合成性的多肽文库以及用于建立具有天然多样性的多肽变体的方法

摘要

本发明提供了一种组合物以及方法，所述的方法用以建立DNA序列文库，其中所述的DNA序列能够编码同源性多肽，以及所述的文库所具有的用以识别天然的经过多样性处理的多肽变体的用途。本发明同样提供了这样的组合物以及方法，所述的方法用以建立大量的合成性的抗体片段，在所述的抗体片段中所述的一个或者几个互补决定区域(CDR)被大量的所述相对应的从一种天然的来源中捕获到的互补决定区域(CDR)进行了取代。本发明进一步的提供了这样的组合物以及方法，所述的方法用以对一个多肽的一部分进行多样性处理，所述的多样性处理是通过下述的方式来实现的：插入一种具有合成性的来源或者天然来源的经过多样性处理的序列，而不需要对所述的初始多肽编码序列进行修饰。

说明书

相关申请

本申请要求享有申请日为2009年5月20日的美国临时申请 No.61/179850、申请日为2009年12月17日的美国临时申请No. 61/287336以及申请日为2010年3月17日的美国临时申请No. 61/314794所拥有的权益，上述每一篇申请中的全部内容整体被 引入到本发明中作为参考。

发明的领域

本发明涉及到DNA序列文库的建立以及这样的文库所具有 的用途，其中所述的DNA序列能够编码同源性的多肽。本发明 特别涉及到大量的合成性的抗体片段的建立，其中在所述的抗体 片段中存在的一个或者几个互补决定区域(CDR)被一批来自于 天然来源的相应的互补决定区域(CDR)进行了取代。本发明进 一步的涉及到大量的抗体片段的建立以及它们的用途，其中所述 的抗体片段中含有来自于一种经过免疫的动物的互补决定区域 (CDR)，所述的抗体可以被用来作为一种生成高亲和性的抗体 片段的较佳来源。本发明进一步的涉及到对一部分多肽所进行的 多样性处理，所述的多样性处理是通过插入一种合成来源的或者 天然来源的具有多样性的序列的方式来实现的，这种处理不需要 对所述的初始多肽编码序列进行修饰。

发明的背景技术

抗体是由四个多肽组成的：两条重链以及两条轻链。抗体所 具有的所述的抗原结合部分是由所述的轻链可变结构域(VL) 以及所述的重链可变结构域(VH)形成的。在这样的结构域的 末端处由六个环形成了所述的抗原结合位点并且这也被称之为 所述的互补决定区域(CDR)。三个互补决定区域(CDR)位于 所述的重链可变(VH)结构域(H1，H2以及H3)之上并且其 余的三个存在于所述的轻链可变(VL)结构域(L1，L2以及L3) 之上。在B细胞的形成过程中，通过体细胞的重组作用能够形成 一个唯一的免疫球蛋白区域，其中所述的体细胞重组被称之为 V(D)J(可变基因(多样性基因)连接基因)重组。所述的免疫 球蛋白的重链或者轻链所具有的可变区域是由不同的基因片段 来进行编码的。所述的重链是由三个被称之为可变片段(V)，多 样性片段(D)以及连接片段(J)的片段来进行编码的，而所述 的轻链可变区域则仅仅是通过可变片段(V)以及连接片段(J) 这两个片段的重组而形成的。通过在存在于所述的基因组之中的 所述的多个拷贝的可变片段(V)，多样性片段(D)以及连接片 段(J)中的一个所进行的重组反应，能够建立大量的抗体互补 位。所述的可变(V)片段能够编码所述的互补决定区域1(CDR1) 以及互补决定区域2(CDR2)而所述的互补决定区域3(CDR3) 是通过所述的重组事件来建立的。在所述的免疫应答的过程之 中，通过一种方法能够向所述的抗原结合位点之中导入更多的多 样性，其中所述的方法被称之为体细胞的超突变(SHM)。在这 个方法过程中，基因点突变被导入到所述的重链以及轻链所具有 的可变基因之中并且特别是被导入到能够编码所述的互补决定 区域(CDR)的区域之中。这种额外的可变性允许进行B细胞表 达抗体变体的筛选以及扩展，其中所述的B细胞表达抗体变体对 于它们的同源性抗原而言具有提高的亲和性。

近几年来几种展示技术已经显现出来并且允许进行大批量 的蛋白质或者肽的筛选。这些包括噬菌体展示，细菌展示，酵母 展示以及核糖体展示(参见Smith GP.于1985年6月14日在 Science《科学》228(4705)：1315-7中发表的文章；Hanes J以 及Pluckthun A.于1997年5月13日在Proc Natl Acad Sci USA《美 国科学院院刊》94(10)：4937-42中发表的文章；Daugherty PS 等人于1998年9月在Protein Eng.《蛋白质工程)》11(9)：825-32 中发表的文章；Boder ET以及Wittrup KD.于1997年6月在Nat  Biotechnol.《自然生物技术》15(6)：553-7中发表的文章)。特 别的，这些方法已经被广泛的应用在抗体及其片段之中。已经描 述了许多的方法，用以建立多肽文库并且用以对具有期望的结合 特性的成员进行筛选。

第一种途径是通过基因的扩增作用从天然的全体个体 (repertoires)中捕获经过重新排列的免疫球蛋白基因，其中使 用到来自于人类或者其他哺乳动物的组织或者细胞作为一种遗 传多样性的来源。在此之后对这些批量的经过重新排列的重链以 及轻链(VH以及VL)进行组合，从而建立结合对文库，其中所 述的结合对文库可以在细菌噬菌体上或者在其他的展示包上进 行展示，其中所述的展示包例如是细菌，酵母或者是哺乳动物细 胞。在这种情形下，在所述的供体中发现的很大一部分的所述免 疫球蛋白个体(repertoire)可以被进行捕获。因此在这样的个体 中可以找到由所述的供体生殖细胞系基因所编码的骨架以及多 样性，其中所述的多样性是同时由可变片段(多样性片段)连接 片段(V(D)J)的重组作用以及体细胞的超突变作用来建立的(参 见Marks JD等人于1991年12月5日在J Mol Biol.《分子生物学 杂志》222(3)：581-97中发表的文章；McCaffety的美国专利 No.5969108)。

天然存在的全部个体所具有的一个局限性是：天然存在的抗 体可能是以本身具有低稳定性的骨架为基础的，这种低稳定性能 够限制它们的表达水平，货架期以及它们作为试剂或者治疗分子 所具有的有效性。为了克服这样的局限性，已经研究出许多的方 法用以建立合成性的抗体文库。在这些途径中，对唯一选定的抗 体骨架或者有限数量的选定的抗体骨架进行筛选，其中所述的抗 体骨架是通过它们相对应的生殖细胞系基因来进行编码的。对 这些骨架所进行的筛选普遍情况下是基于它们的生物化学稳定 性和/或它们在天然的抗体个体中所具有的表达频率来进行的。为 了建立一批结合蛋白，在此之后向所有的互补决定区域(CDR) 之中或者互补决定区域(CDR)子集之中导入合成性的多样性。 通常情况下，可以使用不同的策略对所述的整体的互补决定区域 (CDR)或者所述互补决定区域(CDR)的一部分进行多样性处 理。在一些情形中将多样性导入到存在于所述的互补决定区域 (CDR)之内的选定的位置上(参见Knappik A等人于2000年2 月11日在J Mol Biol.《分子生物学杂志》296(1)：57-86中发 表的文章)。作为靶向的残基可以是：经常参与抗原接触的那些 残基，能够在天然的抗体个体中展示出最大程度的多样性的那些 残基，或者甚至是在所述的天然的亲和性成熟过程中通过所述的 细胞机构能够优先命中的那些残基，其中所述的细胞机构是参与 了体细胞的超突变的发生的细胞机构(参见Balint RF，Larrick JW. 于1993年12月17日在Gene《基因》137(1)：109-18中发表 的文章)。

已经使用过几种方法来对所述的抗体互补决定区域(CDR) 进行多样性处理。重叠聚合酶链式反应(PCR)已经被广泛的用 来对骨架以及互补决定区域(CDR)元件进行组装从而重新构建 抗体基因，其中在所述的重叠聚合酶链式反应(PCR)之中使用 了简并寡核苷酸。在另外一种途径中，已经在所述的骨架区域之 中的每一个所述的互补决定区域(CDR)的边界处设计了一个独 特的限制性酶位点，所述的限制性酶位点能够允许通过由限制性 酶介导的克隆方式来进行具有多样性的互补决定区域(CDR)的 导入。无论在何种情况下，因为所述文库所具有的全部成员都是 以具有选定的以及优选的特征的骨架为基础的，因而可以预期到 的是，来自于这样的个体的所述抗体是更加稳定的并且是一种能 够提供有效的试剂的较好的资源(参见Knappik的美国专利No. 6696248；Sidhu SS.等人于2000年在Methods Enzymol.《酶学方 法》328：333-63中发表的文章；Lee CV等人于2004年7月23 日在J Mol Biol.《分子生物学杂志》340(5)：1073-93中发表的 文章)。

然而，这样的合成性的文库所具有的一个重要的局限性是： 所述的文库成员中有相当大的比例是不被进行表达的，这是因为 被随机的进行多样性处理的序列不能够允许所述的蛋白质进行 恰当的表达和/或折叠。这个问题对于所述的重链所具有的互补决 定区域3(CDR3)而言是格外显著的。的确，这个互补决定区域 (CDR)在通常情况下提供了大部分的结合所述抗原所需的结合 能力并且在长度以及序列上是存在高度多样性的。虽然所述的其 他互补决定区域(CDR)(H1，H2，L1，L2以及L3)仅仅能够 采用少数的三维构象，这些三维构象被称之为标准折叠，可以被 所述的重链互补决定区域3(CDR3)所采用的所述构象的数量仍 然存在太多的多样性而难以进行预测(参见A1-Lazikani B等人于 1997年11月7日在J Mol Biol.《分子生物学杂志》273(4)：927-48 中发表的文章)。除此之外，所述的长的简并寡核苷酸的使用通 常能够带来单个碱基对的缺失，其中所述的简并寡核苷酸常常被 来对长的可变重链互补决定区域3(CDR H3)进行覆盖。这些因 素显著的降低了所述的合成性的个体所具有的功能规模。

