一种微小RNA及其反义核酸在诊断、预防、治疗和/或预后评估心肌缺血性损伤中的用途

摘要

本发明提供一种微小RNA及其反义核酸在诊断、预防、治疗和/或预后评估心肌缺血性损伤中的用途。本发明提供的微小RNA为包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或变体：5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3’。该微小RNA可以作为一种新的生物标志物应用于心肌缺血性损伤中的诊断和/或预后评估。此外，该微小RNA的反义核酸可以作为一种新型的药物用于心肌缺血性损伤的预防和/或治疗。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药工程领域及心脏疾病的诊断、预防和治疗领域，涉及一种内源性的非编码小RNAs及其反义核酸的新用途，具体涉及一种微小RNA(microRNA，miRNA)及其反义核酸在诊断、预防和/或治疗心肌缺血性损伤中的用途。 

背景技术

目前，心血管疾病是导致人类死亡的第一杀手，缺血性损伤是诸多心血管疾病的重要病理因素，心肌缺血性损伤的主要原因是因为缺氧导致的。如何有效预防和治疗心肌缺血性损伤是目前医学和生物学研究亟待解决的问题。 

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类广泛存在于真核生物、长度为21-25nt的非蛋白质编码小RNA，它们能以序列特异性方式调节基因表达，在发育、凋亡、代谢以及人类疾病方面都起着不容忽视的作用。miRNA的生理病理调控机制是近几年来受到高度重视的一门新型学科。 

发明内容

因此，本发明的目的是，提供一种微小RNA及其反义核酸在制备用于诊断、预防、治疗和/或预后评估心肌缺血性损伤的药物或试剂盒中的用途。 

本发明的另一个目的是，提供包含上述微小RNA及其反义核酸的试剂盒或药物。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种微小RNA及其反义核酸在制备用于诊断、预防、治疗和/或预后评估心肌缺血性损伤的药物或试剂盒中的用途，其中所述微小RNA为包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或变体： 5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3’(SEQ ID NO.1)。 

优选地，所述微小RNA反义核酸为包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或变体：5’-CUGCCUGUCUGUGCCUGCUGU-3’(SEQ IDNO.2)。 

优选地，所述心肌缺血性损伤包括心绞痛、急性心肌梗塞、室性心律失常、冠状动脉粥样硬化性心脏病。 

另一方面，本发明提供一种用于诊断和/或预后评估心肌缺血性损伤的试剂盒，所述试剂盒包含用于特异性检测微小RNA的探针或引物，其中所述微小RNA为包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或变体：5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3’(SEQ ID NO.1)。 

优选地，所述试剂盒中包含的探针或引物具有以下所示的序列： 

5’-ATTGACAGCAGGCACAGAC-3’(SEQ ID NO.3)； 

5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID NO.4)。 

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物组合物，其包含治疗有效量的微小RNA反义核酸和药学上可接受的病毒、载体或辅料，其中所述微小RNA反义核酸为包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或变体：5’-CUGCCUGUCUGUGCCUGCUGU-3’(SEQ ID NO.2)。 

优选地，所述药物组合物中包含的微小RNA反义核酸的含量为0.5-2μg。 

优选地，所述药学上可接受的载体或辅料选自壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒等。 

优选地，所述药物组合物以口服或注射的方式给药；优选地，所述注射给药方式选自静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射和心肌注射。 

