活的衍生物，以及任选地(iii)一种纤溶酶原激活剂的混合物(参见例如 US 2004/0081643).。为了确保纤溶酶(或纤溶酶原)的稳定性，通常将它保 存在降低的温度下(例如+4℃或-20℃)。该保存组合物可以是一种稳定化组 合物，如一种低pH组合物(pH 4或更低；例如通过1mM至250mM的一种 酸如柠檬酸而获得，参见例如卡斯泰林诺&索德茲，1976，Methods Enzymol 45， 273-286；WO 01/36608；WO 01/36609；WO 01/36611)或一种高甘油含量组 合物(30-50％v/v，例如卡斯泰林诺&索德茲，1976，Methods Enzymol 45，273- 286)，可替代地在一种或多种另外的包括例如一种氨基酸(例如赖氨酸或它 的一种类似物如EACA或氨甲环酸)、一种糖(例如甘露醇)或本领域已知 的任何稳定剂(例如二肽，WO 97/01631)的稳定剂组合物中或与之结合。在 “纤溶酶”种属中还进一步包括它的任何活性衍生物(或一种活性的截短纤溶 酶变体)、或可激活的纤溶酶原的类似衍生物(或它的可激活的截短变 体)。此类衍生物包括例如标记的纤溶酶或纤溶酶原(或它的截短变体)如 Tc⁹⁹-标记的纤溶酶(迪肯等人，1980，Br J Radiol 53，673-677)或聚乙二醇化或 酰化的纤溶酶或纤溶酶原(或它的截短变体；EP 9879、WO 93/15189)。任 何其他的标记(放射性标记、荧光标记等)也可以用来产生一种纤溶酶或纤 溶酶原衍生物。所述衍生物进一步包括杂交或嵌合纤溶酶或纤溶酶原分子， 包括例如与例如一种纤维蛋白结合分子(如tPA的kringle 2、一个载脂蛋白 kringle、tPA或纤连蛋白的指状结构域或一种纤维蛋白结合抗体的Fab结构 域)融合的根据本发明的一种截短的纤溶酶或纤溶酶原。

野生型纤溶酶与根据本发明的纤溶酶变体或纤溶酶衍生物的自溶抗性 (即稳定性)的比较能以与用于比较蛋白水解活性相似的方式进行，例如以 基于例如纤维蛋白、纤维蛋白原或纤连蛋白的显色活性测定或生物底物测定 的方式。

为了确定自溶抗性，可以确定自溶速率常数。所设想的是根据本发明的 纤溶酶变体包括从根据本发明的纤溶酶原变体获得的纤溶酶、或根据本发明 的任何纤溶酶衍生物可以通过比野生型纤溶酶的自溶速率常数低至少5％、或 至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、 75％、80％、90％、95％、99％或99.5％的自溶速率常数来表征，或可替代地 通过野生型纤溶酶的自溶速率常数的至多0.5％、1％、5％、10％、15％、 20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、或 90％的自溶速率常数来表征。为了确定所指示的百分比，可以基于绝对自溶 速率常数进行计算。例如，野生型微纤溶酶具有的自溶速率常数为230M^-1s^-1，而微纤溶酶变体K137M具有的自溶速率常数为1M^-1s^-1(参见实例3/表 3)。K137M变体的自溶速率常数因此是野生型微纤溶酶的自溶速率常数的 0.43％。

另外，根据本发明的任何纤溶酶变体(包括从根据本发明的纤溶酶原变 体获得的纤溶酶)、或根据本发明的任何所述纤溶酶的衍生物可以保留与野 生型纤溶酶的蛋白水解活性不同的蛋白水解活性(更高或更低)，如用例如 基于例如纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、明胶、层粘连蛋白或胶原的显 色活性测定或生物底物测定所确定的。

根据本发明的纤溶酶变体(包括从根据本发明的纤溶酶原变体获得的纤 溶酶)、或根据本发明的任何纤溶酶衍生物的蛋白水解活性可以通过催化常 数k_cat来与野生型纤溶酶的蛋白水解活性进行比较，该催化常数k_cat是每单位 时间、每个酶位点、底物分子转化为产物的数目的量度。因此，根据本发明 的任何纤溶酶变体(包括从根据本发明的纤溶酶原变体获得的纤溶酶)、或 根据本发明的任何纤溶酶衍生物可以通过一个k_cat值来表征，该k_cat值是在野 生型纤溶酶的k_cat值的+100％至-90％、或+50％至-50％的范围内，即通过一个 在野生型纤溶酶的k_cat值的10％至200％、或50％至150％的范围内的k_cat值来 表征。为了确定所指示的百分比，该计算是在绝对k_cat数上进行的。例如，野 生型微纤溶酶具有的k_cat为46s^-1，而微纤溶酶变体K137M具有的k_cat为36s^-1(参见实例4/表3)。K137M变体的k_cat因此是野生型微纤溶酶的k_cat的 78.3％。

比较根据本发明的纤溶酶变体(包括从根据本发明的纤溶酶原变体获得 的纤溶酶)、或根据本发明的任何纤溶酶衍生物的蛋白水解活性与野生型纤 溶酶的蛋白水解活性的另一种方式包括比较k_cat/K_m(表3)。与野生型纤溶酶 的k_cat/K_m相比，一种根据本发明的纤溶酶变体(包括从根据本发明的纤溶酶 原变体获得的纤溶酶)、或根据本发明的任何纤溶酶衍生物的高达1000倍或 高达500倍更低的k_cat/K_m仍然是可接受的(参见进一步)。

另外，根据本发明的任何纤溶酶变体(包括从根据本发明的纤溶酶原变 体获得的纤溶酶)、或根据本发明的任何纤溶酶衍生物可以通过以上定义的 自溶速率常数与催化常数k_cat的结合来表征。

可替代地，通过结合自溶速率常数数据与k_cat/K_m数据，可以将根据本 发明的任何纤溶酶变体(包括从根据本发明的纤溶酶原变体获得的纤溶 酶)、或根据本发明的任何纤溶酶衍生物与野生型纤溶酶比较。例如，具有 与野生型纤溶酶相比低20倍的自溶速率常数并且具有与野生型纤溶酶相比低 10倍的k_cat/K_m的一种纤溶酶变体将好于野生型纤溶酶2倍。显而易见地取决 于最终用途，一种具有低蛋白水解活性的非常稳定的纤溶酶(即没有或几乎 没有自溶性降解)将是高度所希望的，例如在其中低而延长的纤溶酶活性是 所希望或甚至是所要求的以达到预期的临床效果的情况下。这种具有低蛋白 水解活性的高度稳定的纤溶酶变体以此状态几乎比得上缓释配制品，而无需 实际使用一种缓释载体或助剂。

对于用于比较的又一个替代方案，通过将自溶速率常数数据与k_cat数据 进行组合，可以将根据本发明的任何纤溶酶变体(包括从根据本发明的纤溶 酶原变体获得的纤溶酶)、或根据本发明的任何纤溶酶衍生物与野生型纤溶 酶比较。

显而易见地，对于任何如以上所述的比较测量，所希望的是将纤溶酶变 体与它们最接近的野生型纤溶酶进行比较，例如将一种微纤溶酶变体与野生 型微纤溶酶进行比较、或将一种小纤溶酶变体与野生型小纤溶酶进行比较。 此外显而易见的是，对于任何活性测量，根据本发明的一种纤溶酶变体的一 种可逆灭活的衍生物应该首先通过去除可逆灭活原因(例如酰化或非最佳的 pH)而激活。

任何根据本发明的纤溶酶原变体或从其获得的纤溶酶、根据本发明的纤 溶酶变体可以是Glu-纤溶酶的Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原或Lys-纤溶酶、 中型纤溶酶原或中型纤溶酶、小纤溶酶原或小纤溶酶、微纤溶酶原或微纤溶 酶、δ纤溶酶原或δ纤溶酶。

存在许多种测定法来确定一种纤溶酶种类是否是蛋白水解活性的。简单 的并且直截了当的测定是基于一种显色底物被样品中存在的纤溶酶的消化； 显色底物包括S-2403(Glu-Phe-Lys-pNA)以及S-2251(Val-Leu-Lys- pNA)，它们经蛋白水解性裂解后释放对硝基苯胺(pNA)。所形成的pNA 的量可以通过在405nm处的光吸收来测量。用于确定纤溶酶活性的一种可替 代的测定是一种电位测定法。比色(使用一种显色底物)和电位测定法描述 于例如卡斯泰林诺&索德茲(1976，Methods Enzymol 45，273-286)中。用于测 定纤溶酶活性的另一种可替代的测定法是一种酪蛋白水解测定(例如Robbins  & Summaria，1970，Methods Enzymol 19，184-199；Ruyssen & Lauwers，1978， Chapter IX-Plasmin，在“Pharmaceutical Enzymes”，Story-Scientia，Gent，Belgium， pp.123-131)。用于确定纤溶酶活性的又另一种可替代的测定法是一种纤维 蛋白溶解测定(例如阿斯特鲁普&Mullertz，1952，Arch Biochem Biophys 40， 346-351)。使用其他蛋白质底物可以容易地设计另外的活性测定法。清楚 地，这些测定法还可以用来追踪纤溶酶的蛋白水解活性随着时间的过去而消 失(由于该酶的自溶性降解)。作为用于评定本发明的一种纤溶酶变体或它 的任何有活性的截短变体或衍生物的稳定性的一个替代方案，所述纤溶酶变 体可以在野生型纤溶酶的存在下进行孵育并且可以监测该纤溶酶变体对于被 野生型纤溶酶消化的抗性。