天然个体以及合成性的个体都具有优点以及局限性。在一个 方面，这种依靠对所述的能够发生自然的重新排列的抗体可变基 因所进行的捕获的策略并不是最理想的，这是因为它们能够将潜 在的并不是有利的骨架囊括在所述的文库之中。一个积极的方面 是这些经过重新排列的可变基因包括了这样的互补决定区域 (CDR)，当它们在一种天然的抗体中被进行表达时，所述的互 补决定区域(CDR)能够兼容恰当的结构域折叠。在另外一个方 面，这种基于筛选骨架以及插入合成性的多样性的策略能够通过 所述的骨架所具有的提高的稳定性而获得益处，但是会受到所述 的大量互补决定区域(CDR)序列的限制，其中所述的序列不能 够与折叠和/或表达作用进行兼容并且能够使所述的整个结构域 产生不稳定性(附图1A)。因此需要寻求一种新的途径，所述的 途径应当能够将使用选定的骨架所带来的益处与期望的特征进 行结合，并且将它们与适当折叠的互补决定区域(CDR)进行结 合，其中所述的适当折叠的互补决定区域(CDR)例如是来自于 天然个体的互补决定区域(CDR)。

以上描述的全部途径是通过下述的方式之一来建立抗体文 库的：通过捕获经过自然的重新排列的抗体序列的方式或者通过 合成的手段建立多样性的方式，上述的途径能够受到所述的移码 突变的出现的限制，其中所述的移码突变能够形成非功能性的抗 体序列。这样的突变可能出现在所述的DNA编码所述抗体的分 子操作的多个步骤中出现，例如在聚合酶链式反应(PCR)扩增 和DNA片段的组合以及分子克隆的步骤中。所述的非功能性成 员在抗体文库中出现的频率在通常情况下存在于15％至45％的 范围之内，这取决于所使用到的用以进行捕获或者用以建立所述 的抗体多样性的策略(参见Persson MA等人于1991年3月15 日在Proc Natl Acad Sci USA.《美国科学院院刊》88(6)：2432-6 中发表的文章；Schoonbroodt S.等人于2005年5月19日在Nucleic  Acids Res.《核酸研究》33(9)：e81中发表的文章；E 等人于2000年8月在Nat Biotechnol.《自然生物技术》18(8)： 852-6中发表的文章；Rothe等人于2008年2月29日在J Mol Biol. 《分子生物学杂志》376(4)：1182-200中发表的文章)。所述的 序列所出现的频率对所述的抗体识别过程具有主要的影响，其中 所述的序列是用以编码非功能性抗体的序列。首先，所述的文库 所具有的功能规模被降低并且，因为在所述文库的繁殖过程中非 功能性的克隆在通常情况下具有一种生长优势，它们能够扩展的 更快速并且能够危及所述的抗体备选物的识别过程(参见De  Bruin R等人于1999年4月17日在Nat Biotechnol《自然生物技 术》397-399中发表的文章)。已经将这些问题认定为对于完全开 发所述的抗体文库所具有的潜能而言是一种严重的限制。具有高 度的功能性的文库的建立在本领域内仍然是一项挑战并且已经 促使进行了很多努力用以对所述的过程进行改进。例如，已经使 用了多种多样性处理的策略，其中所述的策略的目标在于模拟那 些在天然的互补决定区域(CDR)序列中发现的所述氨基酸的用 法，其目的在于对可能的序列组合所具有的巨大的多样性进行更 为有效的尝试，其中所述的序列的组合是通过合成性的互补决定 区域(CDR)来进行编码的(参见de Kruif等人于1995年4月 21日在J Mol Biol.《分子生物学杂志》248(1)：97-105中发表 的文章；Sidhu SS等人于2004年4月23日在J Mol Biol.《分子 生物学杂志》338(2)：299-310中发表的文章)。另外一种途径 是对所述的初始文库进行清理，其目的在于在以多样性损失为可 能的代价的前提下除去非功能性的克隆。这种途径已经被应用在 所述的合成性个体的预先筛选之中，这是通过使所述的抗体与一 种一般性的配体进行结合的方式来实现的。这个步骤允许这样的 文库成员进行富集，其中所述的文库成员能够进行恰当的表达以 及折叠并且可以被用来重新建立一个具有更强的功能性的文库 (参见Winter以及Tomlinson的美国专利No.6696245B2)。无论 是何种途径，任何的文库所具有的质量取决于被用来建立所述文 库的所述的分子生物学方法所具有的效率，并且在一般情况下能 够产生15％至45％的非功能性的文库成员。因此需要寻求新的以 及高效率的途径，所述的途径能够使非功能性基因的出现频率最 小化，并且能够使所述的文库所具有的功能性最大化，其中所述 的非功能性基因的出现归因于在所述分子克隆步骤的过程中被 导入的移码，使所述的文库所具有的功能性最大化是通过下述的 方式来实现的：捕获这样的互补决定区域(CDR)，所述的互补 决定区域(CDR)具有被正确的叠加至抗体骨架之中的高度倾向 并且具有期望的性质。此外，需要寻求这样的途径，所述的途径 能够允许从一种动物免疫个体中捕获所述的互补决定区域 (CDR)序列并且将其捕获至一种治疗学上可以使用的环境之 中，例如一种人类抗体骨架，其目的在于对高亲和性抗体的生成 过程进行改进。

发明概述

本发明提供了用以建立核酸序列文库的方法，所述的方法能 够将由稳定的骨架的筛选以及自然编码的互补决定区域(CDR) 或者氨基酸序列的插入所带来的益处进行结合，其中所述的氨基 酸序列能够实现一种互补决定区域(CDR)所具备的功能，所述 的互补决定区域(CDR)是在一种天然的功能性多肽例如一种抗 体中被选定的互补决定区域(CDR)。本发明能够重新获得长的 互补决定区域(CDR)或者氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列 能够实现一种互补决定区域(CDR)所具备的功能，所述的互补 决定区域(CDR)是非常难以使用合成的途径来进行编码的互补 决定区域(CDR)。本发明通过将稳定的骨架以及经过适当折叠 的互补决定区域(CDR)或者氨基酸序列进行结合的方式，能够 使存在于所述的文库之中的所述功能性抗体所占的比例最大化， 并且因此使得所述的筛选过程的表现最优化以及所述的被选定 的克隆物的质量最佳化，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互 补决定区域(CDR)所具备的功能。本发明提供了一种方法，所 述的方法能够从不同的种类中捕获那些经过了自然表达的互补 决定区域(CDR)并且将它们插入到一种人类的抗体骨架之中。 这允许对所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3)中的全部个 体进行使用，当与所述的人类个体进行比较时，所述的重链互补 决定区域3(CDR H3)中的全部个体之间在长度以及组成上存在 显著性的差异。本发明能够进行所述的人类抗体片段的建立，其 中所述的人类抗体片段的特征在于具有来自于其他种类的结构 性个体(structural repertoires)并且因此具备所述的尝试不同的 结构空间的能力。本发明所述的方法同样可以被用来以更高的成 功率进行互补决定区域(CDR)或者氨基酸序列的导入，其中所 述的互补决定区域(CDR)是合成性的来源的，所述的氨基酸序 列能够实现一种互补决定区域(CDR)所具备的功能，所述的更 高的成功率是相比较于能够向所述的编码序列中导入较少的引 发错误的移码现象的可供选择的方法而言的。使用本发明中所述 的方法建立起来的文库中含有高频率的功能性变体。依照这种方 法建立起来的变体文库可以被用来进行筛选以及过滤，其中所述 的筛选以及过滤可以通过任意已有描述的展示技术、筛选技术以 及过滤技术来进行。

在不同的研发阶段中，对来自于不同种类的所述的免疫个体 所进行的分析，或者对存在于同一个种类之中的所述的免疫个体 所进行的分析已经揭示出在所述的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)的组成以及长度特征方面存在着一些显著性的差异。 例如当与胎儿时期或者与新生儿进行比较时，在成人时期所述的 人类可变重链互补决定区域3(CDRH3)所具有的平均长度更长 (参见Schroeder Jr，HW等人于2001年在Blood《血液学》98： 2745-2751中发表的文章)。有趣的是，虽然在人类以及灵长类的 抗体生殖细胞系基因之间存在着很大程度的相似性，但是在生长 发育过程中所述的可变重链互补决定区域3(CDRH3)的长度所 发生的进化却存在不同(参见Link JM等人于2005年在Molecular  Immunol.《分子免疫学》42：943-955中发表的文章)。对在小鼠 以及人类中发现的所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3)序 列所进行的比较清楚的表示出：在小鼠中所述的平均长度明显更 短(参见Rock EP等人于1994年在J Exp Med《实验医学杂志》 179：323-328中发表的文章)。在骨髓中，在早期的B细胞形成 过程中，在小鼠体内所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3) 所具有的平均长度是增加的，而在人类体内其趋向于减小并且除 此之外所述的鼠科动物的可变重链互补决定区域3(CDR H3)个 体以及人类的可变重链互补决定区域3(CDR H3)个体所具有的 组成是存在差异的(参见Zemlin M等人于2003年在J Mol Biol. 《分子生物学杂志》334：733-749中发表的文章；Ivanov I等人 于2005年在J Imuunol《免疫学杂志》174：7773-7780中发表的 文章)。这些例子说明不同的种类能够表达不同范围的可变重链 互补决定区域3(CDR H3)个体(repertoires)，尽管事实是从整 体上来看它们被暴露在相似类别的抗体之下，并且对这样的观察 结果所具有的生物学显著性仍然需要进行进一步的研究。已经得 到证实的是，直接作用于小抗原的抗体结合位点所具有的形状不 同于那些直接作用于大的蛋白质的抗体结合位点所具有的形状， 其中所述的小抗原例如是半抗原或者是肽，并且所述的结合位点 所具有的形状受到所述的互补决定区域(CDR)所具有的长度以 及组成的制约(参见Collis A等人于2003年在J Mol Biol《分子 生物学杂志》325：337-354中发表的文章)。通过这些发现，我 们可以预期到的是，那些由不同的物种进行表达的所述的可变重 链互补决定区域3(CDR H3)个体具有不同的倾向性，从而针对 不同的靶向类别进行有效的反应。

在本发明中所提供的所述的方法以及抗体文库被设计成为 用来开发所述的各种不同的个体，其中所述的个体是由不同的种 类进行表达的，用以进行所述的治疗性抗体的建立。这些探索不 同的三维空间的个体能够允许进行所述的抗体的建立，其中所述 的抗体能够作用于多种不同的靶向类别以及表位。在本发明中对 用以从天然动物或者经过免疫的动物中建立文库的方法进行了 详细的描述，并且这些方法能够对所述的相应的个体进行捕获并 且进行所述抗体的建立。然而，从这样的文库中获得的抗体并不 是来自于人类的并且因此在不进行进一步的工程化处理的情况 下并不能够特别适合进行人类的治疗，其中所述的工程化处理例 如是人源化处理。因此需要寻求新的方法，用以对在所述的个体 中表达的所述的多样性进行利用并且将这种多样性用在治疗学 上可以使用的人类抗体的情形中，其中所述的个体是来自于不同 的种类之中的。