综上所述，本发明人通过大量实验研究发现，miRNAs成员之一的miR-214对缺氧心肌细胞的损伤作用，为心肌缺血的治疗找到新靶点。具体地，本发明人对H9C2心肌细胞进行缺氧、缺氧再给氧及H₂O₂处理，Real-time PCR方法确定miR-214在缺氧H9C2细胞中的表达，发现miR-214在缺氧、缺氧再给氧及H₂O₂处理的H9C2细胞中表达增加，并且westenblotting技术测定细胞中抗凋亡蛋白Bcl-W表达减少。而采用细胞转染技术将miR-214抑制剂(即miR-214反义核酸)转入缺氧及H₂O₂处理的H9C2细胞中，MTT法测定H9C2细胞死亡率，发现miR-214抑制剂使细胞死亡率降低，经检测发现细胞中抗凋亡蛋白Bcl-W表达增加。此外，采用构建 的miR-214质粒转染扩增的腺病毒增加缺氧、缺氧再给氧及H₂O₂处理的H9C2细胞的死亡率，并且使H9C2细胞中Bcl-W蛋白的表达降低。在进一步的实验中，发现miR-214质粒转染扩增的腺病毒灌注增加大鼠离体缺血再灌注心脏心肌细胞的凋亡，并且降低其心脏心功能恢复，同时还增加其心脏心肌细胞坏死和肌纤维溶解。 

因此，miR-214可以作为一种新的生物标志物应用于心肌缺血性损伤中的诊断和/或预后评估。此外，miR-214的反义核酸可以作为一种新型的药物用于心肌缺血性损伤的预防和/或治疗。 

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中： 

图1为miR-214在缺氧处理的H9C2细胞中的表达；缺氧处理时间分别为1h，2h，4h，8h，随着缺氧时间延长，miR-214基因表达逐渐增加。 

图2为miR-214在缺氧再给氧处理的H9C2细胞中的表达；缺氧处理时间分别为1h、2h、4h、8h，再给氧时间为1h；缺氧2h再给氧1h处理组的miR-214基因表达达到最高值。 

图3为miR-214在H₂O₂处理的H9C2细胞中的表达；H2O2处理0.5h、1h，随着H₂O₂浓度增加，miR-214基因表达逐渐增加。 

图4为miR-214抑制剂对缺氧处理的H9C2细胞死亡率的影响；miR-214抑制剂降低了缺氧处理2h的H9C2细胞死亡率。 

图5为miR-214抑制剂对H₂O₂处理的H9C2细胞死亡率的影响；miR-214抑制剂降低了H₂O₂处理1h的H9C2细胞死亡率。 

图6为BcL-W蛋白在H₂O₂处理的H9C2细胞中的表达；H₂O₂浓度分别为20μM、40μM，处理时间为1h；H₂O₂处理降低了H9C2细胞中BcL-W蛋白的表达。 

图7为miR-214抑制剂对BcL-W蛋白表达的影响；miR-214抑制剂增加了BcL-W的蛋白表达。 

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。 

以下各实施例中使用的实验材料和试剂如下： 

H9C2细胞购自ATCC(美国标准生物品收藏中心) 

TRIquick试剂购自北京索莱宝科技有限公司； 

DNTPs购自上海博亚生物技术有限公司； 

M-MLV逆转录酶购自Amersham公司； 

核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor)和Real-time RT PCR试剂盒均购自TaKaRa公司； 

引物序列委托Invitrogen公司合成。 

实施例1：miR-214在缺氧处理的H9C2细胞中表达增加 

本实施例选取对数生长期的H9C2细胞，将处于对数生长期的细胞放入低氧培养箱(长沙华曦电子科技有限公司生产。型号：YCP-30SQ)中，进行缺氧(≤1％)1h、2h、4h、8h处理。之后，TRIquick试剂提取总RNA，制备c-DNA，Real-time RT PCR法检测miR-214的表达量，并且以未经缺氧处理的细胞作为对照。 

1、总RNA提取： 

采用TRIquick试剂分别提取细胞总RNA。 

(1)缺氧1h、2h、4h、8h处理后移去培养液，在培养皿中直接加入TRIquick裂解细胞，10cm²面积加1ml TRIquick。用取样器吹打混匀。 

(2)4℃12000rpm离心10min，取上清。每使用1ml TRIquick向样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置5min。 