纤溶酶在从损伤、创伤、溃疡性创伤(如溃疡性缝合伤口)等中去除坏 死成分或碎片中的用途描述于例如US 3,208,908中。类似地，例如US 4,122,158中披露了包括纤溶酶的治疗制剂用于治疗烧伤的局部应用。清创术 是指去除死亡的、损害的和/或感染的组织，以便改进或增强剩余健康组织的 愈合。这种去除可以通过外科、机械或化学方法、或通过某些种类的选择性 吃掉坏死组织的活蛆虫的方法(蛆虫疗法)来获得。清创术还可以使用酶来 进行或可以通过酶来辅助，这是一种称为酶清创术的方法。清创术在烧伤和 其他严重创伤的愈合过程中是一个重要的方面并且它还用在一些类型的蛇咬 伤的治疗中。在酶清创术(单独地或与其他类型的清创术组合)中应用纤溶 酶(或它的任何变体或衍生物或因此如上述的替代物)在促进或协助创伤愈 合方面是特别有用的并且用作手术操作如植皮术中的一种添加物。

纤溶酶(或它的任何变体或衍生物或因此如上述的替代物)的更通常已 知的用途概括地涉及治疗纤维蛋白的一种或多种病理性沉积。纤维蛋白沉积 可以起因于体内的广泛种类的病理状况。例如，含有纤维蛋白的血块可以在 组织中的血管中形成，导致了深静脉、冠状动脉、大脑动脉或视网膜静脉闭 塞或血栓形成。纤维蛋白的少量积累先于即将发生的灾难性血栓形成并且可 能提供对于它的警告。实例包括不稳定心绞痛，它被认为是即将发生的冠状 动脉血栓形成以及短暂性脑缺血发作(可能先于中风)的一种警告。此外， 纤维蛋白时常沉积在与炎症相关的组织中，与多种疾病过程相关，包括感 染、自身免疫性疾病以及癌症。其中纤维蛋白沉积的另一种情况是由微生物 感染引起的脓肿的周围。此外，纤维蛋白沉积时常发现与某些实体瘤相关。 纤维蛋白沉积还可以发生在任何类型的创伤的愈合过程中。纤维蛋白沉积的 又另一种情况是纤维蛋白在视网膜静脉中的积累，这可能导致视网膜变性、 视力障碍或甚至目盲。术语病理性纤维蛋白沉积进一步包括如形成在或存在 于导管、导管装置或其他植入物如人工血管以及合成的、人或动物来源的移 植物的尖端中或尖端处的这种沉积，这些植入物被一种包含纤维蛋白的阻塞 有效地封闭。术语“导管装置”是指可以进入体内的任何导管或管状装置，包 括动脉导管、心导管、中心静脉导管、静脉内导管、外周置入中心静脉导 管、肺动脉导管、隧道式中心静脉导管以及动静脉分流。

在促进血栓形成过程(即形成一个血栓或止血栓子)的不同因素中的 是：(1)对受累血管的内皮细胞内层的损伤，(2)血液的凝固特性的增加，以 及(3)在受累血管中的血液的淤塞。血栓形成可以开始为附着到血管内层的损 伤部分上的一个非常小的团块。它的存在促进了进一步的血栓形成发生，并 且具有引起血流减速(通过降低血管的内径)的作用。初始小血栓的进一步 生长通常导致受累血管的全部的或几乎全部阻塞。如果血栓发生在一个动脉 中，由该动脉供血的组织可能被剥夺氧和营养物，引起该组织的损害或死亡 (坏疽)。损伤的严重性取决于血栓形成的位置和大小、它的生长速度以及 受累区域是否只具有一个动脉或被侧支血管供血。如果到一个生命器官例如 心脏或大脑的血管受累，这个人可能严重残疾或死亡。有时，一个血栓可能 含有感染性生物如细菌，并且可能发生脓毒性血栓形成，其中脓汁形成并且 周围组织感染。

纤溶酶(或它的任何变体或衍生物或因此如上述的替代物)的另外的用 途包括降低循环纤维蛋白原的水平(例如WO 93/07893)以及它作为一种α2- 抗纤溶酶抑制剂的用途(报道其降低了缺血性发作之后的脑梗塞的大小；WO 00/18436)。

纤溶酶(或它的任何变体或衍生物或因此如上述的替代物)的又另一种 用途涉及在眼中诱导玻璃体后部脱离(PVD)和/或玻璃体液化作为玻璃体机 械切除术中的添加物的替代物或作为添加物(WO 2004/052228；US 6,733,750；US 6,585,972；US 6,899,877；WO 03/33019；WO 2006/122249； WO 2007/047874；US 5,304,118；US 2006/0024349；US 2003/0147877)。玻 璃体切割术和/或玻璃体液化对于多种眼症有益，这些眼症如玻璃体飘浮物 (活动碎片/通常透明的玻璃体液内的玻璃体沉积物，它可以损伤视觉)、视 网膜脱离(一种致盲病症，可能由玻璃体牵引(vitreal traction)引起)、黄 斑皱褶(黄斑上的瘢痕组织；黄斑对于敏锐的中央视觉是需要的；黄斑皱褶 还称为视网膜外膜黄斑病或视网膜前膜黄斑病、透明纸样黄斑病、视网膜起 皱、表面皱纹视网膜病、黄斑前纤维膜、或内界膜病)、可能导致玻璃体出 血的糖尿病视网膜病(增生性或非增生性)和/或视网膜上纤维性疤痕组织的 形成(可能引起视网膜脱离)、黄斑裂孔(引起盲点的并且由玻璃体牵引、 损伤或外伤事件引起的黄斑中的孔)、玻璃体出血(由糖尿病视网膜病、损 伤、视网膜脱离或视网膜撕裂、蛛网膜下出血(太尔松综合征)、或血管阻 塞引起)、玻璃体下出血(在玻璃体周围的玻璃体膜下的出血)、黄斑水肿 (流体和蛋白质在眼的黄斑上和黄斑下的沉积)以及黄斑变性(以脉网膜小 疣的形成开始；以干和湿的形式发生；如果与年龄相关，产生年龄相关性黄 斑变性)。纤溶酶的其他眼部应用包括小梁切除术手术(被进行以降低眼内 压)之后的结膜滤过性水泡的保养或挽救，参见例如WO 2009/073457。

纤溶酶(或它的任何变体或衍生物或因此如上述的替代物)的另一个用 途在于诊断，更具体地适当标记的(例如Tc⁹⁹标记的，参见以上)纤溶酶 (或它的任何变体或衍生物或因此如上述的替代物)可以用于检测病理性纤 维蛋白沉积。当在这种诊断中应用根据本发明的一种截短纤溶酶或纤溶酶原 变体时，应该注意所述变体仍然包括一个纤维蛋白结合位点(不论来自纤溶 酶本身还是通过产生一个杂交分子而添加至例如纤溶酶催化结构域上)。

根据本发明的纤溶酶或它的任何变体或衍生物或因此的替代物可以保存 在一种药学上可接受的载体、稀释剂、或助剂中。这种载体、稀释剂或助剂 可以组成为或包括一种酸性低缓冲液如1-100mM乙酸盐或柠檬酸盐。当酸性 时，这种药学上可接受的载体、稀释剂或助剂可以具有2.5到4.0的pH，如 处于3.0至3.5的pH，或如3.1的pH。有用的酸性化合物包括乙酸、柠檬 酸、盐酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或苯甲酸。可以使用甲酸但是应当注意这 种化合物不诱导Asp残基的C端处的蛋白水解性裂解。这种药学上可接受的 载体、稀释剂或助剂(酸性的或中性的)可以包括一种或多种氨基酸如丝氨 酸、苏氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、 天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸或它们的任何衍生物或类似物。这种药学上可接 受的载体、稀释剂或助剂可以包括一种碳水化合物如一种单糖、二糖、多糖 或多元醇。实例包括糖类如蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖以 及甘露糖，糖醇如山梨醇和甘露醇以及多糖如糊精、葡聚糖、糖原、淀粉以 及纤维素。这种药学上可接受的载体、稀释剂或助剂可以包括化合物如甘 油、烟酰胺、葡糖胺、硫胺素、瓜氨酸、无机盐(如氯化钠、氯化钾、氯化 镁、氯化钙)、苯甲醇或苯甲酸。这种药学上可接受的载体、稀释剂或助剂 可以包括化合物如ε-氨基己酸(EACA)和/或氨甲环酸(也参见以上&背景部 分)。这些化合物中的一些可以用作纤溶酶或它的任何变体或衍生物或因此 如上述的替代物的稳定剂。