在本发明中提供的所述的方法以及抗体文库致力于解决在 上文中所描述的几个局限性并且对于所述的现有技术而言是一 种进步。首先，在本发明中提供的所述的方法能够将由稳定的骨 架的筛选以及自然编码的互补决定区域(CDR)的插入所带来的 益处进行结合，其中所述的互补决定区域(CDR)是在一种天然 的功能性多肽中被选定的互补决定区域(CDR)。其次，所述的 方法能够允许在一种抗体骨架之中将合成性的或者天然性的互 补决定区域(CDR)序列进行高效率的插入，所述的插入能够使 存在于所述的文库之中的所述的移码的数量发生显著性的最小 化并且因此提高其质量。最后，本发明允许使用一种新的方法来 利用天然存在的抗体的结构多样性，这是通过下述的方式来实现 的：从不同的种类中捕获那些经过自然表达的可变重链互补决定 区域3(CDR H3)个体并且将所述的个体插入到人类的抗体骨架 之中去。以一种生产性的方式来利用这样的具有结构上的多样性 的个体来进行所述抗体的建立因此成为可能，其中所述的抗体的 建立是用于进行人类治疗的。

在本发明中提供的所述方法能够建立这样的抗体，其中所述 的抗体中含有一个稳定的骨架以及经过了正确折叠的互补决定 区域(CDR)或者氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述 的互补决定区域(CDR)所具备的功能。所述的方法能够捕获到 存在于稳定的骨架之中的所述序列所具有的天然多样性。

在本发明提供的所述的方法中，用于骨架区域1，2以及3 (FR1，FR2以及FR3)的所述的生殖细胞系序列是选自于所期 望的生物体的，例如，是选自于所述的人类基因组的(参见，例 如，附图2以及6)。在这种方法的一种实施方式中，对选定的抗 体可变结构域进行修饰，所述的修饰是通过下述的方式来实现 的：导入一种填充序列，所述的填充序列将被用来作为经过多样 性处理的序列的整合位点。向存在于所述的免疫球蛋白编码区域 之外的所述序列中导入多样性，其中所述的导入是通过下述的方 式来实现的：在一个期望的位置上导入限制性酶识别位点，例如， IIs型限制性位点，其中所述的期望的位置例如是所述的可变重 链互补决定区域3(CDR H3)，所述的可变轻链互补决定区域3 (CDR L3)，所述的可变重链互补决定区域1(CDR H1)，所述 的可变轻链互补决定区域1(CDR L1)，所述的可变重链互补决 定区域2(CDR H2)或者所述的可变轻链互补决定区域2(CDR  L2)。虽然在本发明所提供的所述的例子中证实了存在于所述的 互补决定区域3(CDR3)区域内(存在于所述的可变重链区域和 /或可变轻链区域内)的多样性，应当被理解的是多样性可以在任 意期望的位置上实现，例如，但不局限于，所述的互补决定区域 1(CDR1)区域(存在于所述的可变重链区域和/或可变轻链区 域内)或者所述的互补决定区域2(CDR2)区域(存在于所述的 可变重链区域和/或可变轻链区域内)。可以利用包括IIs型限制 性位点的侧翼序列来建立经过多样性处理的DNA序列。在本发 明中提供的所述的方法中，通过所述的限制性酶来生成的所述的 粘性末端是具有兼容性的并且所述的阅读框仍然存在，因此允许 所述的经过多样性处理的DNA片段连结至一个受体骨架之内。

在本发明中提供的所述方法同样可以被用来进行氨基酸序 列的建立，其中在所述的氨基酸序列中编码有多样性的区域。例 如，在本发明提供的所述的方法中，所述的被编码的氨基酸所具 有的非多样性部分中的序列可以选自期望的生物体，例如，选自 所述的人类序列。所述的被编码的氨基酸序列所具有的一部分可 以被进行修饰，其中所述的修饰是通过下述的方式来实现的：导 入一个填充序列，所述的填充序列将被用来作为经过多样性处理 的序列的整合位点。通过在一个期望的位置上导入限制性酶的识 别位点的方式，可以在所述的期望位置处将多样性导入到所述的 序列之中，其中所述的限制性酶的识别位点例如是IIs型限制性 位点，所述的期望位置是存在于所述的被编码的氨基酸序列之内 的。可以利用包括IIs型限制性位点的侧翼序列来建立经过多样 性处理的DNA序列。在本发明中提供的所述的方法中，通过所 述的限制性酶来生成的所述的粘性末端是具有兼容性的并且所 述的阅读框仍然存在，因此允许所述的经过多样性处理的DNA 片段连结至一个受体骨架之内。

在本发明提供的所述方法之中，“受体骨架”是通过使用一 个DNA“填充片段”的方式来进行建立的，其中所述的DNA“填 充片段”中含有两个IIs型限制性酶位点，并且优选的所述的DNA “填充片段”是通过两个IIs型限制性酶位点来进行连接的(参 见，例如，附图6)。优选的，这两个IIs型限制性酶位点能够在 期望具有多样性的所述的位点的边界上对序列进行消化，其中所 述的期望的位置例如是所述的可变重链互补决定区域3(CDR  H3)，所述的可变轻链互补决定区域3(CDR L3)，所述的可变 重链互补决定区域1(CDR H1)，所述的可变轻链互补决定区域 1(CDR L1)，所述的可变重链互补决定区域2(CDR H2)或者 所述的可变轻链互补决定区域2(CDR L2)。当在本发明中被进 行使用时，所述的术语“受体骨架”指的是这样的一种核酸序列， 所述的核酸序列包括：编码所述的侧翼区域1(FR1)，侧翼区域 2(FR2)，侧翼区域3(FR3)以及侧翼区域4(FR4)区域的核 酸序列，编码两个互补决定区域(CDR)或者氨基酸序列的核酸 序列，其中所述的氨基酸序列能够实现这些互补决定区域(CDR) 所具备的功能，并且“填充片段”被用来作为所述的经过多样性 处理的核酸序列的整合位点。例如，当期望在所述的互补决定区 域3(CDR3)区域内(存在于所述的可变重链区域和/或所述的 可变轻链区域内)存在多样性时，在这样的实施方式中，所述的 受体骨架包括：编码所述的侧翼区域1(FR1)，侧翼区域2(FR2)， 侧翼区域3(FR3)以及侧翼区域4(FR4)区域的核酸序列，编 码所述的互补决定区域1(CDR1)或者互补决定区域2(CDR2) 区域的核酸序列，并且“填充片段”被用来作为所述的经过多样 性处理的核酸序列的整合位点。例如，当期望在所述的互补决定 区域2(CDR2)区域内(存在于所述的可变重链区域和/或所述 的可变轻链区域内)存在多样性时，在这样的实施方式中，所述 的受体骨架包括：编码所述的侧翼区域1(FR1)，侧翼区域2 (FR2)，侧翼区域3(FR3)以及侧翼区域4(FR4)区域的核酸 序列，编码所述的互补决定区域1(CDR1)或者互补决定区域3 (CDR3)区域的核酸序列，并且“填充片段”被用来作为所述 的经过多样性处理的核酸序列的整合位点。例如，当期望在所述 的互补决定区域1(CDR1)区域内(存在于所述的可变重链区域 和/或所述的可变轻链区域内)存在多样性时，在这样的实施方式 中，所述的受体骨架包括：编码所述的侧翼区域1(FR1)，侧翼 区域2(FR2)，侧翼区域3(FR3)以及侧翼区域4(FR4)区域 的核酸序列，编码所述的互补决定区域2(CDR2)或者互补决定 区域3(CDR3)区域的核酸序列，并且“填充片段”被用来作为 所述的经过多样性处理的核酸序列的整合位点。

所述的术语“填充片段”，“填充DNA片段”以及“填充序 列”或者是上述术语的任何合乎文法的变型可以在本发明中进行 交替互换的使用，用以指的是这样的一种核酸序列，所述的核酸 序列包括至少两个IIs型识别位点以及一个经过多样性处理的序 列。所述的受体骨架可以是一个可变的重链(VH)受体骨架或 者是一个可变的轻链(VL)受体骨架。对所述的受体骨架以及 在其中包含的所述的填充片段所进行的使用允许一种互补决定 区域(CDR)序列(天然的或者合成的)或者一种氨基酸序列在 所述的受体骨架之内进行整合，其中在所述的受体骨架中不需要 含有供体骨架核苷或者残基或者不需要为了整合而需要供体骨 架核苷或者残基，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区 域(CDR)所具备的功能。例如，对所述的受体骨架以及在其中 包含的所述的填充片段所进行的使用允许一种互补决定区域 (CDR)序列(天然的或者合成的)或者一种氨基酸序列在所述 的受体骨架之内进行整合，其中在所述的受体骨架中不需要含有 供体骨架核苷或者残基或者不需要为了整合而需要供体骨架核 苷或者残基，所述的互补决定区域(CDR)序列选自于：所述的 可变重链互补决定区域3(CDR H3)，所述的可变轻链互补决定 区域3(CDR L3)，所述的可变重链互补决定区域2(CDR H2)， 所述的可变轻链互补决定区域2(CDR L2)，所述的可变重链互 补决定区域1(CDR H1)以及所述的可变轻链互补决定区域1 (CDR L1)，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域 (CDR)所具备的功能，其中所述的互补决定区域(CDR)选自 所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3)，所述的可变轻链互 补决定区域3(CDR L3)，所述的可变重链互补决定区域2(CDR  H2)，所述的可变轻链互补决定区域2(CDR L2)，所述的可变 重链互补决定区域1(CDR H1)或者所述的可变轻链互补决定区 域1(CDR L1)。因此，通过整合作用，所述的填充片段被完全 去除，并且所述的受体蛋白所具有的编码区域以及所插入的蛋白 质片段(即，所述的互补决定区域(CDR))是完整无缺的。