(3)4℃12000rpm离心15min，样品分为三层。RNA主要在无色的水相。把水相转移到新管中。 

(4)在转移到新管中的水相中加入等体积的冰冷异丙醇，混匀，室温放置20min。 

(5)4℃12000rpm离心10min，去上清。加入1ml 75％乙醇(用RNase-free水配制)洗涤沉淀。4℃7000rpm离心5min，弃上清。 

(6)室温放置凉干，加入适量RNase-free水，充分溶解RNA。 

(7)-80℃保存RNA样品。 

2、miR-214的c-DNA制备 

1)设计引物序列： 

miR-214逆转录(RT)引物序列如下(SEQ ID NO.5)： 

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTGCCT-3’； 

U6逆转录(RT)引物序列如下(SEQ ID NO.6)： 

5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。 

2)miR-214的c-DNA制备： 

5*RT缓冲液：4μl 

DNTPs：8μl 

miR-214RT引物：1μl 

核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor)：1μl 

RNA：1μl 

DEPC水：4μl 

M-MLV逆转录酶：1μl 

加M-MLV前后充分混匀，42℃1h，95℃5min，-20℃保存样品。 

所制备的miR-214的cDNA序列如下(SEQ ID NO.7)： 

CACGTGTATGAGTGTACTTCCTGAATAAAGTCAAACGTCTAACTTCTTTTTAGTTCCATAATGTTTAATGTTTAATTCTATTGTGTGTTTTTCTCCTTTCCCTTTATCCCCTCTCCTTCAATCACCAAATCTGGAAAACAGGCTGATTGTATCTGTCCAAGAAAAAAGGAACCGCGAAGGAGCCATGGTCCTGGATGGACAGAGTTGTCATGTGTCTGCCTGTCTACACTTGCTGTGCAGAACATCCGCTCACCTGTACAGCAGGCACAGACAGGCAGTCACATGACAACCCAGCCTGAATGACAACCAGCCATTGAAAGAAAGCTGCCCTCACACCATAGCATCTACACCAAGAGCTACAACCACAGTGAGGGGTTTGGGGGCCTGGGGCTTTTCTGTCGGCTTATTAAAATAAACTCGTATGTAATCCTTCTATTTTGATTCGTATATTAAAACCTACCCCCCAAGTAAAGGGAGTGGTGCC     

3)U6的c-DNA制备： 

5*RT缓冲液：4μl 

DNTPs：8μl 

U6RT引物：1μl 

核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor)：1μl 

RNA：1μl 

DEPC水：4μl 

M-MLV逆转录酶：1μl 

加M-MLV前后充分混匀，42℃1h，95℃5min，-20℃保存样品。 

3、Real-time PCR法检测miR-214的表达量 

采用Real-time RT PCR试剂盒(购自TaKaRa公司)检测miR-214的表达量。 

1)设计引物序列如下： 

miR-214上游引物(SEQ ID NO.3)： 

5’-ATTGACAGCAGGCACAGAC-3’ 

miR-214下游引物(SEQ ID NO.4)： 

5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ 

U6上游引物(SEQ ID NO.8)： 

5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’ 

U6下游引物(SEQ ID NO.9)： 

5’-AACGCT TCA CGA ATT TGCGT-3’ 