鉴于以上，本发明的另一个方面涉及根据本发明的分离的纤溶酶原、纤 溶酶、或它的任何变体或衍生物或因此的替代物、或任何它们的组合用作一 种药物。

本发明的另一个方面涉及包括根据本发明的分离的纤溶酶原、纤溶酶、 或它们的任何变体或衍生物或因此的替代物、或它们的任何组合以及至少一 种药学上可接受的稀释剂、载体或助剂的组合物。在一个进一步的实施方案 中，所述组合物可以另外包括至少一种抗凝剂、一种另外的血栓溶解剂、一 种抗炎剂、一种抗病毒剂、一种抗细菌剂、一种抗真菌剂、一种抗血管生成 剂、一种抗有丝分裂剂、一种抗组织胺剂或一种麻醉剂。

在本发明的上述两个方面的一个实施方案中，根据本发明的分离的纤溶 酶原、纤溶酶、或它们的任何变体或衍生物或因此的替代物、或它们的任何 组合、或根据本发明的组合物可以用在任何临床相关的环境中，如用于治疗 一种病理性纤维蛋白沉积、用于在眼中诱导玻璃体后部脱离、用于在眼中诱 导玻璃体液化，作为眼中玻璃体切割术的添加物或协助玻璃体切割术、用于 诱导玻璃体后部脱离、用于解决玻璃体黄斑粘连、用于闭合黄斑裂孔、用于 酶清创术、用于降低循环纤维蛋白原、用于降低α2-抗纤溶酶水平、或与小梁 切除术相结合。

在本发明的上述两个方面的另一个实施方案中，根据本发明的分离的纤 溶酶原、纤溶酶、或它们的任何变体或衍生物或因此的替代物、或它们的任 何组合、或根据本发明的组合物可以用于预防的目的或用在用于预防性治疗 的方法中。预防性用途包括在具有增加的发生病理性纤维蛋白沉积的风险的 哺乳动物(例如肥胖的哺乳动物、没有足够的身体锻炼的哺乳动物或预定经 历一个大的外科事件或手术的哺乳动物)体内降低发生病理性纤维蛋白沉积 的风险。其他预防性用途包括在哺乳动物的外观健康的眼中诱导玻璃体后部 脱离和/或玻璃体液化，该哺乳动物的配对眼被诊断/已经被诊断为需要诱导玻 璃体后部脱离和/或玻璃体液化。

可替代地，本发明涉及用于在一位受试者体内治疗、溶解、松解、浸 渍、溶化、诱导或促进一种病理性纤溶蛋白沉积的溶解的方法，所述方法包 括使所述纤溶蛋白沉积与一个有效量的根据本发明的分离的纤溶酶原、纤溶 酶、或它们的任何变体或衍生物或因此的替代物、或它们的任何组合进行接 触，所述接触导致了所述病理性纤溶蛋白沉积的溶解的治疗、溶解、松解、 浸渍、溶化、或诱导或促进。

本发明进一步涉及用于在眼中诱导玻璃体后部脱离和/或在眼中诱导玻 璃体液化、或用于协助在受试者的眼中的外科玻璃体切割术的方法，所述方 法包括使对这种治疗有需要的所述受试者的眼与一个有效量的根据本发明的 分离的纤溶酶原、纤溶酶、或它们的任何变体或衍生物或因此的替代物或它 们的任何组合进行接触，所述接触导致了所述玻璃体后部脱离的诱导和/或所 述玻璃体液化、或协助了所述外科玻璃体切除术。

本发明还涉及用于受试者的损伤的组织的酶清创术的方法，所述方法包 括使所述受损伤的组织与一个有效量的根据本发明的分离的纤溶酶原、纤溶 酶、或它们的任何变体或衍生物或因此的替代物、或它们的任何组合进行接 触，所述接触导致了所述受损伤的组织的所述酶清创术。

本发明的其他方法是治疗或预防任何其他临床上有关的适应症，包括用 于降低循环纤维蛋白原、或用于降低受试者体内的α2-抗纤溶酶水平的方法， 所述方法包括使对这种治疗有需要的所述受试者与一个有效量的根据本发明 的分离的纤溶酶原、纤溶酶、或它们的任何变体或衍生物或因此的替代物或 它们的任何组合进行接触，所述接触导致了循环纤维蛋白原或所述α2-抗纤溶 酶水平的所述降低。

总体上，包括根据本发明的一种纤溶酶(或它的任何变体或衍生物或因 此的替代物)的本发明的药物或组合物可以(取决于它的最终用途和施药方 式)包括一种或多种另外的活性成分，如一种抗凝剂、另一种血栓溶解剂、 一种抗炎剂、一种抗病毒剂、一种抗细菌剂、一种抗真菌剂、一种抗血管生 成剂、一种抗有丝分裂剂、一种抗组织胺剂或一种麻醉剂。

“抗凝剂”包括水蛭素、肝素、香豆素、低分子量肝素、凝血酶抑制剂、 血小板抑制剂、血小板聚集抑制因子、凝固因子抑制剂、抗纤维蛋白抗体以 及因子VIII抑制剂(例如WO 01/04269和WO 2005/016455中描述的那 些)。

“血栓溶解剂”包括野生型纤溶酶、野生型纤溶酶原、尿激酶、链激酶、 组织型纤溶酶原激活剂(tPA或阿替普酶)、尿激酶型纤溶酶原激活剂 (uPA)以及葡萄球菌激酶或任何它们的任何变体或衍生物如APSAC(茴香 酰化纤溶酶原链激酶激活剂复合物)、瑞替普酶、替奈普酶、scuPA(单链 uPA)、或任何它们的组合。

“抗炎剂”包括类固醇(例如泼尼松龙、甲泼尼龙、可的松、氢化可的 松、泼尼松、曲安西龙、地塞米松)以及非类固醇类抗炎剂(NSAID；例如 扑热息痛、布洛芬、阿司匹林)。

“抗病毒剂”包括曲氟尿苷、阿糖腺苷、阿昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦 以及碘昔(doxuridine)。

“抗细菌剂”或抗生素包括氨苄西林、青霉素、四环素、土霉素、新霉素 b、加替沙星、庆大霉素、妥布霉素、杆菌肽、新霉素、以及多粘菌素。

“抗霉菌/抑制真菌剂/抗真菌剂”包括氟康唑、两性霉素、克霉唑、益康 唑、伊曲康唑、咪康唑、5-氟胞嘧啶、酮康唑、以及那他霉素。

“抗血管生成剂”包括抗体(或其片段)如抗VEGF(血管内皮生长因 子)或抗PlGF(胎盘生长因子)抗体以及药剂如Macugen(哌加他尼钠)、 色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)、醋酸阿奈可他、考布他汀A4前药、 AdPEDF(能够表达色素上皮衍生因子的腺病毒载体)、VEGF-Trap、VEGF 受体-2抑制剂、VEGF、PlGF或TGF-β的抑制剂、西罗莫司(雷帕霉素)以 及内皮抑素。

“抗有丝分裂剂”包括丝裂霉素C以及5-氟脲嘧啶(5-fluorouracyl)。

“抗组织胺剂”包括富马酸酮替芬(ketitofen fumarate)和马来酸非尼拉 敏。

“麻醉剂”包括苯佐卡因、氨苯丁酯、地布卡因、利多卡因、奥布卡因、 丙吗卡因、丙对卡因、丙美卡因、地卡因以及丁卡因。

“接触”，当在此使用时，是指导致一种组合物如一种药物与所述组合物 与之接触的组织、体液、器官、有机体等之间的相互作用的任何方式的给 药。该组合物与该组织、体液、器官、有机体等之间的相互作用可以在给予 该组合物之后立即或几乎立即开始发生、可以在延长的时间期限发生(在给 予该组合物之后立即或几乎立即开始发生)、或可以相对于给予该组合物的 时间延迟。

可以使用接触病理性纤维蛋白沉积物的任何方法，该方法将一个有效量 的一种纤溶酶(或它的任何变体或衍生物或因此的替代物)提供(立即地、 延迟地亦或经过延长的时间期间)到这种纤维蛋白沉积物上。如果这种纤维 蛋白沉积物与一个血块相关，该纤溶酶(或它的任何变体或衍生物或因此的 替代物)可以通过注射和/或输注和/或一个导管的方式经动脉内递送、静脉内 递送、或局部递送(在血块的短距离内甚至在血块中)。

当在酶清创术中使用纤溶酶(或它的任何变体或衍生物或因此的替代 物)时，它可以被包括在一种能够局部施用的凝胶状的组合物中、或能以液 体形式施用。

可以使用接触眼玻璃体和/或房水的的任何方法，该方法将一个有效量 的一种纤溶酶(或它的任何变体或衍生物或因此的替代物)提供(立即地、 延迟地亦或经过延长的时间期间)到玻璃体和/或房水。接触玻璃体和/或房水 的一种方法是通过直接到玻璃体和/或房水的一种或多种眼内注射。可替代 地，所述接触可以涉及结膜下、肌肉内或静脉注射。另一种可替代的接触方 法涉及放置一个玻璃体内可植入的装置，如(阿尔扎公司，帕洛 阿尔托，加利福尼亚)或(博士伦公司，罗切斯特市，纽 约)。可以使用一种储库型持续释放配制品或任何对其适合的可植入装置以 一种连续的方式使玻璃体和/或房水与一个有效量的一种纤溶酶(或它的任何 变体或衍生物或因此的替代物)相接触。