在本发明中提供的所述的方法中使用到了这样的引物，所述 的引物被设计成为含有IIs型限制性酶的断裂位点，其中所述的 断裂位点的位置处于期望具有多样性的所述的位点的边界上，例 如是所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3)区域，所述的可 变轻链互补决定区域3(CDR L3)区域，所述的可变重链互补决 定区域2(CDR H2)区域，所述的可变轻链互补决定区域2(CDR L2)区域，所述的可变重链互补决定区域1(CDR H1)区域或 者所述的可变轻链互补决定区域1(CDR L1)区域。将随机的、 天然存在的互补决定区域(CDR)克隆(参见，例如，附图10) 或者合成性的互补决定区域(CDR)序列(参见，例如，实施例 6)或者氨基酸序列捕获至在本发明中所使用到的所述的受体骨 架之中，其中所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域 (CDR)所具备的功能。例如，当期望在所述的互补决定区域3 (CDR3)区域内(存在于所述的可变重链区域和/或所述的可变 轻链区域内)存在多样性时，在这样的实施方式中，可以将随机 的、天然存在的互补决定区域3(CDR3)克隆(参见，例如，附 图10)或者合成性的互补决定区域3(CDR3)序列(参见，例 如，实施例6)或者氨基酸序列捕获至在本发明中所使用到的所 述的受体骨架之中，其中所述的氨基酸序列能够实现所述的互补 决定区域3(CDR3)所具备的功能。例如，当期望在所述的互补 决定区域2(CDR2)区域内(存在于所述的可变重链区域和/或 所述的可变轻链区域内)存在多样性时，在这样的实施方式中， 可以将随机的、天然存在的互补决定区域2(CDR2)克隆(参见， 例如，在附图10中所示的方法)或者合成性的互补决定区域2 (CDR2)序列(参见，例如，在实施例6中所示的方法)或者 氨基酸序列捕获至在本发明中所使用到的所述的受体骨架之中， 其中所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域2(CDR2) 所具备的功能。例如，当期望在所述的互补决定区域1(CDR1) 区域内(存在于所述的可变重链区域和/或所述的可变轻链区域 内)存在多样性时，在这样的实施方式中，可以将随机的、天然 存在的互补决定区域1(CDR1)克隆(参见，例如，在附图10 中所示的方法)或者合成性的互补决定区域1(CDR1)序列(参 见，例如，在实施例6中所示的方法)或者氨基酸序列捕获至在 本发明中所使用到的所述的受体骨架之中，其中所述的氨基酸序 列能够实现所述的互补决定区域1(CDR1)所具备的功能。作为 一个例子，可以设计这样的寡核苷酸引物，所述的引物对一种 DNA序列所具有的侧翼区域具有特异性，其中所述的DNA序列 能够编码所述的免疫球蛋白的可变重链互补决定区域3(CDR  H3)，即，对所述的可变区域所具有的侧翼区域3(FR3)以及侧 翼区域4(FR4)具有特异性。同样可以设计这样的寡核苷酸引 物，所述的引物对编码其他区域的所述的DNA序列所具有的侧 翼区域具有特异性，其中所述的其他区域例如是，所述的可变轻 链互补决定区域3(CDR L3)，所述的可变重链互补决定区域1 (CDR H1)，所述的可变轻链互补决定区域1(CDR L1)，所述 的可变重链互补决定区域2(CDR H2)，或者所述的可变轻链互 补决定区域2(CDR L2)。这样的寡核苷酸在其5’末端上含有一 个IIs型限制性酶的位点，而其3’部分能够与所述的靶向DNA 序列进行匹配。

在一些实施方式中，所述的引物是一种核酸，所述的核酸选 自由序列识别号：120-254所组成的组中。

在本发明所提供的所述的方法中利用IIs型限制性酶将天然 的互补决定区域(CDR)序列插入到本发明所描述的所述的受体 骨架之中，其中所述的限制性酶例如是FokI，所述的天然互补决 定区域(CDR)序列例如是天然的可变重链互补决定区域3(CDR  H3)，所述的可变轻链互补决定区域3(CDR L3)，所述的可变 重链互补决定区域1(CDR H1)，所述的可变轻链互补决定区域 1(CDR L1)，所述的可变重链互补决定区域2(CDR H2)，或者 所述的可变轻链互补决定区域2(CDR L2)序列。在本发明所提 供的所述的方法中利用IIs型限制性酶将合成性的互补决定区域 (CDR)序列插入到本发明所描述的所述的受体骨架之中，其中 所述的限制性酶例如是FokI，所述的合成性的互补决定区域 (CDR)序列例如是合成性的可变重链互补决定区域3(CDR  H3)，所述的可变轻链互补决定区域3(CDR L3)，所述的可变 重链互补决定区域1(CDR H1)，所述的可变轻链互补决定区域 1(CDR L1)，所述的可变重链互补决定区域2(CDR H2)，或者 所述的可变轻链互补决定区域2(CDR L2)序列。在本发明所提 供的所述的方法中利用IIs型限制性酶将氨基酸序列插入到本发 明所描述的所述的受体骨架之中，其中所述的限制性酶例如是 FokI，所述的氨基酸序列能够实现所述的天然的或者合成的可变 重链互补决定区域3(CDR H3)、可变轻链互补决定区域3(CDR  L3)、可变重链互补决定区域1(CDR H1)、可变轻链互补决定 区域1(CDR L1)、可变重链互补决定区域2(CDR H2)、或者 可变轻链互补决定区域2(CDR L2)区域所具备的功能。所述的 IIs型限制性酶是能够在它们的识别序列外侧进行切断使其存在 于一边的酶类。这样的酶类具有适中的大小，通常情况下具有 400-650个氨基酸的长度，并且它们能够对连续的序列以及不对 称的序列进行识别。适合的IIs型限制性酶，同样也被称之为IIs 型限制性内切酶，以及它们所识别的序列，在例如Szybalski等 人(于1991年)在Gene《基因》第100卷：13-26中发表的文 章“Class-IIS Restriction Enzymes《IIS型限制性酶》”中进行了 描述，上述文献中的内容作为整体被引入到本发明中作为参考。

初始文库包括一个重链可变(VH)的受体骨架以及一个固定 的轻链可变(VL)的序列(同样被称之为一个“虚拟的轻链可 变(VL)”序列)，或者包括一个轻链可变(VL)的受体骨架以 及一个固定的重链可变(VH)的序列(同样被称之为一个“虚 拟的重链可变(VH)”序列)。因此，初始文库仅仅能够在所述 的重链或者轻链之一上表现出多样性。次级文库是通过将一个重 链可变(VH)的受体骨架与一个轻链可变(VL)的受体骨架连 结在一起的方式来进行建立的(参见，例如，实施例7)。次级文 库同时在所述的重链以及轻链之上具有多样性。

本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一个核酸能 够编码一个人类免疫球蛋白重链可变结构域，在所述的人类免疫 球蛋白重链可变结构域中含有大量的重链互补决定区域3(CDR  H3)，这些重链互补决定区域3(CDR H3)是从来自于一种非人 类的物种中的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。 在一些实施方式中，所述的方法包括下述的步骤：(a)提供大量 的受体骨架核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不同的 人类免疫球蛋白重链可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中含 有第一个骨架区域(FR1)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨 架区域(FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架 区域1(FR1)与骨架区域2(FR2)区域之间被一个互补决定区 域1(CDR1)进行了间隔，所述的骨架区域2(FR2)与骨架区 域3(FR3)区域之间被一个互补决定区域2(CDR2)进行了间 隔，并且所述的骨架结构3(FR3)以及骨架结构4(FR4)区域 之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列 中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶 识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔；(b)提供大量 的经过多样性处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码重 链互补决定区域3(CDR H3)序列，所述的重链互补决定区域3 (CDR H3)序列是从一种非人类的物种的免疫球蛋白个体中分 离出来的，其中所述的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每 一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点； (c)利用一种IIs型限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一 个进行消化，其中所述的核酸序列能够编码所述的可变重链互补 决定区域3(CDR H3)区域，并且所述的限制性酶能够与步骤(b) 中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs 型限制性酶对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的 填充核酸序列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a) 中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合；以及(d)将所述的 经过消化的核酸序列或者所述的来自于步骤(c)中的氨基酸序 列连结至步骤(c)中所述的经过消化的受体骨架之中，其中所 述的核酸序列能够编码所述的可变重链互补决定区域3(CDR  H3)区域，这样一来可以利用所述的核酸序列或者所述的氨基酸 序列对所述的骨架区域3(FR3)以及骨架区域4(FR4)区域之 间进行间隔，其中所述的核酸序列能够编码所述的可变重链互补 决定区域3(CDR H3)区域，所述的氨基酸序列能够实现一种互 补决定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且一个完整的免疫 球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中所述的编码序 列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限制性酶识别位 点。

在一些实施方式中，上文中所列出的步骤(b)是通过下述 的方式来实现的：使用寡核苷酸引物对来自于一种非人类的物种 的所述可变重链互补决定区域3(CDR H3)序列进行扩增，其中 在所述的寡核苷酸引物中含有一个IIs型限制性位点。在一些实 施方式中，上文中所列出的步骤(b)是通过下述的方式来实现 的：使用寡核苷酸引物对来自于一种非人类的物种的所述可变重 链互补决定区域3(CDR H3)序列进行扩增，其中在所述的寡核 苷酸引物中含有一个Fok I IIs型限制性位点。在一些实施方式中， 所述的非人类的物种是非人类的灵长动物类，啮齿动物类，犬科 动物，猫科动物，羊类，山羊类，牛类，马类，或者猪类。

本发明提供了用以制备一种核酸文库的方法，其中每一个核 酸能够编码一个免疫球蛋白的可变结构域，所述的方法是通过下 述的步骤来实现的：(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其中所 述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域，每一 个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FR1)，第二个骨架 区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)， 其中所述的骨架区域1(FR1)与骨架区域2(FR2)区域之间被 一个互补决定区域1(CDR1)进行了间隔，所述的骨架区域2 (FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个互补决定区域2 (CDR2)进行了间隔，并且所述的骨架结构3(FR3)以及骨架 结构4(FR4)区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中 所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点， 所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进行 了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中所述 的核酸序列能够编码互补决定区域3(CDR3)区域或者编码氨基 酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域3 (CDR3)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处 理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型 限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs型限制性酶对所述的大量 的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化，其中 所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3(CDR3)区域， 所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域3(CDR3)区域 所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型 限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步 骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进 行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限 制性酶识别位点进行结合；以及(d)将所述的经过消化的核酸 序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化 的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定 区域3(CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决 定区域3(CDR3)所具备的功能，这样一来可以利用所述的核酸 序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域3(FR3)以及骨 架区域4(FR4)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够 编码所述的互补决定区域3(CDR3)区域，所述的氨基酸序列能 够实现一种互补决定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且一 个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中 所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限 制性酶识别位点。

在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs 型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别。在 一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制 性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。例如，所 述的IIs型限制性酶识别位点是FokI识别位点，BsaI识别位点， 和/或BsmBI识别位点。

在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种 人类基因序列的。例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基 因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些 实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自：重链可变序列 1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69(VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列3-30(VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3-23(VH3-23)，以及重链可变序列 5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人 类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因 序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自：κ轻 链可变序列1-33(VK1-33)，κ轻链可变序列1-39(VK1-39)， κ轻链可变序列3-11(VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)， 以及κ轻链可变序列3-20(VK3-20)。在一些实施方式中，所述 的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于 人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变 基因序列选自：λ轻链可变序列1-44(VL1-44)以及λ轻链可变 序列1-51(VL1-51)。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域3(CDR3)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括天然存在的序列以及来自于经过免疫的动 物的序列。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包 括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然 存在的互补决定区域3(CDR3)序列，来自于人类的天然存在的 免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋 白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的 环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具 有多样性的多肽。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域3(CDR3)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的 免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类 中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫 原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为 被暴露在一种特定的抗原之下。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在另外一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核 酸能够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互 补决定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且所述的大量的经 过多样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至 少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻 链受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，在本发明中所提供的所述方法中包括所 述另外的步骤(e)：在一个宿主细胞内对步骤(d)中所述的表 达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的受体骨架序列 进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养。例如，所述的宿 主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，所述的表达载 体是一种噬菌体载体。例如，所述的噬菌体载体是pNDS1。