2)miR-214Real-time RT PCR反应体系如下： 

Mix：12.5μl 

miR-214上游引物：0.5μl 

miR-214下游引物：0.5μl 

ROX染料：0.5μl 

c-DNA：2μl 

双蒸水：9μl 

U6Real-time RT PCR反应体系如下： 

Mix：12.5μl 

U6上游引物：0.5μl 

U6下游引物：0.5μl 

ROX染料：0.5μl 

c-DNA：2μl 

双蒸水：9μl 

Real-time RT PCR反应条件如下： 

①95℃：30s 

②95℃：5s

③58℃：30s 

④72℃：30s 

循环步骤②至④45次。 

3)数据处理： 

miR-214表达量用下式计算： 

ΔCt_样品＝Ct_样品-Ct_样品U6

ΔCt_对照＝Ct_对照-Ct_对照U6

ΔΔCt＝ΔCt_样品-ΔCt_对照

miR-214相对表达量变化＝2^-ΔΔCt

具体结果如图1所示。可见，随着缺氧处理时间的延长，miR-214基因表达逐渐增加。 

实施例2：miR-214在缺氧再给氧处理的H9C2细胞中表达增加 

本实施例选取对数生长期的H9C2细胞，放入低氧培养箱中进行缺氧(≤1％)1h、2h、4h、8h处理，之后，再将细胞移到CO₂培养箱(日本三洋公司。型号：MCO15AC)中继续培养1h。 

TRIquick试剂提取总RNA，制备c-DNA，Real-time RT PCR法检测miR-214的表达量，具体的方法参见实施例1。 

实验结果如图2所示。可见，缺氧2h再给氧1h处理组的miR-214基因表达达到最高值。 

实施例3：miR-214在H₂O₂处理的H9C2细胞中表达增加 

本实施例选取对数生长期的H9C2细胞，采用不同浓度的H₂O₂(20μM、40μM、80μM)处理不同时间(0.5h、1h、2h)。 

TRIquick试剂提取总RNA，制备c-DNA，Real-time RT PCR法检测miR-214的表达量，具体的方法参见实施例1。 

实验结果如图3所示。可见，H₂O₂处理0.5h、1h，随着H₂O₂浓度增加，miR-214基因表达逐渐增加。 

此外，还采用westen blotting技术(具体操作见Methods in molecularbiology(C1ifion，N.J.)1995；49：423-437)检测H₂O₂处理的H9C2细胞中BcL-W蛋白的表达，并以actin蛋白为对照。 

电泳检测结果见图4，可见，当H₂O₂浓度分别为20μM、40μM，处理时间为1h时，H₂O₂处理降低了H9C2细胞中BcL-W蛋白的表达。 

实施例4：miR-214抑制剂降低缺氧处理的H9C2细胞的死亡率 

本实施例选取对数生长期的H9C2细胞，用细胞转染技术将分别将不同量(2μg、4μg、8μg)的miR-214抑制剂(即为合成的miR-214反义核酸序列)转入H9C2细胞中，进行缺氧2h处理，采用MTT法(具体操作见J Immunol Methods，1983，65(1～2)：55)测定H9C2细胞的死亡率。 

实验结果如图5所示。可见，miR-214抑制剂降低了缺氧处理2h的H9C2细胞的死亡率。 

实施例5：miR-214抑制剂降低H₂O₂处理的H9C2细胞的死亡率 

本实施例选取对数生长期的H9C2细胞，用细胞转染技术将分别将4μgmiR-214抑制剂(即为合成的miR-214反义核酸序列)转入H9C2细胞中，用20μM H₂O₂处理1h，以未加入miR-214抑制剂的细胞为阴性对照，采用MTT法测定H9C2细胞的死亡率。 

实验结果如图6所示。可见，miR-214抑制剂降低了H₂O₂处理1h的H9C2细胞的死亡率。 

此外，还采用westen blotting技术检测miR-214抑制剂对H₂O₂处理的H9C2细胞中BcL-W蛋白表达的影响。 

电泳结果见图7，表明miR-214抑制剂增加了H₂O₂处理的H9C2细胞中BcL-W蛋白的表达。 

实施例6：cDNA质粒的构建 

本实施例采用RT-PCR、DNA纯化和连接、转化感受态细胞构建质粒，其中构建质粒所采用的cDNA序列为实施例1所制备的miR-214的cDNA序列。 

1)RT-PCR反应 

RT-PCR所用引物序列(包括miR-214序列在内的一段DNA序列 (500bp)的引物)： 

Ad-rno-214-F(上游引物，SEQ ID NO.10)： 

5’-AGACTCGAGCACGTGTATGAGTGTACTTCC-3’ 