术语“有效量”是指根据本发明的药物、特别是根据本发明的药物的活性 成分，即纤溶酶或它的活性截短变体(或因此如上述的任何替代物)的给药 方案。这个有效量通常取决于并且需要调整为接触或给予的模式以及有待治 疗的病症。药物、更特别是它的活性成分的有效量是用于获得所希望的临床 效果或治疗或预防作用而不引起显著或不必要的毒性作用的所需要的量。为 了获得或维持这个有效量，该药物可以作为一个单剂量或以多剂量而给予。 这个有效量可以进一步变化，取决于有待治疗的病症的严重性或预期的需要 预防的病症的严重性；这可以取决于患者的总体健康和身体状况并且通常需 要治疗医生或医师的评定来确定多少有效量。该有效量可以进一步通过不同 类型的给药的组合而获得。该药物可以作为一种溶液(液体或半液体例如凝 胶状的或在分散体或悬浮液中，胶状的，在乳液中，纳米颗粒悬浮液)或作 为一种固体(例如片剂、小片、硬壳或软壳胶囊)来给予。

为了血栓溶解，纤溶酶疗法的纤溶酶剂量和持续时间典型地取决于血凝 块的大小和位置以及患者的尺寸、体重和年龄。如果一个凝块是静脉的，用 纤溶酶治疗可以持续数天，而如果凝块是动脉的，仅仅要求几小时的纤溶酶 治疗。一种心肌梗死可以用短期的单剂量治疗来治疗，而如血栓性静脉炎和 肺栓塞等病症可能要求更长的多剂量治疗。可以应用延长的持续的和/或间断 的溶解血栓的纤溶酶疗法来治疗一种心肌梗死，或在预防性治疗的情况下是 为了降低受试者(已知具有增加的产生血块形成的风险)体内的血块形成的 风险。影响纤溶酶剂量的另一个因素包括纤溶酶抑制剂如α2-抗纤溶酶和/或 α2-巨球蛋白的循环水平，其初始水平是患者依赖性的。可能可取的是调节纤 溶酶剂量从而保持不大于15％的总循环α2-抗纤溶酶，以便实现有效的血栓溶 解疗法。为了诱导血栓溶解，在接近血栓的短距离处递送一种纤溶酶或它的 任何变体或衍生物或因此的替代物的一种接触方法可以是有利的，因为降低 了暴露于血清抑制剂。这种接触方法典型地涉及经由一个导管装置递送。对 于用在血栓溶解中，典型的纤溶酶剂量范围是从500微克/体重至10毫克/kg 体重，作为一个快速灌注剂或分成1次初始推注随后是1次或多次重复推注 来给予的。可替代地，纤溶酶可以在一个延长的时间段给予，例如通过输注 或通过药物递送微型泵。用于持续给予的纤溶酶剂量范围可以是从1mg/kg/ 小时至10mg/kg/小时。

典型的用于诱导玻璃体后部脱离、玻璃体液化、玻璃体血液或出血的清 除、或来自玻璃体腔的毒性物质或外来物质的清除的纤溶酶剂量可以是在大 约0.1微克到大约250微克每眼每剂量的范围内，它可以在每眼每剂量大约 50微升到大约300微升体积的一种稀释剂或载体中进行递送。该稀释剂或载 体可以例如是一种无菌平衡盐溶液(BSS或BSS Plus)、一种生理盐水溶液 或一种含有1mM-10mM柠檬酸的溶液。在一个实施方案中，纤溶酶是以包 含在0.1mL稀释剂或载体中的125微克的剂量被递送到眼中的。在玻璃体切 除术的情况下，所述纤溶酶可以在玻璃体切除术之前15分钟至300分钟、或 15至120分钟被递送到眼中。当使用纤溶酶原作为纤溶酶的替代物(参见“纤 溶酶”定义)的情况下，可以引入高达每眼250微克的纤溶酶原并且所述纤溶 酶原可以伴随给予高达2000IU的尿激酶或链激酶作为纤溶酶原激活剂或伴随 给予高达25微克的tPA。当用在眼中时，纤溶酶或纤溶酶原给予可以进一步 伴随给予一种气体助剂如空气、一种膨胀气体或可液化的气体、或它们的混 合物，只要它对于眼是无毒的。其他适合的气体材料包括SF6(六氟化硫) 和全氟化碳，如C2F6(六氟乙烷)、C3Fs(八氟丙烷)、C4Fs(八氟环丁 烷)、氧、氮、二氧化碳、氩、以及其他惰性气体。被引入到眼中的气体材 料的体积可以取决于气体材料、患者、以及所希望的效果而改变。例如，被 注射到眼后房的空气的体积的范围可以从大约0.5mL到大约0.9mL。其他气 体材料如SF6和全氟化碳气体的范围可以从大约0.3mL到0.5mL。优选地， 气体材料是以足以将玻璃体压到玻璃样后部上并且在玻璃体中形成一个腔而 不损伤眼的量而引入到眼后房的。在优选的实施方案中，将气体助剂引入到 玻璃体中以形成一个腔，该腔填充了眼内腔的大约40％到大约60％的内部体 积。

以上列举的剂量是指示性的值，不旨在以任何方式进行限制。所述剂量 进一步涉及野生型纤溶酶或纤溶酶原或其活性的或可激活的截短变体。当使 用一种根据本发明的具有增加的稳定性的纤溶酶(或它的任何变体或衍生物 或因此的替代物)，并且取决于一种根据本发明的纤溶酶的最终稳定性和剩 余活性时，剂量可以是类似的、更高的或更低的，以获得相比于野生型纤溶 酶所获得的相同的或更好的总体临床效果。根据本发明的纤溶酶的剂量还可 以取决于内源性抑制剂如α2-抗纤溶酶的抑制率。

与在此所披露的研究工作一致，本发明进一步涉及用于筛选一种自溶稳 定性纤溶酶变体的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)在野生型纤溶酶的催化结构域内鉴定位置P处的至少一个内部氨 基酸，该内部氨基酸与位置P+1处的内部氨基酸的肽键易于自溶，

(ii)将在(i)中鉴定的位置P处的氨基酸突变成这样一个氨基酸，该 氨基酸与位置P+1的内部氨基酸的肽键较不或不易于自溶，

(iii)确定从(ii)获得的突变体的自溶稳定性，并且

(iv)从(iii)中选择一种自溶稳定性突变体作为自溶稳定性变体。

本发明同样涉及用于筛选一种自溶稳定性纤溶酶变体的方法，所述方法 包括：

(i)将人纤溶酶催化结构域的位置137、147和158处的一个或多个 精氨酸或赖氨酸氨基酸、或一种非人类纤溶酶的相应精氨酸或赖氨酸突变成 不同于天然氨基酸的一个氨基酸，

(ii)确定从(i)获得的突变体的自溶稳定性，并且

(iii)从(ii)中选择一种自溶稳定性突变体作为自溶稳定性纤溶酶变 体；

其中所述人纤溶酶催化结构域以位置1处的氨基酸缬氨酸开始，它是在人 Glu-纤溶酶原的位置562处出现的相同的缬氨酸氨基酸。

上述筛选方法可以进一步包括一个其中确定该自溶稳定性纤溶酶变体的 蛋白水解活性的步骤。

包括药物(在此应特别地理解为用户现成的活性成分，即在用于给予患 者的最终配制品中)以及大量保存的药物活性成分的多种产品在使用之前通 常保存相当大量的时间。有兴趣的是尽可能延长产品的保存期。其中保存期 是指在产品可以安全使用的期间并且在该时期内产品保留它的有效效用，即 在一种药物和/或它的活性成分的情况下它的活性。典型地，保存期指示在一 种产品或其包装上。一旦保存期期满，一种产品的安全和有效效用不再被保 证。保存一种产品的另一个重要方面是保存温度，在这个保存温度，可以实 现所希望的保存期。例如，在+4℃或平均冷藏温度保存的一种产品的保存期 可以达到12个月，而在-20℃或平均冷冻温度保存的相同产品的保存期可以 达到36个月。然而逻辑上，维持在冷冻温度如-20℃的冷链，比维持在+4℃ 的冷链是更加复杂的、困难的并且昂贵的。因此，可能仍然有吸引力的是具 有更短的但是充分长的保存期与在+4℃下保存一种产品的可能性的组合。本 发明提供了用于延长、增强或增加纤溶酶或它的任何活性片段或衍生物或包 括纤溶酶或它的任何活性衍生物的一种组合物的保存期或长期保存稳定性的 解决方案。这个解决方案在于使在此所述的纤溶酶变体可供使用，所述变体 具有增强的稳定性，它固有地增加或增强或延长了它们的保存期。