本发明同样提供了用以制备一种核酸文库的方法，其中每一 个核酸能够编码一个免疫球蛋白的可变结构域，所述的方法是通 过下述的步骤来实现的：(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其 中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域， 每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FR1)，第二个 骨架区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以及第四个骨架区 域(FR4)，其中所述的骨架区域1(FR1)与骨架区域2(FR2) 区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸 序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制 性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔；所述的骨 架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个互补决定 区域2(CDR2)进行了间隔，并且所述的骨架结构3(FR3)以 及骨架结构4(FR4)区域之间被一个互补决定区域3(CDR3) 进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中 所述的核酸序列能够编码互补决定区域1(CDR1)区域或者编码 氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域1 (CDR1)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处 理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型 限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs型限制性酶对所述的大量 的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化，其中 所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域1(CDR1)区域， 所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域1(CDR1)区域 所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型 限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步 骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进 行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限 制性酶识别位点进行结合；以及(d)将所述的经过消化的核酸 序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化 的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定 区域1(CDR1)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决 定区域1(CDR1)所具备的功能，这样一来可以利用所述的核酸 序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域1(FR1)以及骨 架区域2(FR2)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够 编码所述的互补决定区域1(CDR1)区域，所述的氨基酸序列能 够实现一种互补决定区域1(CDR1)区域所具备的功能，并且一 个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中 所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限 制性酶识别位点。

在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs 型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别。在 一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制 性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。例如，所 述的IIs型限制性酶识别位点是FokI识别位点，BsaI识别位点， 和/或BsmBI识别位点。

在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种 人类基因序列的。例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基 因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些 实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自：重链可变序列 1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69(VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列3-30(VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3-23(VH3-23)，以及重链可变序列 5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人 类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因 序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自：κ轻 链可变序列1-33(VK1-33)，κ轻链可变序列1-39(VK1-39)， κ轻链可变序列3-11(VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)， 以及κ轻链可变序列3-20(VK3-20)。在一些实施方式中，所述 的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于 人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变 基因序列选自：λ轻链可变序列1-44(VL1-44)以及λ轻链可变 序列1-51(VL1-51)。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域1(CDR1)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括天然存在的序列以及来自于经过免疫的动 物的序列。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包 括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然 存在的互补决定区域1(CDR1)序列，来自于人类的天然存在的 免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋 白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的 环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具 有多样性的多肽。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域1(CDR1)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的 免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类 中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫 原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为 被暴露在一种特定的抗原之下。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域1(CDR1)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在另外一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核 酸能够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互 补决定区域1(CDR1)区域所具备的功能，并且所述的大量的经 过多样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至 少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻 链受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，在本发明中所提供的所述方法中包括所 述另外的步骤：(e)将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种 表达载体之中，其中所述的核酸能够编码免疫球蛋白的可变结构 域，以及(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的表达载体 进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白可变结构 域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免 疫球蛋白可变结构域是由所述的文库来进行编码的。例如，所述 的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，所述的表 达载体是一种噬菌体载体。例如，所述的噬菌体载体是pNDS1。

本发明同样提供了用以制备一种核酸文库的方法，其中每一 个核酸能够编码一个免疫球蛋白的可变结构域，所述的方法是通 过下述的步骤来实现的：(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其 中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域， 每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FR1)，第二个 骨架区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以及第四个骨架区 域(FR4)，其中所述的骨架区域1(FR1)与骨架区域2(FR2) 区域之间被一个互补决定区域1(CDR1)区域进行了间隔；所述 的骨架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个填充 核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个 IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被 一个随机的核酸序列进行了间隔；并且所述的骨架结构3(FR3) 以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个互补决定区域3(CDR3) 进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中 所述的核酸序列能够编码互补决定区域2(CDR2)区域或者编码 氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域2 (CDR2)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处 理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型 限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs型限制性酶对所述的大量 的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化，其中 所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域2(CDR2)区域， 所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域2(CDR2)区域 所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型 限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步 骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进 行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限 制性酶识别位点进行结合；以及(d)将所述的经过消化的核酸 序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化 的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定 区域2(CDR2)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决 定区域2(CDR2)所具备的功能，这样一来可以利用所述的核酸 序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域2(FR2)以及骨 架区域3(FR3)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够 编码所述的互补决定区域2(CDR2)区域，所述的氨基酸序列能 够实现一种互补决定区域2(CDR2)区域所具备的功能，并且一 个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中 所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限 制性酶识别位点。

在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs 型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别。在 一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制 性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。例如，所 述的IIs型限制性酶识别位点是FokI识别位点，BsaI识别位点， 和/或BsmBI识别位点。

在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种 人类基因序列的。例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基 因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些 实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自：重链可变序列 1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69(VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列3-30(VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3-23(VH3-23)，以及重链可变序列 5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人 类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因 序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自：κ轻 链可变序列1-33(VK1-33)，κ轻链可变序列1-39(VK1-39)， κ轻链可变序列3-11(VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)， 以及κ轻链可变序列3-20(VK3-20)。在一些实施方式中，所述 的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于 人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变 基因序列选自：λ轻链可变序列1-44(VL1-44)以及λ轻链可变 序列1-51(VL1-51)。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域2(CDR2)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括天然存在的序列以及来自于经过免疫的动 物的序列。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包 括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然 存在的互补决定区域2(CDR2)序列，来自于人类的天然存在的 免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋 白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的 环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具 有多样性的多肽。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域2(CDR2)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的 免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类 中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫 原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为 被暴露在一种特定的抗原之下。

在另外一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核 酸能够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互 补决定区域2(CDR2)区域所具备的功能，并且所述的大量的经 过多样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至 少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻 链受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，在本发明中所提供的所述方法中包括所 述另外的步骤：(e)将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种 表达载体之中，其中所述的核酸能够编码免疫球蛋白的可变结构 域，以及(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的表达载体 进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白可变结构 域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免 疫球蛋白可变结构域是由所述的文库来进行编码的。例如，所述 的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，所述的表 达载体是一种噬菌体载体。例如，所述的噬菌体载体是pNDS1。

本发明同样提供了用以制备一种靶向特异性抗体、所述抗体 的抗体可变区域或者所述抗体的一部分的方法，所述的方法是通 过下述的步骤来实现的：(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其 中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域， 每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FR1)，第二个 骨架区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以及第四个骨架区 域(FR4)，其中所述的骨架区域1(FR1)与骨架区域2(FR2) 区域之间被一个互补决定区域1(CDR1)区域进行了间隔；所述 的骨架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个互补 决定区域2(CDR2)区域进行了间隔；并且所述的骨架结构3 (FR3)以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个填充核酸序列进 行了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制 性酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的 核酸序列进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序 列，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域3(CDR3)区域 或者编码氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决 定区域3(CDR3)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多 样性处理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一 个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs型限制性酶对所述 的大量的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消 化，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3(CDR3) 区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域3(CDR3) 区域所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的 IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶 对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序 列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs 型限制性酶识别位点进行结合；(d)将所述的经过消化的核酸序 列或者所述的氨基酸序列克隆至一种表达载体之中，其中所述的 核酸序列能够编码所述的互补决定区域3(CDR3)区域，所述的 氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域3(CDR3)区域所具备 的功能，并且将步骤(c)中所述的经过消化的核酸序列或者所 述的氨基酸序列连结至所述的受体骨架之中，其中所述的核酸序 列能够编码所述的互补决定区域3(CDR3)区域，所述的氨基酸 序列能够实现所述的互补决定区域3(CDR3)所具备的功能，这 样一来可以利用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述 的骨架区域3(FR3)以及骨架区域4(FR4)区域之间进行间隔， 其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3(CDR3)区 域，所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域3(CDR3)区 域所具备的功能，并且一个完整的免疫球蛋白可变基因编码序列 被得以重新建立；(e)在一个宿主细胞内对步骤(d)中所述的 表达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的受体骨架序 列进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养；(f)利用一种 靶向抗原与所述的宿主细胞进行接触；以及(g)确定哪些被表 达的受体骨架序列能够与所述的靶向抗原进行结合。

在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs 型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别。在 一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制 性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。例如，所 述的IIs型限制性酶识别位点是FokI识别位点，BsaI识别位点， 和/或BsmBI识别位点。

在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种 人类基因序列的。例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基 因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些 实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自：重链可变序列 1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69(VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列3-30(VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3-23(VH3-23)，以及重链可变序列 5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人 类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因 序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自：κ轻 链可变序列1-33(VK1-33)，κ轻链可变序列1-39(VK1-39)， κ轻链可变序列3-11(VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)， 以及κ轻链可变序列3-20(VK3-20)。在一些实施方式中，所述 的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于 人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变 基因序列选自：λ轻链可变序列1-44(VL1-44)以及λ轻链可变 序列1-51(VL1-51)。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域3(CDR3)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括天然存在的序列以及来自于经过免疫的动 物的序列。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包 括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然 存在的互补决定区域3(CDR3)序列，来自于人类的天然存在的 免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋 白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的 环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具 有多样性的多肽。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域3(CDR3)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的 免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类 中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫 原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为 被暴露在一种特定的抗原之下。

在另外一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核 酸能够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互 补决定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且所述的大量的经 过多样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至 少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻 链受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。例 如，所述的噬菌体载体是pNDS1。在一些实施方式中，所述的宿 主细胞是大肠杆菌(E.coli)。

在一些实施方式中，所述的方法包括下述的另外的步骤：(i) 对所述的免疫球蛋白可变结构域的编码序列进行测序，其中所述 的编码序列能够与所述的靶向抗原进行结合。

本发明同样提供了用以制备一种靶向特异性抗体、所述抗体 的抗体可变区域或者所述抗体的一部分的方法，所述的方法是通 过下述的步骤来实现的：(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其 中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域， 每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FR1)，第二个 骨架区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以及第四个骨架区 域(FR4)，其中所述的骨架区域1(FR1)与骨架区域2(FR2) 区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸 序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制 性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔；所述的骨 架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个互补决定 区域2(CDR2)区域进行了间隔；并且所述的骨架结构3(FR3) 以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个互补决定区域3(CDR3) 进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中 所述的核酸序列能够编码互补决定区域1(CDR1)区域或者编码 氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域1 (CDR1)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处 理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型 限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs型限制性酶对所述的大量 的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化，其中 所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域1(CDR1)区域， 所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域1(CDR1)区域 所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型 限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步 骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进 行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限 制性酶识别位点进行结合；(d)将所述的经过消化的核酸序列或 者所述的氨基酸序列克隆至一种表达载体之中，其中所述的核酸 序列能够编码所述的互补决定区域1(CDR1)区域，所述的氨基 酸序列能够实现所述的互补决定区域1(CDR1)区域所具备的功 能，并且将步骤(c)中所述的经过消化的核酸序列或者所述的 氨基酸序列连结至所述的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能 够编码所述的互补决定区域1(CDR1)区域，所述的氨基酸序列 能够实现所述的互补决定区域1(CDR1)所具备的功能，这样一 来可以利用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨 架区域1(FR1)以及骨架区域2(FR2)区域之间进行间隔，其 中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域1(CDR1)区域， 所述的氨基酸序列能够实现一种互补决定区域1(CDR1)区域所 具备的功能，并且一个完整的免疫球蛋白可变基因编码序列被得 以重新建立；(e)在一个宿主细胞内对步骤(d)中所述的表达 载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的受体骨架序列进 行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养；(f)利用一种靶向 抗原与所述的宿主细胞进行接触；以及(g)确定哪些被表达的 受体骨架序列能够与所述的靶向抗原进行结合。