Ad-rno-214-R(下游引物，SEQ ID NO.11)： 

5’-AATACTAGTGGCACCACTCCCTTTACTTGG-3’ 

RT-PCR反应体系： 

2*PCR TaqMix：20μl 

Ad-rno-214-F：2μl 

Ad-rno-214-R：2μl 

DNA：2μl 

双蒸水：14μl 

混匀，12000rpm离心5min。 

其中2*PCR TaqMix(购自北京美莱博医学科技有限公司)。 

RT-PCR反应条件： 

①95℃：5min 

②95℃：30s 

③56℃：30s 

④72℃：1min 

⑤72℃10min 

循环步骤②至④35次。 

2)RT-PCR反应产物纯化： 

RT-PCR反应产物纯化采用DNA纯化试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)，具体操作如下： 

(1)RT-PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳：电泳条件：8％的琼脂糖凝胶。恒压(100伏特)45min。 

(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。 

(3)向胶块中加入3倍体积溶胶液PN。50℃水浴放置10min，至胶完全溶解。 

(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 

(5)向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 

(6)向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉废液。 

(7)将吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm离心2min，将吸附柱CA2置于室温放置10min。 

(8)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液。 

3)连接 

将纯化的RT-PCR反应产物与Shuttle Vector 1.0-CMV载体连接： 

Shuttle Vector 1.0-CMV载体双酶切： 

(1)酶切体系及条件： 

speI：2μl 

xhoI：2μl 

NEB buffer2：4μl 

DNA溶液：32μl 

混匀，离心，37℃水浴4h，65℃水浴20min终止反应。 

(2)酶切产物纯化： 

酶切产物纯化同RT-PCR反应产物纯化。 

纯化的RT-PCR反应产物与酶切、纯化的Shuttle Vector 1.0-CMV载体连接： 

采用TaKaRa公司生产的DNA连接试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)。 

连接体系及条件： 

Solution I：5μl 

DNA溶液：2.5μl 

Shuttle Vector 1.0-CMV载体溶液：2.5μl 

轻轻混匀，离心，16℃过夜。 

4)转化 

采用连接产物转化感受态细胞，具体操作如下： 

取感受态细胞悬液50μl，加入上述连接产物，混匀，在冰浴中静置30min。 

将离心管置于42oC水浴中放置60s，然后快速将管转移到冰浴中，细胞冷却2min。 

向离心管中加入300μl无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床振荡培养1h。 

取200μl上述培养基液，涂于LB培养基板上(含氨卞青霉素)，37℃培养过夜。 

5)提取质粒： 

挑取上述培养板上的菌落，加入到3ml LB培养基中(含氨卞青霉素)，混匀后置于37℃摇床振荡培养过夜。 

将上述培养过夜的菌液加入到250ml LB培养基中(含氨卞青霉素)，混匀后置于37℃摇床振荡培养过夜。 

提取质粒采用高纯度质粒大提试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)，实验步骤如下： 

取100ml上述过夜培养的菌液，室温10000rpm离心3min收集细菌。尽量去除上清。 

向留有菌体沉淀的离心管中加入10ml溶液P1，彻底悬浮细菌细胞沉淀。 

向离心管中加入10ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，室温放置5min。 

向离心管中加入10ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，室温放置10min。10000rpm离心5-10min，将溶液全部倒入过滤器CS中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml管中。 