本发明同样涉及用于增强一种包括纤溶酶的组合物的长期保存稳定性的 方法，所述方法包括鉴定一种能够长期保存而没有显著损失蛋白水解活性的 自溶稳定性纤溶酶变体的步骤。为了确定长期稳定性，根据本发明的一种纤 溶酶制品被等分并且在所设想的保存期间重复进行活性测量。如果所设想的 保存期是例如24个月，可以例如每月进行活性测量。在所设想的保存期结束 时的可允许的蛋白水解活性的损失将很大程度上取决于所设想的临床应用， 但是典型地可以是不超过例如10％至15％。

此外，本发明涉及用于产生一种根据本发明的纤溶酶原变体，即用于产 生这样一种纤溶酶原的方法，在它的催化结构域内包括位置P处至少一个内 部氨基酸(该内部氨基酸与位置P+1的内部氨基酸的肽键易于自溶)突变成 这样一个氨基酸，该氨基酸与位置P+1的内部氨基酸的肽键较不或不易于自 溶。这些方法包括以下步骤：

(i)将在一种适合的宿主细胞中编码一种根据本发明的纤溶酶原变体 的核酸导入适合的能够表达所述纤溶酶原的宿主细胞中；

(ii)使在(i)中获得的宿主细胞在足以使所述纤溶酶原在所述宿主细 胞中表达的条件和时间下生长；并且

(iii)收获在(ii)中表达的纤溶酶原。

最后，可以向此类方法中加入一个步骤(iv)，该步骤包括将(iii)中收获的纤溶 酶原进行纯化。

适合的宿主细胞以及用于表达并生产的方法例如披露于WO 90/13640 (昆虫细胞)、WO 2002/050290以及WO 03/066842(酵母细胞)、WO 2008/054592(细菌细胞/再折叠过程)以及WO 2005/078109(浮萍转基因植 物或转基因植物细胞)。

本发明进一步包括用于产生一种根据本发明的纤溶酶变体即用于产生这 样一种纤溶酶的方法，在它的催化结构域内包括位置P处至少一个内部氨基 酸(该内部氨基酸与位置P+1的内部氨基酸的肽键易于自溶)突变成这样一 个氨基酸，该氨基酸与位置P+1的内部氨基酸的肽键较不或不易于自溶。此 类方法通常包括产生根据本发明的如上所述的一种纤溶酶原的步骤并且进一 步包括使用一种适合的纤溶酶原激活剂(如tPA、uPA、尿激酶、链激酶或葡 萄球菌激酶、或它们的任何变体)将根据本发明的一种纤溶酶原激活成根据 本发明的一种纤溶酶的步骤。最后，可以加入一个或多个步骤，其中将纤溶 酶原在激活之前进行纯化、将激活的纤溶酶进行纯化和/或将活性纤溶酶如以 上所述进行衍生和/或可逆灭活和/或任选地带到合适的保存条件(如稳定溶 液、冻干和/或低温)下。

本发明进一步涉及编码根据本发明的一种纤溶酶原变体或纤溶酶变体的 一种或多种分离的核酸序列。本发明还涉及包括这种核酸的一种或多种重组 载体。本发明还涉及用这种核酸或这种重组载体转化的一种或多种宿主细 胞。

实例

实例1.纤溶酶催化结构域的自动降解以及在纤溶酶催化结构域中对于自溶敏 感的肽键的确定

为了研究纤溶酶的蛋白水解活性的自动灭活的基本机理，本发明人选择 集中于主要由纤溶酶的催化结构域组成的微纤溶酶。

图2中显示了大规模生产的微纤溶酶的典型的尺寸排阻层析(SEC)特 征曲线。收集相应于部分编号5(前峰1)、部分编号7&8(前峰2)、部分 编号10-12(微纤溶酶峰)、以及部分编号15&16(后峰)的洗脱液并且使其 中的物质经受N端氨基酸测序(埃德曼降解)。在部分编号17-18附近的洗 脱峰相应于缓冲液峰。SEC是在一个连接到一个Waters Alliance HPLC系统上 的Amersham Bioscience Superdex 75 10/300 GL柱上进行的。该柱用含有8 mM Na₂HPO₄、1.5mM KH₂PO₄、3mM KCl、0.5M(NH₄)₂SO₄、pH 7.4的缓冲 液进行平衡并洗脱。注射50μL的1mg/mL微纤溶酶溶液(即50μg纤溶 酶)。用紫外吸收检测器在220nm下监测洗脱液中的蛋白质。

得到的氨基酸序列在表2中给出并且相应于微纤溶酶“重链”(以氨基酸 APS开始，即重链的19C端氨基酸)和轻链(以氨基酸VVG开始)，并且 相应于两种自动降解产物(以氨基酸EAQ和氨基酸VCN开始)。对于纤溶 酶(原)的全序列以及重链和轻链和自切割位点的指示，参见图1。自动降解 产物分别相应于Lys 137和Lys 147(编号以纤溶酶轻链的位置1处的Val开 始，参见图1)的酰胺键C端的切割。

表2.微纤溶酶以及微纤溶酶自催化降解产物的N端氨基酸序列。

来自大规模生产的微纤溶酶经受自动催化降解。将0.6mg/mL的终浓度 的微纤溶酶在+20℃在pH 3.1、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、以及pH 7.0下孵育 4小时，之后立即将样品在-70℃下冷冻。通过还原SDS-PAGE来分析这些样 品，分析结果显示于图3中(考马斯亮蓝染色的凝胶)。图3展示了大约15 kDa、大约10kDa以及稍微小于10kDa的主要的自动催化降解产物。所观察 到的条带与通过N端氨基酸测序(参见表1)确定的切割位点一致。

在另一组实验中，将大规模产生的微纤溶酶(4mg/mL，在5mM柠檬 酸、6mg/mL甘露醇中，pH 3.1)稀释在一种中性pH缓冲液中，并且将不同 时间后收集的等分部分通过SDS-PAGE或蛋白质印迹进行分析。对于SDS- PAGE分析，通过在BSS+(爱尔康；每mL含有7.14mg NaCl、0.38mg KCl、0.154mg CaCl₂、0.2mg MgCl₂、0.42mg磷酸Na、2.1mg NaHCO₃、 0.92mg葡萄糖以及0.184mg二硫化谷胱甘肽；pH 7.4)中以1.25mg/mL的 终浓度稀释微纤溶酶来获得数据，其中样品保持在室温(图4A)。对于蛋白 质印迹分析，将微纤溶酶(终浓度1.53μM)在PBS中稀释并且在37℃下培 育，并且蛋白质印迹是用一种鼠类抗微纤溶酶抗体来发展的(图4B)。图 4A和4B展示了完整微纤溶酶的时间依赖性降解以及自催化降解产物的积 累。通过将大规模生产的微纤溶酶在100mM磷酸钠(pH 7.2)中稀释2倍而 制备了另一种样品，并且将该样品在37℃下孵育30分钟。然后将二十五微 克蛋白质在一个4-12％的聚丙烯酰胺凝胶上分辨。考马斯颜色之后，切下了 相应于两个降解片段的条带，并且从凝胶中分离肽并且交付N端测序(由 Eurosequence B.V.进行，赫罗纳，荷兰)。15kDa条带产生了预期的针对完 整催化结构域的序列(Val-Val-Gly-Gly)。较小的10kDa片段产生了序列 Val-Gln-Ser-Thr-Glu-Leu，鉴定该序列的主要切割位点在Arg 158与Val 159 之间。10kDa片段还产生了低丰度(＜10％)、较差分辩的序列(Xaa-Xaa- Asn-Arg-Tyr)，表明一个次要切割位点位于Lys 147的C端。所有的编号以 纤溶酶轻链位置1处的Val开始(参见图1)。因此，当使微纤溶酶在2 mg/mL下经受自动降解时，鉴定了一个另外的位于Arg 158与Val 159之间的 自动催化切割位点。

如在图5中所展示，通过蛋白质印迹评定的微纤溶酶自溶的动力学(圆 圈)遵循通过显色底物测定评定的微纤溶酶活性的损失(方块)(参见实例 3)。自溶数据是来自于相应于图4B中的完整微纤溶酶的条带的定量并且来 自于活性数据(使用一个二级过程方程将其最好地拟合；没有示出)。根据 上述实验，推断出微纤溶酶的自动降解是活性损失的原因，并且易于自动催 化切割的主要位点是位于在Arg 158与Val 159之间、在Lys 147与Val 148之 间、以及在Lys 137与Glu 138之间。

有趣的是，在眼玻璃体中的微纤溶酶的灭活动力学非常类似于在PBS (图6A)中所观察到的，并且蛋白质印迹分析显示出眼玻璃体中的微纤溶酶 的灭活还通过自溶而发生(图6B)。为此，将微纤溶酶在PBS中稀释(图 6A中的方块)或在猪眼玻璃体中稀释(图6A中的圆圈)至终浓度1.53 μM，并且在不同的时间点使用显色底物Glu-Phe-Lys-pNA测量活性微纤溶酶 的剩余浓度。在所指示的时间收集猪眼玻璃体样品并且通过如上所述的蛋白 质印迹(图6B)进行分析。箭头指示了15kDa的片段。