在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs 型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别。在 一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制 性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。例如，所 述的IIs型限制性酶识别位点是FokI识别位点，BsaI识别位点， 和/或BsmBI识别位点。

在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种 人类基因序列的。例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基 因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些 实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自：重链可变序列 1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69(VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列3-30(VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3-23(VH3-23)，以及重链可变序列 5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人 类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因 序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自：κ轻 链可变序列1-33(VK1-33)，κ轻链可变序列1-39(VK1-39)， κ轻链可变序列3-11(VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)， 以及κ轻链可变序列3-20(VK3-20)。在一些实施方式中，所述 的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于 人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变 基因序列选自：λ轻链可变序列1-44(VL1-44)以及λ轻链可变 序列1-51(VL1-51)。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域1(CDR1)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括天然存在的序列以及来自于经过免疫的动 物的序列。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包 括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然 存在的互补决定区域1(CDR1)序列，来自于人类的天然存在的 免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋 白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的 环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具 有多样性的多肽。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域1(CDR1)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的 免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类 中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫 原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为 被暴露在一种特定的抗原之下。

在另外一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核 酸能够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互 补决定区域1(CDR1)区域所具备的功能，并且所述的大量的经 过多样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至 少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻 链受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。例 如，所述的噬菌体载体是pNDS1。在一些实施方式中，所述的宿 主细胞是大肠杆菌(E.coli)。

在一些实施方式中，所述的方法包括下述的另外的步骤：(i) 对所述的免疫球蛋白可变结构域的编码序列进行测序，其中所述 的编码序列能够与所述的靶向抗原进行结合。

本发明提供了用以制备一种靶向特异性抗体、所述抗体的抗 体可变区域或者所述抗体的一部分的方法，所述的方法是通过下 述的步骤来实现的：(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其中所 述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域，每一 个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FR1)，第二个骨架 区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)， 其中所述的骨架区域1(FR1)与骨架区域2(FR2)区域之间被 互补决定区域1(CDR1)区域进行了间隔；所述的骨架区域2 (FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个填充核酸序列进行 了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性 酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的核 酸序列进行了间隔；并且所述的骨架结构3(FR3)以及骨架结 构4(FR4)区域之间被一个互补决定区域3(CDR3)进行了间 隔：(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中所述的核 酸序列能够编码互补决定区域2(CDR2)区域或者编码氨基酸序 列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域2(CDR2) 区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处理的核酸序 列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型限制性酶识 别位点；(c)利用一种IIs型限制性酶对所述的大量的核酸序列 中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化，其中所述的核酸 序列能够编码所述的互补决定区域2(CDR2)区域，所述的氨基 酸序列能够实现所述的互补决定区域2(CDR2)区域所具备的功 能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识 别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步骤(a)中所 述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进行消化，其中 所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限制性酶识别位 点进行结合；(d)将步骤(c)中所述的经过消化的核酸序列或 者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化的受体 骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域2 (CDR2)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区 域2(CDR2)区域所具备的功能，这样一来可以利用所述的核酸 序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域2(FR2)以及骨 架区域3(FR3)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够 编码所述的互补决定区域2(CDR2)区域，所述的氨基酸序列能 够实现一种互补决定区域2(CDR2)区域所具备的功能，并且一 个完整的免疫球蛋白可变基因编码序列被得以重新建立，其中所 述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限制 性酶识别位点；(e)将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种 表达载体之中，其中所述的核酸序列能够编码免疫球蛋白的可变 结构域；(f)在一个宿主细胞内对步骤(d)中所述的表达载体 进行转化并且在足以能够使所述的免疫球蛋白可变结构域进行 表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免疫球蛋 白可变结构域是由所述的文库来进行编码的；(g)利用一种靶向 抗原与步骤(f)中所述的大量的免疫球蛋白可变结构域进行接 触；以及(h)确定哪些被表达的免疫球蛋白可变结构域编码序 列能够与所述的靶向抗原进行结合。

在一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs 型限制性酶识别位点可以被相同的IIs型限制性酶进行识别。在 一些实施方式中，步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs型限制 性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。例如，所 述的IIs型限制性酶识别位点是FokI识别位点，BsaI识别位点， 和/或BsmBI识别位点。

在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种 人类基因序列的。例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基 因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些 实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自：重链可变序列 1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69(VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列3-30(VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3-23(VH3-23)，以及重链可变序列 5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人 类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因 序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自：κ轻 链可变序列1-33(VK1-33)，κ轻链可变序列1-39(VK1-39)， κ轻链可变序列3-11(VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)， 以及κ轻链可变序列3-20(VK3-20)。在一些实施方式中，所述 的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于 人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变 基因序列选自：λ轻链可变序列1-44(VL1-44)以及λ轻链可变 序列1-51(VL1-51)。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域2(CDR2)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括天然存在的序列以及来自于经过免疫的动 物的序列。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包 括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然 存在的互补决定区域2(CDR2)序列，来自于人类的天然存在的 免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋 白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的 环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具 有多样性的多肽。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域2(CDR2)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的 免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类 中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫 原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为 被暴露在一种特定的抗原之下。

在一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域2(CDR2)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在另外一种实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核 酸能够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互 补决定区域2(CDR2)区域所具备的功能，并且所述的大量的经 过多样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至 少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻 链受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。 在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。例如， 所述的噬菌体载体是pNDS1。

在一些实施方式中，所述的方法包括下述的另外的步骤：(i) 对所述的免疫球蛋白可变结构域的编码序列进行测序，其中所述 的编码序列能够与所述的靶向抗原进行结合。

本发明同样提供了用以制备一种核酸文库的方法，其中每一 个核酸能够编码一个免疫球蛋白的可变结构域。这样的方法包括 下述的步骤：(a)提供大量的免疫球蛋白(Ig)受体骨架核酸序 列，在所述的核酸序列中导入一种多样性来源，其中所述的导入 是在单一的互补决定区域(CDR)内进行的，所述的互补决定区 域(CDR)选自由下述的互补决定区域(CDR)所组成的组中： 互补决定区域1(CDR1)，互补决定区域2(CDR2)，以及互补 决定区域3(CDR3)，其中所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架序 列包括一个填充核酸序列，所述的填充核酸序列中包括至少两个 IIs型限制性酶识别位点，并且其中所述的多样性来源是一种互 补决定区域(CDR)，所述的互补决定区域(CDR)选自含有IIs 型限制性酶识别位点的天然存在的互补决定区域(CDR)序列， 其中所述的限制性酶识别位点存在于所述的互补决定区域 (CDR)区域之外，(b)向每一个免疫球蛋白(Ig)受体骨架之 内导入所述的多样性来源，其中所述的导入是通过利用一种IIs 型限制性酶对所述的多样性来源以及所述的免疫球蛋白(Ig)受 体骨架同时进行消化的方式来实现的；以及(c)将所述的经过 消化的多样性来源连结至所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架之中， 这样一来一个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重 新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所 述的IIs型限制性酶识别位点。

所述的天然存在的互补决定区域(CDR)区域序列相对于它 们的野生型而言在本质上是未发生改变的，即，天然状态。这些 天然存在的互补决定区域(CDR)区域序列存在于氨基酸序列的 侧翼，其中所述的氨基酸序列已经被进行了工程化处理(或者被 进行了人工处理)，从而含有两个IIs型限制性酶识别位点，其中 在所述的天然存在的互补决定区域(CDR)区域序列的每一侧上 存在一个IIs型限制性酶识别位点。所述的IIS型限制性酶识别位 点存在于所述的互补决定区域(CDR)编码区域之外。在所述的 互补决定区域(CDR)编码区域的边缘处上的所述的互补决定区 域(CDR)区域序列没有发生改变——所述的限制性酶能够在到 达所述的互补决定区域(CDR)编码区域的边缘的区域上进行识 别以及接合，但是不能够在所述的互补决定区域(CDR)编码区 域之内进行接合。

在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被 相同的IIs型限制性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点 是存在于所述的填充核酸序列之内并且存在于所述的天然存在 的互补决定区域(CDR)序列的侧翼上的。在一些实施方式中， 所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行 识别，其中所述的限制性酶识别位点是存在于所述的填充核酸序 列之内并且存在于所述的天然存在的互补决定区域(CDR)序列 的侧翼上的。例如，所述的IIs型限制性酶识别位点是FokI识别 位点，BsaI识别位点，和/或BsmBI识别位点。

在一些实施方式中，所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架核酸 序列是来自于一种人类基因序列的。例如，所述的人类序列是一 种人类重链可变基因序列或者是一种来自于人类重链可变基因 序列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列 选自：重链可变序列1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69(VH1-69)， 重链可变序列1-18(VH1-18)，重链可变序列3-30(VH3-30)， 重链可变序列3-48(VH3-48)，重链可变序列3-23(VH3-23)， 以及重链可变序列5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的 人类序列是一种人类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人 类κ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基 因序列选自：κ轻链可变序列1-33(VK1-33)，κ轻链可变序列 1-39(VK1-39)，κ轻链可变序列3-11(VK3-11)，κ轻链可变 序列3-15(VK3-15)，以及κ轻链可变序列3-20(VK3-20)。在 一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序 列或者是一种来自于人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所 述的人类λ轻链可变基因序列选自：λ轻链可变序列1-44 (VL1-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。

在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸包括下述 的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然存在的 互补决定区域3(CDR3)序列，来自于人类的天然存在的免疫球 蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig) 序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域 内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性 的多肽。

在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸能够编码 互补决定区域3(CDR3)区域，并且所述的大量的天然存在的核 酸包括这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天 然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一 种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物 已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。

在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸包括下述 的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然存在的 互补决定区域1(CDR1)序列，来自于人类的天然存在的免疫球 蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig) 序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域 内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性 的多肽。

在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸能够编码 互补决定区域1(CDR1)区域，并且所述的大量的天然存在的核 酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的免疫球蛋白序 列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋 白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者 是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为被暴露在一种 特定的抗原之下。