向滤液中加入0.35倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀。 

4℃10000rpm离心30min，轻轻倒掉上清液，将其倒置在吸水纸上。 

向管中加入6ml 70％乙醇充分漂洗沉淀，4℃10000rpm离心10min，轻轻倒掉上清液。重复此步骤一次。 

将离心管敞口室温放置20min。使乙醇充分挥发后加入1-1.5ml洗脱缓冲液TB，充分溶解沉淀。 

实施例7：miR-214质粒转染扩增的腺病毒增加缺氧、缺氧再给氧及H₂O₂处理的H9C2细胞的死亡率和降低Bcl-W蛋白的表达 

1)miR-214质粒转染和腺病毒扩增： 

采用Roche公司生产的FuGENE HD transfection Reagent转染试剂转染HEK293细胞，转染步骤如下： 

(1)HEK293细胞在转染前24h接种于2个10cm的细胞培养盘中，使之在转染时细胞汇聚率为50％-70％。 

(2)细胞在转染之前12h用无双抗的DMEM(10％FBS)换液。 

(3)吸15μl转染试剂与135μl DMEM(无血清、无双抗)混匀，室温静置5min。然后与事先混匀好的20μl DNA和130μl DMEM(无血清、无双抗)混匀，室温静置25min～30min。 

(4)吸走10cm皿中的培养基，将(3)中的混合液加入至10cm皿中，同时再补加8ml DMEM(10％FBS，无双抗)，37℃，5％CO₂培养10～12h。 

(5)将培养基吸走，换上8ml DMEM(10％FBS，有双抗)37℃，5％CO₂培养7-12d. 

2)原代病毒的收集 

(1)当细胞出现致细胞病变效应(CPE)现象后，7-12d，细胞会变圆脱落，此时即可收细胞。 

(2)将培养液连同细胞一起吸进15ml离心管，2000rpm/min，离心5min。 

(3)去上清，向沉淀中加入400μl无血清DMEM培养基悬浮细胞，于-70℃保存。 

(4)收集的细胞于-70℃和37℃反复冻融3次。 

(5)4℃，5000rpm/min，离心10min。 

(6)吸取上清(原代病毒)于另一无菌eppendorf管-70℃冻存。 

3)病毒富集 

(1)将HEK293细胞以50％-70％汇聚率平铺于10cm皿中，以30-50％的体积比加入含病毒上清液。在感染后2-3天出现明显的细胞裂解和CPE 现象。感染后3-5天按原代病毒收集方法收集病毒。 

(2)为了进一步扩增，将上述收集的病毒上清进一步感染HEK293细胞，以获得足够量的病毒。 

4)腺病毒感染H9C2细胞及处理 

将生长状态良好的H9C2细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，待细胞完全贴壁生长至60～80％融合时，予重组腺病毒以2×10⁵PFU/ml感染细胞后继续培养细胞24h后，分别进行以下处理： 

(1)缺氧处理：将腺病毒感染的H9C2细胞和没有感染的H9C2细胞放入低氧培养箱中，进行缺氧(≤1％)2h处理。 

(2)缺氧再给氧处理：将腺病毒感染的H9C2细胞和没有感染的H9C2细胞放入低氧培养箱中，进行缺氧(≤1％)2h处理后，再将细胞移到CO₂培养箱中继续培养1h。 

(3)H₂O₂处理：在腺病毒感染的H9C2细胞和没有感染的H9C2细胞中分别加入H₂O₂(浓度为20μM)，继续培养1h。 

5)测定H9C2细胞的死亡率 

采用MTT法测定H9C2细胞的死亡率，具体操作如下： 

(1)细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液； 

(2)沉淀加入0.5-1ml MTT，吹打成悬液； 

(3)37℃下保温2小时； 

(4)加入4-5ml酸化异丙醇(定容)，打匀； 

(5)1000rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。 

结果显示，miR-214质粒转染扩增的腺病毒增加缺氧、缺氧再给氧及H₂O₂处理的H9C2细胞的死亡率。 

6)测定H9C2细胞中Bcl-W蛋白的表达 

(1)收集细胞及蛋白的提取，具体操作如下： 

a)将长满细胞的培养皿放置在冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的PBS在培养皿中充分洗涤细胞表面，以洗去残留的培养基，倒掉PBS，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS， 尽量在冰上操作。 

b)向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液1ml。然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞。 