实例2.纤溶酶原变体的构建、表达和纯化并且激活成纤溶酶

表达载体

使用购自美国英杰生命技术公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚)的 pPICZαA分泌载体在巴斯德毕赤酵母中直接表达并分泌重组人微纤溶酶原。

该载体含有酿酒酵母α-因子前多肽原的分泌信号。一个XhoI识别序列 存在于α-因子分泌信号的COOH端，紧靠Lys-Arg位点的上游，该位点被 Kex2切割，以从成熟蛋白中去除分泌信号。通过合成在其5’端具有XhoI和 Kex2识别位点的基因，XhoI限制性酶切位点可以用来克隆感兴趣的基因，该 基因与Kex2切割位点平齐。然后感兴趣的重组基因被表达为具有天然NH₂- 末端。在pPICZαA载体中，α-因子分泌信号设计为紧靠下游是具有识别位点 的多克隆位点，这些识别位点针对限制性内切酶EcoRI、SfiI、KpnI、SacII以 及XbaI以促进异源基因的克隆。

基因合成

为了改进巴斯德毕赤酵母中人微纤溶酶原的表达，编码人微纤溶酶原及 其变体的基因是从头合成的，考虑到巴斯德毕赤酵母的优选密码子使用。

为了设计密码子优化的基因序列，将人微纤溶酶原氨基酸序列(SEQ ID NO：2)输入到程序Gene Designer中，该程序是由DNA2.0(门洛帕克，加 利福尼亚)开发的并且在国际互联网上是免费获得的。使用该程序中提供的 巴斯德毕赤酵母密码子使用表将该序列回译成DNA序列。然后手工检查核苷 酸序列并且将其调整以更好地适合于大肠杆菌的密码子使用。此外，当可能 时，去除6个碱基对回文序列和核苷酸重复。在5’端加入一个XhoI限制性酶 切位点和Kex2切割位点，并且在3’端加入一个XbaI限制性酶切位点。

在野生型微纤溶酶原序列中引入突变从而改变如实例1中所述鉴定的氨 基酸残基。改变临近的核苷酸从而引入一个独特的限制性酶切位点，但是在 这种情况下，注意要保留编码的氨基酸序列。

在一种第一变体中，将位置137处的赖氨酸置换为一个谷氨酰胺。 Lys137由位置478-480处的密码子AAA编码。将核苷酸TTGAAA(位置 475-480)改变成CTGCAG，在微纤溶酶原蛋白中引入一个PstI位点并且将 Lys137改变成Gln，而位置136处的亮氨酸未改变(核苷酸序列在SEQ ID NO：4中并且推导的氨基酸序列在SEQ ID NO：5中)。

在一种第二变体中，将位置147处的赖氨酸置换为一个组氨酸。Lys 147由位置508-510处的密码子AAG编码。将核苷酸AAGGTT(位置508- 513)改变成CACGTG，在微纤溶酶原蛋白中引入一个PmlI位点并且将 Lys147改变成His，而位置148处的缬氨酸未改变(核苷酸序列在SEQ ID NO：6中并且推导的氨基酸序列在SEQ ID NO：7中)。

在第三变体中，将位置158处的精氨酸置换为一个组氨酸。Lys158由 位置540-542处的密码子CGT编码。将核苷酸TCGTGTT(位置539-545)改 变成ACACGTG，在微纤溶酶原蛋白中引入一个PmlI位点并且将Arg158改 变成His，而位置157处的甘氨酸以及位置159处的缬氨酸未改变(核苷酸序 列在SEQ ID NO：8中并且推导的氨基酸序列在SEQ ID NO：9中)。

在第四变体中，将以上所述的所有改变合并，将位置137处的赖氨酸置 换成谷氨酰胺，将位置147处的赖氨酸置换成组氨酸并且将位置158处的精 氨酸置换成组氨酸(核苷酸序列在SEQ ID NO：10中并且推出的氨基酸序列在 SEQ ID NO：11中)。

微纤溶酶原变体序列是从头合成的并且通过整合DNA技术(科拉尔维 尔，爱荷华州)克隆到载体pUC57中。

在其他情况下，微纤溶酶原序列被合成并且使用相同的克隆策略通过 DNA2.0(门洛帕克，加利福尼亚)克隆到载体pPICZαA中。

在仍然其他的情况下，在表达载体上的位点定向诱变之后获得了微纤溶 酶原变体，诱变是如上所述使用来自Stratagene(拉荷亚，加利福尼亚)的 QuikChange II位点定向诱变试剂盒来进行的。使用以下引物：

Lys137Gln突变：

CGTTCGGTGCTGGTCTGCTGCAGGAAGCACAATTACCTGTG(正向引 物；SEQ ID NO：12)以及

CACAGGTAATTGTGCTTCCTGCAGCAGACCAGCACCGAACG(反向引 物；SEQ ID NO：13)

Lys137Arg突变：

GGTACGTTCGGTGCTGGTCTGTTGCGTGAAGCACAATTACCTGTGATTG (正向引物；SEQ ID NO：14)以及

CAATCACAGGTAATTGTGCTTCACGCAACAGACCAGCACCGAACGTACC (反向引物；SEQ ID NO：15)

Lys147Ala突变：

CAATTACCTGTGATTGAGAACGCCGTGTGTAACAGATACGAGTTC(正向 引物；SEQ ID NO：16)以及

GAACTCGTATCTGTTACACACGGCGTTCTCAATCACAGGTAATTG(反向 引物；SEQ ID NO：17)

Lys147Glu突变：

CAATTACCTGTGATTGAGAACGAAGTGTGTAACAGATACGAGTTC(正向 引物；SEQ ID NO：18)以及

GAACTCGTATCTGTTACACACTTCGTTCTCAATCACAGGTAATTG(反向 引物；SEQ ID NO：19)

Lys147Gln突变：

CAATTACCTGTGATTGAGAACCAAGTGTGTAACAGATACGAGTTC(正向 引物；SEQ ID NO：20)以及

GAACTCGTATCTGTTACACACTTGGTTCTCAATCACAGGTAATTG(反向 引物；SEQ ID NO：21)

Arg158Ala突变：

CAGATACGAGTTCCTGAATGGCGCCGTGCAGTCCACTGAGTTGTGTGCA GG(正向引物；SEQ ID NO：22)以及

CCTGCACACAACTCAGTGGACTGCACGGCGCCATTCAGGAACTCGTATC TG(反向引物；SEQ ID NO：23)

Arg158Gln突变：

GATACGAGTTCCTGAATGGTCAGGTTCAGTCCACTGAGTTGTGTG(正向 引物；SEQ ID NO：24)以及

CACACAACTCAGTGGACTGAACCTGACCATTCAGGAACTCGTATC(反向 引物；SEQ ID NO：25)

表3中给出了制作的单一、双重以及多重突变体的完全列表(参见进一 步)。

用于微纤溶酶原变体的表达载体的构建

用XhoI和XbaI，将野生型和变体微纤溶酶原序列从载体pUC57消 化，并且直接克隆到载体pPICZαA中。通过XhoI和XbaI限制性制备了受体 载体片段并且使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen GmbH，德国)从琼脂 糖凝胶中纯化。将大肠杆菌菌株TOP10(美国英杰公司)用连接混合物进行 转化并且选择抗氨苄西林克隆。基于限制性分析，保留了含有所预期大小的 插入片段的一个质粒克隆用于进一步表征。生成的质粒克隆的序列确定证实 融合到α-因子偶配信号(mating signal)上的微纤溶酶原编码区的精确插入以 及在编码区中不需要的突变的缺乏。

表达微纤溶酶原变体并且激活成纤溶酶

通过实质上遵循WO 02/50290的实例2中所描述的步骤获得了微纤溶 酶原变体和激活的微纤溶酶变体。

在激活之前，通过免疫亲和层析直接从巴斯德毕赤酵母上清液中纯化出 微纤溶酶原突变体。根据来自GE医疗集团的方案n°71500015AD，将一种鼠 抗人微纤溶酶抗体(使用微纤溶酶作为抗原在Balb/c小鼠中出现；通过杂交 瘤细胞系7H11A11产生，在ThromboGenics N.V.处可得)结合到一种琼脂糖 珠粒上。遵循这个方案，从45mg抗体制备了7.5mL的免疫亲和树脂并且将 其填充在一个XK 16/20柱中。将粗上清液200mL-400mL(从毕赤酵母属培 养物以0.2μm过滤而得/pH 6.0)直接加载到该7H11A11亲和柱上。在一个洗 涤步骤(100mM KH₂PO₄，0.5M NaCl，pH 6.2，10柱体积)之后，用一种 0.2M Glycine-HCl、pH 3.0的缓冲液洗脱微纤溶酶原变体。

将该洗脱液(部分4-6)中和并且在25mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)中 透析。通过经免疫亲和层析(A)获得的层析图，在图7中展示了Lys157Met (K157M)突变体的纯化，并且将不同的洗脱液部分通过SDS-PAGE进行分 析并且随后进行考马斯染色(B)。