在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸包括下述 的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然存在的 互补决定区域2(CDR2)序列，来自于人类的天然存在的免疫球 蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig) 序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域 内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性 的多肽。

在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸能够编码 互补决定区域2(CDR2)区域，并且所述的大量的天然存在的核 酸包括这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天 然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一 种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物 已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。

在一些实施方式中，所述的大量的免疫球蛋白(Ig)受体骨 架核酸序列包括至少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以 及至少一种可变轻链(VL)受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，在本发明提供的所述的方法中包括下述 的另外的步骤：(e)将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种 表达载体之中，其中所述的核酸序列能够编码免疫球蛋白的可变 结构域，以及(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的表达 载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白可变 结构域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述 的免疫球蛋白可变结构域是由所述的文库来进行编码的。例如， 所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，所述 的表达载体是一种噬菌体载体。例如，所述的噬菌体载体是 pNDS1。

本发明同样提供了用以制备一种核酸文库的方法，其中每一 个核酸能够编码一个免疫球蛋白的可变结构域。这样的方法包括 下述的步骤：(a)提供大量的免疫球蛋白(Ig)受体骨架核酸序 列，在所述的核酸序列中导入一种多样性来源，其中所述的导入 是在单一的互补决定区域(CDR)内进行的，所述的互补决定区 域(CDR)选自由下述的互补决定区域(CDR)所组成的组中： 互补决定区域1(CDR1)，互补决定区域2(CDR2)，以及互补 决定区域3(CDR3)，其中所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架序 列包括一个填充核酸序列，所述的填充核酸序列中包括至少两个 IIs型限制性酶识别位点，并且其中所述的多样性来源是一种互 补决定区域(CDR)，所述的互补决定区域(CDR)选自含有IIs 型限制性酶识别位点的通过合成方法制备得到的互补决定区域 (CDR)序列，其中所述的限制性酶识别位点存在于所述的互补 决定区域(CDR)区域之外，(b)向每一个免疫球蛋白(Ig)受 体骨架之内导入所述的多样性来源，其中所述的导入是通过利用 一种IIs型限制性酶对所述的多样性来源以及所述的免疫球蛋白 (Ig)受体骨架同时进行消化的方式来实现的；以及(c)将所述 的经过消化的多样性来源连结至所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨 架之中，这样一来一个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被 得以重新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b) 中所述的IIs型限制性酶识别位点。

在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被 相同的IIs型限制性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点 是存在于所述的填充核酸序列之内并且存在于所述的通过合成 方法制备得到的互补决定区域(CDR)序列之内的。在一些实施 方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制 性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点是存在于所述的填 充核酸序列之内并且存在于所述的通过合成方法制备得到的互 补决定区域(CDR)序列之内的。例如，所述的IIs型限制性酶 识别位点是FokI识别位点，BsaI识别位点，和/或BsmBI识别位 点。

在一些实施方式中，所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架核酸 序列是来自于一种人类基因序列的。例如，所述的人类序列是一 种人类重链可变基因序列或者是一种来自于人类重链可变基因 序列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列 选自：重链可变序列1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69(VH1-69)， 重链可变序列1-18(VH1-18)，重链可变序列3-30(VH3-30)， 重链可变序列3-48(VH3-48)，重链可变序列3-23(VH3-23)， 以及重链可变序列5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的 人类序列是一种人类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人 类κ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基 因序列选自：κ轻链可变序列1-33(VK1-33)，κ轻链可变序列 1-39(VK1-39)，κ轻链可变序列3-11(VK3-11)，κ轻链可变 序列3-15(VK3-15)，以及κ轻链可变序列3-20(VK3-20)。在 一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序 列或者是一种来自于人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所 述的人类λ轻链可变基因序列选自：λ轻链可变序列1-44 (VL1-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域1(CDR1)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域2(CDR2)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的免疫球蛋白(Ig)受体骨 架核酸序列包括至少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以 及至少一种可变轻链受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，在本发明提供的所述的方法中包括下述 的另外的步骤：(e)将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种 表达载体之中，其中所述的核酸序列能够编码免疫球蛋白的可变 结构域，以及(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的表达 载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白可变 结构域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述 的免疫球蛋白可变结构域是由所述的文库来进行编码的。例如， 所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，所述 的表达载体是一种噬菌体载体。例如，所述的噬菌体载体是 pNDS1。

本发明同样提供了用以制备一种免疫球蛋白多肽的方法。这 样的方法包括下述的步骤：(a)提供大量的免疫球蛋白(Ig)受 体骨架核酸序列，在所述的核酸序列中导入一种多样性来源，其 中所述的导入是在单一的互补决定区域(CDR)内进行的，所述 的互补决定区域(CDR)选自由下述的互补决定区域(CDR)所 组成的组中：互补决定区域1(CDR1)，互补决定区域2(CDR2)， 以及互补决定区域3(CDR3)，其中所述的免疫球蛋白(Ig)受 体骨架序列包括一个填充核酸序列，所述的填充核酸序列中包括 至少两个IIs型限制性酶识别位点，并且其中所述的多样性来源 是一种互补决定区域(CDR)，所述的互补决定区域(CDR)选 自含有IIs型限制性酶识别位点的天然存在的互补决定区域 (CDR)序列，其中所述的限制性酶识别位点存在于所述的互补 决定区域(CDR)区域之外，(b)向每一个免疫球蛋白(Ig)受 体骨架之内导入所述的多样性来源，其中所述的导入是通过利用 一种IIs型限制性酶对所述的多样性来源以及所述的免疫球蛋白 (Ig)受体骨架同时进行消化的方式来实现的；(c)将所述的经 过消化的多样性来源连结至所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架之 中，这样一来一个完整的免疫球蛋白可变基因编码序列被得以重 新建立；以及(d)将来自于步骤(c)中的所述的完整的免疫球 蛋白可变基因编码序列克隆至一个表达载体之中；以及(e)在 一个宿主细胞内对步骤(d)中所述的表达载体进行转化并且在 足以能够使所述的完整的免疫球蛋白基因编码序列进行表达的 条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免疫球蛋白基因 编码序列中不含有所述的IIs型限制性酶识别位点。

在这样的实施方式中，所述的天然存在的互补决定区域 (CDR)区域序列相对于它们的野生型而言在本质上是未发生改 变的，即，天然状态。这些天然存在的互补决定区域(CDR)区 域序列存在于氨基酸序列的侧翼，其中所述的氨基酸序列已经被 进行了工程化处理(或者被进行了人工处理)，从而含有两个IIs 型限制性酶识别位点，其中在所述的天然存在的互补决定区域 (CDR)区域序列的每一例上存在有一个IIs型限制性酶识别位 点。

在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被 相同的IIs型限制性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点 是存在于所述的填充核酸序列之内并且存在于所述的天然存在 的互补决定区域(CDR)序列的侧翼上的。在一些实施方式中， 所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行 识别，其中所述的限制性酶识别位点是存在于所述的填充核酸序 列之内并且存在于所述的天然存在的互补决定区域(CDR)序列 的侧翼上的。例如，所述的IIs型限制性酶识别位点是FokI识别 位点，BsaI识别位点，和/或BsmBI识别位点。

在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列是来自于一种 人类基因序列的。例如，所述的人类序列是一种人类重链可变基 因序列或者是一种来自于人类重链可变基因序列的序列。在一些 实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选自：重链可变序列 1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69(VH1-69)，重链可变序列1-18 (VH1-18)，重链可变序列3-30(VH3-30)，重链可变序列3-48 (VH3-48)，重链可变序列3-23(VH3-23)，以及重链可变序列 5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人 类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人类κ轻链可变基因 序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自：κ轻 链可变序列1-33(VK1-33)，κ轻链可变序列1-39(VK1-39)， κ轻链可变序列3-11(VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)， 以及κ轻链可变序列3-20(VK3-20)。在一些实施方式中，所述 的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序列或者是一种来自于 人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类λ轻链可变 基因序列选自：λ轻链可变序列1-44(VL1-44)以及λ轻链可变 序列1-51(VL1-51)。

在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸包括下述 的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然存在的 互补决定区域3(CDR3)序列，来自于人类的天然存在的免疫球 蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig) 序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域 内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性 的多肽。

在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸能够编码 互补决定区域3(CDR3)区域，并且所述的大量的天然存在的核 酸包括这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天 然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一 种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物 已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。

在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸包括下述 的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然存在的 互补决定区域1(CDR1)序列，来自于人类的天然存在的免疫球 蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig) 序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域 内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性 的多肽。

在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸能够编码 互补决定区域1(CDR1)区域，并且所述的大量的天然存在的核 酸包括这样的免疫球蛋白序列，或者来自于这样的免疫球蛋白序 列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类中的免疫球蛋 白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫原之下，或者 是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为被暴露在一种 特定的抗原之下。

在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸包括下述 的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然存在的 互补决定区域2(CDR2)序列，来自于人类的天然存在的免疫球 蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋白(Ig) 序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的环状区域 内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具有多样性 的多肽。

在一些实施方式中，所述的大量的天然存在的核酸能够编码 互补决定区域2(CDR2)区域，并且所述的大量的天然存在的核 酸包括这样的免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天 然存在于人类中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一 种特定的免疫原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物 已经被认定为被暴露在一种特定的抗原之下。

在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至 少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻 链受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。在 一些实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。

在一些实施方式中，所述的方法同样包括下述的步骤：利用 一种靶向抗原与所述的宿主细胞进行接触，并且确定哪些被表达 的完整的免疫球蛋白(Ig)可变基因编码序列能够与所述的靶向 抗原进行结合，从而识别出靶向特异性的抗体，所述抗体所具有 的抗体可变区域或者所述抗体的一部分。在一些实施方式中，所 述的方法包括下述的另外的步骤：(i)对所述的免疫球蛋白可变 结构域编码序列进行测序，其中所述的编码序列能够与所述的靶 向抗原进行结合。

本发明同样提供了用以制备一种免疫球蛋白多肽的方法。这 样的方法包括下述的步骤：(a)提供大量的免疫球蛋白(Ig)受 体骨架核酸序列，在所述的核酸序列中导入一种多样性来源，其 中所述的导入是在单一的互补决定区域(CDR)内进行的，所述 的互补决定区域(CDR)选自由下述的互补决定区域(CDR)所 组成的组中：互补决定区域1(CDR1)，互补决定区域2(CDR2)， 以及互补决定区域3(CDR3)，其中所述的免疫球蛋白(Ig)受 体骨架序列包括一个填充核酸序列，所述的填充核酸序列中包括 至少两个IIs型限制性酶识别位点，并且其中所述的多样性来源 是一种互补决定区域(CDR)，所述的互补决定区域(CDR)选 自含有IIs型限制性酶识别位点的通过合成方法制备得到的互补 决定区域(CDR)序列，其中所述的限制性酶识别位点存在于所 述的互补决定区域(CDR)区域之外，(b)向每一个免疫球蛋白 (Ig)受体骨架之内导入所述的多样性来源，其中所述的导入是 通过利用一种IIs型限制性酶对所述的多样性来源以及所述的免 疫球蛋白(Ig)受体骨架同时进行消化的方式来实现的；(c)将 所述的经过消化的多样性来源连结至所述的免疫球蛋白(Ig)受 体骨架之中，这样一来一个完整的免疫球蛋白可变基因编码序列 被得以重新建立；(d)将来自于步骤(c)中的所述的经过连结 的免疫球蛋白(Ig)受体骨架克隆至一个表达载体之中；以及(e) 在一个宿主细胞内对步骤(d)中所述的表达载体进行转化并且 在足以能够使所述的完整的免疫球蛋白基因编码序列进行表达 的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免疫球蛋白基 因编码序列中不含有所述的IIs型限制性酶识别位点。