c)吸出刮好的细胞裂解液置于1.5ml离心管中(置于冰上)。 

d)样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。离心10000rpm，10分钟，留取上清。 

e)取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度，分装保存在-70℃。 

(2)westen blotting确定H9C2细胞中Bcl-W蛋白的表达，实验步骤如下： 

a)取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液，沸水浴中8分钟，12000rpm离心5分钟。 

b)上样 

c)电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 

d)电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 

e)封闭1小时，一抗(1∶1000)孵育过夜(4度)。二抗(1∶2000)孵育(室温)2小时。 

f)发光。 

结果显示，miR-214质粒转染扩增的腺病毒降低缺氧、缺氧再给氧及H₂O₂处理的H9C2细胞中Bcl-W蛋白的表达。 

实施例8：miR-214质粒转染扩增的腺病毒灌注增加大鼠离体缺血再灌注心脏心肌细胞的凋亡、降低心功能恢复，增加心肌细胞坏死和肌纤维溶解 

1)大鼠离体心脏缺血再灌注方法： 

大鼠腹腔注射20％乌拉坦(5mL/kg)，麻醉后，股静脉注射0.1％肝素(0.6mL/kg)，2～3min后，迅速取出心脏，置于Langendorff灌流装置上，主动脉逆行灌注Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol/L)：NaCl，118.0；KCl，4.7；KH₂PO₄，0.93；MgSO₄·7H₂O，1.2；CaCl₂，1.5；NaHCO₃，25；C₆H₁₂O₆，11.0；pH 7.4。37℃恒温、恒流灌注，并以95％O₂-5％CO₂混合气饱和。采用停灌120min，复灌60min复制I/R损伤模型。在停灌前5分钟，用加入10⁷PFU/L的腺病毒灌流液灌注心脏。 

2)测定心肌细胞的凋亡： 

采用罗氏TUNEL细胞凋亡检测试剂盒测定心肌组织的细胞凋亡，实验步骤如下： 

心肌组织常规固定，石蜡包埋切片。 

PBS洗细胞一次，加入0.1％TritonX-1000.1％柠檬酸钠，在冰上孵育2min。PBS洗2次，干燥样品5min。 

在每个切片上加入50μl Tunel混合试剂。2个阴性对照加50μl Labelsolution(vial 2)。[Tunel混合试剂的配制：Label solution(vial 2)∶酶液(vial1)＝9∶1]。 

摇动载玻片，保证混合试剂覆盖整个组织。 

盖上盖玻片，用锡薄纸包装，在培养箱内放置1小时。 

PBS洗3次。封片。样品在荧光显微镜下直接检测，激发波长为450-500nm。发射波长为515-565nm。 

结果显示，miR-214质粒转染扩增的腺病毒灌注增加大鼠离体缺血再灌注心脏心肌细胞的凋亡。 

3)检测离体心脏的心功能，具体操作如下： 

在大鼠离体缺血再灌注心脏模型的制备过程中，经房室瓣插入带球囊的心导管抵左心室，充盈球囊使左心室舒张末压小于10mmHg(1mmHg＝0.133kPa)。接压力换能器并输入计算机，监测心功能。心功能指标包括：左心室最大收缩压(LVESP)，左心室最大舒张压(LVEDP)，左心室收缩压最大变化率(+dp/dtmax)、左心室舒张压最大变化率(-dp/dtmax)、心率(HR)。 

结果显示，miR-214质粒转染扩增的腺病毒灌注降低大鼠离体缺血再灌注心脏心功能恢复。 

4)检测心肌细胞坏死和肌纤维溶解情况： 

心脏再灌注结束后，留取心尖部心肌组织，4％甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察心肌细胞坏死和肌纤维溶解情况。 

结果显示，miR-214质粒转染扩增的腺病毒灌注增加大鼠离体缺血再灌注心脏心肌细胞坏死和肌纤维溶解。