上述野生型和变体微纤溶酶原种类的氨基酸序列和核苷酸序列在以下列 出。

SEQ ID NO：2-野生型人微纤溶酶原氨基酸序列

APSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTL ISPEWVLTAAHCLEKSPRPS S YKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRK DIALLKLS SPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLL KEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCF EKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

SEQ ID NO：3-具有优化的密码子使用的用于在毕赤酵母属中表达的人工核 酸序列该核酸序列编码了SEQ ID NO：2的野生型人微纤溶酶原氨基酸序列

GCACCTTCATTCGACTGTGGTAAGCCTCAGGTCGAACCTAAGAAGTGTC CAGGTCGTGTTGTCGGTGGCTGTGTGGCTCATCCTCATTCTTGGCCTTGG CAAGTGTCTCTTAGAACTAGATTTGGTATGCACTTCTGTGGTGGCACCTT GATCTCACCTGAATGGGTCTTAACCGCAGCTCATTGTCTGGAGAAGTCA CCACGTCCATCTTCATACAAGGTCATCCTTGGCGCACATCAGGAAGTCA ATCTTGAGCCTCATGTTCAGGAGATCGAAGTCTCTCGTTTGTTCTTGGAA CCAACTCGTAAAGACATTGCTCTTCTGAAGCTGTCATCTCCTGCCGTGAT TACCGACAAGGTAATTCCTGCCTGCTTGCCTAGTCCTAATTACGTCGTTG CCGACCGTACCGAATGCTTCATTACTGGTTGGGGTGAGACTCAAGGTAC GTTCGGTGCTGGTCTGTTGAAAGAAGCACAATTACCTGTGATTGAGAAC AAGGTTTGTAACAGATACGAGTTCCTGAATGGTCGTGTTCAGTCCACTG AGTTGTGTGCAGGTCACCTTGCAGGTGGTACTGATAGTTGTCAAGGTGA TTCTGGTGGACCACTGGTGTGCTTCGAGAAGGATAAGTACATCTTACAA GGTGTTACGTCTTGGGGTCTTGGATGTGCTCGTCCTAACAAGCCAGGTGT CTACGTCAGAGTCTCCAGATTCGTAACTTGGATCGAAGGTGTCATGCGT AACAACTAA

SEQ ID NO：4-具有Lys137Gln置换的微纤溶酶原变体(突变的密码子表示 为粗斜体，限制性酶切位点XhoI、PstI和XbaI加下划线)

CTCGAGAAAAGAGCACCTTCATTCGACTGTGGTAAGCCTCAGGTCGAAC CTAAGAAGTGTCCAGGTCGTGTTGTCGGTGGCTGTGTGGCTCATCCTCAT TCTTGGCCTTGGCAAGTGTCTCTTAGAACTAGATTTGGTATGCACTTCTG TGGTGGCACCTTGATCTCACCTGAATGGGTCTTAACCGCAGCTCATTGTC TGGAGAAGTCACCACGTCCATCTTCATACAAGGTCATCCTTGGCGCACA TCAGGAAGTCAATCTTGAGCCTCATGTTCAGGAGATCGAAGTCTCTCGT TTGTTCTTGGAACCAACTCGTAAAGACATTGCTCTTCTGAAGCTGTCATC TCCTGCCGTGATTACCGACAAGGTAATTCCTGCCTGCTTGCCTAGTCCTA ATTACGTCGTTGCCGACCGTACCGAATGCTTCATTACTGGTTGGGGTGA GACTCAAGGTACGTTCGGTGCTGGTCTGCTGGAAGCACAATTACCT GTGATTGAGAACAAGGTTTGTAACAGATACGAGTTCCTGAATGGTCGTG TTCAGTCCACTGAGTTGTGTGCAGGTCACCTTGCAGGTGGTACTGATAGT TGTCAAGGTGATTCTGGTGGACCACTGGTGTGCTTCGAGAAGGATAAGT ACATCTTACAAGGTGTTACGTCTTGGGGTCTTGGATGTGCTCGTCCTAAC AAGCCAGGTGTCTACGTCAGAGTCTCCAGATTCGTAACTTGGATCGAAG GTGTCATGCGTAACAACTAATCTAGA

SEQ ID NO：5-推导的氨基酸序列SEQ ID NO：4(加下划线的N端氨基酸 “LEKR”被引入的XhoI+Kex2切割位点所编码；引入的氨基酸突变以粗/斜 体表示并且加下划线)

LEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFC GGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLE PTRKDIALLKLS SPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGA GLLEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPL VCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

SEQ ID NO：6-具有Lys147His置换的微纤溶酶原变体(突变的密码子以粗 的斜体，限制性酶切位点XhoI、PmlI和XbaI加下划线)

CTCGAGAAAAGAGCACCTTCATTCGACTGTGGTAAGCCTCAGGTCGAAC CTAAGAAGTGTCCAGGTCGTGTTGTCGGTGGCTGTGTGGCTCATCCTCAT TCTTGGCCTTGGCAAGTGTCTCTTAGAACTAGATTTGGTATGCACTTCTG TGGTGGCACCTTGATCTCACCTGAATGGGTCTTAACCGCAGCTCATTGTC TGGAGAAGTCACCACGTCCATCTTCATACAAGGTCATCCTTGGCGCACA TCAGGAAGTCAATCTTGAGCCTCATGTTCAGGAGATCGAAGTCTCTCGT TTGTTCTTGGAACCAACTCGTAAAGACATTGCTCTTCTGAAGCTGTCATC TCCTGCCGTGATTACCGACAAGGTAATTCCTGCCTGCTTGCCTAGTCCTA ATTACGTCGTTGCCGACCGTACCGAATGCTTCATTACTGGTTGGGGTGA GACTCAAGGTACGTTCGGTGCTGGTCTGTTGAAAGAAGCACAATTACCT GTGATTGAGAACGTGTGTAACAGATACGAGTTCCTGAATGGTCGTG TTCAGTCCACTGAGTTGTGTGCAGGTCACCTTGCAGGTGGTACTGATAGT TGTCAAGGTGATTCTGGTGGACCACTGGTGTGCTTCGAGAAGGATAAGT ACATCTTACAAGGTGTTACGTCTTGGGGTCTTGGATGTGCTCGTCCTAAC AAGCCAGGTGTCTACGTCAGAGTCTCCAGATTCGTAACTTGGATCGAAG GTGTCATGCGTAACAACTAATCTAGA

SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：6的推导氨基酸序列(加下划线的N端氨基酸 “LEKR”由引入的XhoI+Kex2切割位点所编码；引入的氨基酸突变以粗/斜 体表示并且加下划线)

LEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFC GGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLE PTRKDIALLKLS SPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGA GLLKEAQLPVIENVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPL VCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

SEQ ID NO：8-具有Arg158His置换的微纤溶酶原变体(突变的密码子表示 为粗斜体，限制性酶切位点XhoI、PmlI和XbaI加下划线)

CTCGAGAAAAGAGCACCTTCATTCGACTGTGGTAAGCCTCAGGTCGAAC CTAAGAAGTGTCCAGGTCGTGTTGTCGGTGGCTGTGTGGCTCATCCTCAT TCTTGGCCTTGGCAAGTGTCTCTTAGAACTAGATTTGGTATGCACTTCTG TGGTGGCACCTTGATCTCACCTGAATGGGTCTTAACCGCAGCTCATTGTC TGGAGAAGTCACCACGTCCATCTTCATACAAGGTCATCCTTGGCGCACA TCAGGAAGTCAATCTTGAGCCTCATGTTCAGGAGATCGAAGTCTCTCGT TTGTTCTTGGAACCAACTCGTAAAGACATTGCTCTTCTGAAGCTGTCATC TCCTGCCGTGATTACCGACAAGGTAATTCCTGCCTGCTTGCCTAGTCCTA ATTACGTCGTTGCCGACCGTACCGAATGCTTCATTACTGGTTGGGGTGA GACTCAAGGTACGTTCGGTGCTGGTCTGTTGAAAGAAGCACAATTACCT GTGATTGAGAACAAGGTTTGTAACAGATACGAGTTCCTGAATGGAGTGCAGTCCACTGAGTTGTGTGCAGGTCACCTTGCAGGTGGTACTGATAG TTGTCAAGGTGATTCTGGTGGACCACTGGTGTGCTTCGAGAAGGATAAG TACATCTTACAAGGTGTTACGTCTTGGGGTCTTGGATGTGCTCGTCCTAA CAAGCCAGGTGTCTACGTCAGAGTCTCCAGATTCGTAACTTGGATCGAA GGTGTCATGCGTAACAACTAATCTAGA

SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：8的推导氨基酸序列(加下划线的N端氨基酸 “LEKR”由引入的XhoI+Kex2切割位点所编码；引入的氨基酸突变以粗/斜 体表示并且加下划线)

LEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFC GGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLE PTRKDIALLKLS SPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGA GLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGP LVCFEKDKYILQGVT SWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

SEQ ID NO：10-具有Lys137Gln、Lys147His和Arg158His置换的微纤溶酶 原变体(突变的密码子表示为粗斜体，限制性酶切位点XhoI、PstI、PmlI和 XbaI加下划线)

CTCGAGAAAAGAGCACCTTCATTCGACTGTGGTAAGCCTCAGGTCGAAC CTAAGAAGTGTCCAGGTCGTGTTGTCGGTGGCTGTGTGGCTCATCCTCAT TCTTGGCCTTGGCAAGTGTCTCTTAGAACTAGATTTGGTATGCACTTCTG TGGTGGCACCTTGATCTCACCTGAATGGGTCTTAACCGCAGCTCATTGTC TGGAGAAGTCACCACGTCCATCTTCATACAAGGTCATCCTTGGCGCACA TCAGGAAGTCAATCTTGAGCCTCATGTTCAGGAGATCGAAGTCTCTCGT TTGTTCTTGGAACCAACTCGTAAAGACATTGCTCTTCTGAAGCTGTCATC TCCTGCCGTGATTACCGACAAGGTAATTCCTGCCTGCTTGCCTAGTCCTA ATTACGTCGTTGCCGACCGTACCGAATGCTTCATTACTGGTTGGGGTGA GACTCAAGGTACGTTCGGTGCTGGTCTGCTGGAAGCACAATTACCT GTGATTGAGAACGTGTGTAACAGATACGAGTTCCTGAATGGAGTGCAGTCCACTGAGTTGTGTGCAGGTCACCTTGCAGGTGGTACTGATAG TTGTCAAGGTGATTCTGGTGGACCACTGGTGTGCTTCGAGAAGGATAAG TACATCTTACAAGGTGTTACGTCTTGGGGTCTTGGATGTGCTCGTCCTAA CAAGCCAGGTGTCTACGTCAGAGTCTCCAGATTCGTAACTTGGATCGAA GGTGTCATGCGTAACAACTAATCTAGA

SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：10的推导氨基酸序列(加下划线的N端氨基酸 “LEKR”由引入的XhoI+Kex2切割位点所编码；引入的氨基酸突变以粗/斜 体表示并且加下划线)

LEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFC GGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLE PTRKDIALLKLS SPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGA GLLEAQLPVIENVCNRYEFLNGVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGP LVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN

实例3.与野生型纤溶酶相比，纤溶酶变体的自溶降低

使用重组葡萄球菌激酶(SAK-SY162)或尿激酶(西格玛)，将纯化 的微纤溶酶原突变体首先转化成活性的微纤溶酶种类。简言之，微纤溶酶原 突变体(典型地在5至20μM在25mM磷酸钠中，pH 7.2)在37℃下在葡萄 球菌激酶(典型的微纤溶酶原/葡萄球菌激酶之比＝50/1)或尿激酶(典型的 微纤溶酶原/尿激酶之比＝200)的存在下孵育，并且活性微纤溶酶种类出现 之后，监测对于显色底物S-2403(以0.3mM的浓度使用)的分解活性，如在 本文别处所述。一旦达到最大活性，微纤溶酶原转化的程度通过SDS-PAGE 和HPLC进行评定。在激活之后，通过测量维持在37℃的样品中的活性损失 来监测自溶反应。通过SDS-PAGE和HPLC还使自溶降解可视化。这个实验 的典型实例显示于图8A-C中。

对于自溶的二级速率常数(k)的确定如以下进行确定：(1)在激活期 结束时/自溶期开始时，使用HPLC中的微纤溶酶峰面积来计算活性微纤溶酶 种类的摩尔浓度(通过与标准曲线比较，标准曲线是用纯化的野生型微纤溶 酶建立的)；(2)使用自溶期期间测量的活性损失来计算每个时间点的活性 微纤溶酶的剩余的摩尔浓度；(3)将剩余的微纤溶酶浓度(以mol/l)作为 时间(以秒表示)的函数进行绘图，并且通过非线性回归分析将数据代入方 程1中以获得一个自溶常数k，它的值以M^-1s^-1表示。

方程1：

$\left[\mathrm{\mu PL}\right]=\frac{{\left[\mathrm{\mu PL}\right]}_0}{1+{\left[\mathrm{\mu PL}\right]}_0·k·t}$

在方程1中，[μPL]是在任何给定的时间点处微纤溶酶的浓度并且 [μPL]₀是在t＝0处的浓度。这样一个曲线的一个实例示于图8D中，并且对 于不同的微纤溶酶突变体测量的k值列于表3中(参见进一步)。

SAK-SY162是葡萄球菌激酶Sak-STAR的一种变体(科伦等人1992；纤 维蛋白溶解(Fibrinolysis)6，203-213)，具有以下氨基酸置换：K35A、 E65Q、K74R、E80A、D82A、T90A、E99D、T101S、E108A、K109A、 K130T以及K135R。

实例4.与野生型纤溶酶相比的纤溶酶变体的蛋白水解活性

微纤溶酶的水解活性可以使用显色底物Glu-Phe-Lys-pNA(S-2403， Chromogenix，米兰，意大利)来进行。底物经水解之后，pNA(对硝基苯 胺)基团释放，这导致了在405nm处的吸光度增加。借助于Powerwave X (Bio-Tek)酶标仪，测量了野生型微纤溶酶和微纤溶酶变体的活性。在37℃ 下，在50mM Tris、38mM NaCl、0.01％吐温80中(pH 7.4)进行了测定。

对于微纤溶酶变体，首先将该制品用葡萄球菌激酶或尿激酶激活，并且 在激活期结束时测量活性纤溶酶种类的浓度，如在本文别处所述。然而，为 了防止后续灭活，通过将pH降低到大约3(通过加入2体积的5mM柠檬 酸)使激活的样品稳定。

通过测量在不同底物浓度时的初始水解速率并且通过用方程2分析数 据，获得了微纤溶酶变体对显色底物S-2403的动力学参数(k_cat & K_m)，其 中[μPL]是通过HPLC测量的活性微纤溶酶的浓度，并且[S]是S-2403的浓 度。图9中展示了来自初始水解速率测量的k_cat和K_m确定的实例。

方程2：

$v_i=\frac{k_{\mathrm{cat}}·\left[\mathrm{\mu PL}\right]·\left[S\right]}{K_m+\left[S\right]}$

表3中列出了针对不同的微纤溶酶突变体获得的k_cat和K_m值。

表3.野生型微纤溶酶和一系列单一、双重、以及三倍突变体的动力学参数 (k_cat和K_m)和自溶速率常数的概况。

实例5.在体外和体内模型中的纤溶酶变体的治疗效果。

5.1纤溶酶变体对于脑梗死面积的作用

本发明的纤溶酶变体在减小脑梗死面积方面的效果可以在一个鼠脑梗死 模型中进行，如描述于WO 00/18436的实例2中，或根据威尔士等人所述 (1987，J Neurochem 49，846-851)。在WO 00/18436的实例5中证实了野生 型纤溶酶对脑梗死面积的有益作用。用本发明的任何纤溶酶变体进行一个类 似的实验并且测量了这些纤溶酶变体的有益作用并且与野生型纤溶酶的有益 作用进行比较。

5.2纤溶酶变体的体内血栓溶解活性

兔体外环血栓溶解模型(WO 02/50290的实例6；Hotchkiss等人，1987， Thromb Haemost 58，107-摘要377)、狗冠状动脉回旋支铜线圈诱导的血栓 形成模型(WO 02/50290的实例8；Bergmann等人，1983，Science 220，1181- 1183)或兔颈静脉血栓形成模型(Collen等人，1983，J Clin Invest 71，368- 376)可以用于证明本发明的纤溶酶变体的体内血栓溶解活性。如WO 00/18436的实例7和9以及Collen等人(1983)所述，用这些模型证明了野 生型纤溶酶对于血栓形成的有益作用。用本发明的任何纤溶酶变体进行类似 的实验并且测量了这些纤溶酶变体的有益作用并且与野生型纤溶酶的有益作 用进行比较。

5.3纤溶酶变体的体外血栓溶解活性

在WO 01/36609的实例6中描述了外周动脉闭塞(PAO)的一个体外 模型并且在这个模型中证明了野生型纤溶酶的血栓溶解效果。用本发明的任 何纤溶酶变体进行一个类似的实验并且测量了这些纤溶酶变体对于外周动脉 闭塞的血栓形成的有益作用并且与野生型纤溶酶的有益作用进行比较。

5.4通过纤溶酶变体诱导的眼玻璃体液化以及玻璃体后部脱离

WO 2004/052228的实例5披露了用于确定效果的一种测定法、以及微 纤溶酶使死后猪眼中的玻璃体液化的效果。WO 2004/052228的实例6披露了 用于确定效果的一种测定法、以及微纤溶酶诱导人死后眼中的玻璃体后部脱 离(PVD)的效果。在类似的死后模型中证实了玻璃体液化和PVD由本发明 的纤溶酶变体诱导。

5.5由纤溶酶变体诱导的体内PVD

WO 2004/052228的实例7披露了用于确定效果的一种测定法、以及微 纤溶酶在一个体内猫模型中诱导PVD的效果。在一个类似的体内模型中证实 了PVD由本发明的纤溶酶变体诱导。