在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被 相同的IIs型限制性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点 是存在于所述的填充核酸序列之内并且存在于所述的通过合成 方法制备得到的互补决定区域(CDR)序列之内的。在一些实施 方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制 性酶进行识别，其中所述的限制性酶识别位点是存在于所述的填 充核酸序列之内并且存在于所述的通过合成方法制备得到的互 补决定区域(CDR)序列之内的。例如，所述的IIs型限制性酶 识别位点是FokI识别位点，BsaI识别位点，和/或BsmBI识别位 点。

在一些实施方式中，所述的免疫球蛋白(Ig)受体骨架核酸 序列是来自于一种人类基因序列的。例如，所述的人类序列是一 种人类重链可变基因序列或者是一种来自于人类重链可变基因 序列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列 选自：重链可变序列1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69(VH1-69)， 重链可变序列1-18(VH1-18)，重链可变序列3-30(VH3-30)， 重链可变序列3-48(VH3-48)，重链可变序列3-23(VH3-23)， 以及重链可变序列5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的 人类序列是一种人类κ轻链可变基因序列或者是一种来自于人 类κ轻链可变基因序列的序列。例如，所述的人类κ轻链可变基 因序列选自：κ轻链可变序列1-33(VK1-33)，κ轻链可变序列 1-39(VK1-39)，κ轻链可变序列3-11(VK3-11)，κ轻链可变 序列3-15(VK3-15)，以及κ轻链可变序列3-20(VK3-20)。在 一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变基因序 列或者是一种来自于人类λ轻链可变基因序列的序列。例如，所 述的人类λ轻链可变基因序列选自：λ轻链可变序列1-44 (VL1-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域1(CDR1)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域2(CDR2)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的免疫球蛋白(Ig)受体骨 架核酸序列包括至少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以 及至少一种可变轻链受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。在 一些实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。

在一些实施方式中，所述的方法同样包括下述的步骤：利用 一种靶向抗原与所述的宿主细胞进行接触，并且确定哪些被表达 的完整的免疫球蛋白(Ig)可变基因编码序列能够与所述的靶向 抗原进行结合，从而识别出靶向特异性的抗体，所述抗体所具有 的抗体可变区域或者所述抗体的一部分。在一些实施方式中，所 述的方法包括下述的另外的步骤：(i)对所述的免疫球蛋白可变 结构域编码序列进行测序，其中所述的编码序列能够与所述的靶 向抗原进行结合。

本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能 够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可 变结构域中包括大量的互补决定区域3(CDR3)序列，所述的互 补决定区域3(CDR3)序列是分别从来自于一个哺乳动物物种的 所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。本发明同样提 供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人 类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包 括大量的互补决定区域2(CDR2)序列，所述的互补决定区域2 (CDR2)序列是分别从来自于一个哺乳动物物种的所述的免疫 球蛋白可变结构域个体中分离得到的。本发明同样提供了用以制 备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋 白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互 补决定区域1(CDR1)序列，所述的互补决定区域1(CDR1) 序列是分别从来自于一个哺乳动物物种的所述的免疫球蛋白可 变结构域个体中分离得到的。

本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能 够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可 变结构域中包括大量的互补决定区域3(CDR3)序列，所述的互 补决定区域3(CDR3)序列是分别从来自于一个非人类的哺乳动 物物种的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。本发 明同样提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编 码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结 构域中包括大量的互补决定区域2(CDR2)序列，所述的互补决 定区域2(CDR2)序列是分别从来自于一个非人类的哺乳动物物 种的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。本发明同 样提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一 个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域 中包括大量的互补决定区域1(CDR1)序列，所述的互补决定区 域1(CDR1)序列是分别从来自于一个非人类的哺乳动物物种的 所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。

在一些实施方式中，所述的非人类的物种是非人类的灵长动 物类，啮齿动物类，犬科动物类，猫科动物类，羊，山羊，牛类， 马类，驼科的家族成员之一，美洲驼类，骆驼类，单峰骆驼类， 或者是猪类。

本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能 够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可 变结构域中包括大量的互补决定区域3(CDR3)序列，所述的互 补决定区域3(CDR3)序列是分别从来自于人类的所述的免疫球 蛋白可变结构域个体中分离得到的。本发明提供了用以制备大量 核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可 变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定 区域2(CDR2)序列，所述的互补决定区域2(CDR2)序列是 分别从来自于人类的所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离 得到的。本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核 酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋 白可变结构域中包括大量的互补决定区域1(CDR1)序列，所述 的互补决定区域1(CDR1)序列是分别从来自于人类的所述的免 疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。

本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能 够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可 变结构域中包括大量的互补决定区域3(CDR3)序列，所述的互 补决定区域3(CDR3)序列是分别从来自于一种非人类的物种的 所述的免疫球蛋白可变结构域个体中分离得到的。

在一些实施方式中，这样的方法包括下述的步骤：(a)提供 大量的受体骨架核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不 同的人类免疫球蛋白可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中包 括第一个骨架区域(FR1)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨 架区域(FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架 区域1(FR1)与骨架区域2(FR2)区域之间被互补决定区域1 (CDR1)区域进行了间隔；所述的骨架区域2(FR2)与骨架区 域3(FR3)区域之间被互补决定区域2(CDR2)区域进行了间 隔；并且所述的骨架结构3(FR3)以及骨架结构4(FR4)区域 之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列 中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶 识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔；(b)提供大量 的经过多样性处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码互 补决定区域3(CDR3)序列，其中所述的互补决定区域3(CDR3) 序列是从所述的哺乳动物物种的免疫球蛋白个体中分离得到的， 其中所述的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每一个序列 在其每一个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用 一种IIs型限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一个进行消 化，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3(CDR3) 区域，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型限制性酶 识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步骤(a)中 所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进行消化，其 中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限制性酶识别 位点进行结合；以及(d)将步骤(c)中所述的经过消化的核酸 序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化 的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定 区域3(CDR3)区域，这样一来可以利用所述的核酸序列或者所 述的氨基酸序列对所述的骨架区域3(FR3)以及骨架区域4(FR4) 区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决 定区域3(CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且一个完整的免疫球蛋 白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中所述的编码序列中 不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点。 同样可以使用大量的经过多样性处理的核酸序列来实现这样的 步骤，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域2(CDR2)序 列，所述的互补决定区域2(CDR2)序列是从所述的哺乳动物物 种的免疫球蛋白个体中分离得到的。同样可以使用大量的经过多 样性处理的核酸序列来实现这样的步骤，其中所述的核酸序列能 够编码互补决定区域1(CDR1)序列，所述的互补决定区域1 (CDR1)序列是从所述的哺乳动物物种的免疫球蛋白个体中分 离得到的。

在一些实施方式中，步骤(b)是通过下述的方式来实现的： 使用寡核苷酸引物对来自于一种哺乳动物物种中的所述的互补 决定区域3(CDR3)序列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引物 中含有一个IIs型限制性位点。在一些实施方式中，对所述的寡 核苷酸引物进行设计，从而增强所述的哺乳动物互补决定区域3 (CDR3)序列以及所述的受体骨架之间所具有的兼容性，其中 所述的受体骨架能够编码一种人类免疫球蛋白的可变结构域。在 一些实施方式中，对所述的寡核苷酸引物进行设计，用以对存在 于所述的哺乳动物的互补决定区域3(CDR3)序列的边界上的所 述序列进行修饰，从而允许经由具有兼容性的粘性末端而被有效 的连结至所述的受体骨架之中，其中所述的受体骨架能够编码一 种人类免疫球蛋白的可变结构域。在一些实施方式中，存在于所 述的互补决定区域3(CDR3)区域的侧翼之上的所述的哺乳动物 DNA序列可能并不是通过断裂作用来产生粘性末端的，其中所 述的断裂作用是由IIS型限制性酶所产生的，所述的粘性末端能 够与所述的经过消化的受体骨架所具有的粘性末端具有兼容性。 在这样的情形中，可以对用来进行扩增的所述的寡核苷酸进行设 计，从而对所述的靶向哺乳动物序列进行修饰，这样一来在利用 一种IIS型限制性酶进行切断之后，所述的粘性末端是具备兼容 性的并且可以进行有效的连结。同样可以通过使用寡核苷酸引物 对所述的互补决定区域2(CDR2)序列进行扩增的方式来实现这 样的步骤，其中所述的互补决定区域2(CDR2)序列来自于一种 哺乳动物物种，所述的寡核苷酸引物中含有一种IIs型限制性位 点。同样可以通过使用寡核苷酸引物对所述的互补决定区域1 (CDR1)序列进行扩增的方式来实现这样的步骤，其中所述的 互补决定区域1(CDR1)序列来自于一种哺乳动物物种，所述的 寡核苷酸引物中含有一种IIs型限制性位点。

在一些实施方式中，步骤(b)是通过下述的方式来实现的： 使用寡核苷酸引物对来自于一种非人类的物种中的所述的互补 决定区域3(CDR3)序列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引物 中含有一个Fok I IIs型限制性位点。这样的步骤同样可以通过下 述的方式来实现：使用寡核苷酸引物对来自于一种哺乳动物物种 中的所述的互补决定区域2(CDR2)序列进行扩增，其中在所述 的寡核苷酸引物中含有一个Fok I IIs型限制性位点。这样的步骤 同样可以通过下述的方式来实现：使用寡核苷酸引物对来自于一 种哺乳动物物种中的所述的互补决定区域1(CDR1)序列进行扩 增，其中在所述的寡核苷酸引物中含有一个Fok I IIs型限制性位 点。

在一些实施方式中，在步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs 型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。在 一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点是BsmBI识别 位点，BsaI识别位点，FokI识别位点或者是上述识别位点的组合。

在一些实施方式中，所述的经过多样性处理的编码互补决定 区域3(CDR3)序列的核酸序列能够编码重链互补决定区域3 (CDR H3)序列。在一些实施方式中，所述的经过多样性处理 的编码互补决定区域3(CDR3)序列的核酸序列能够编码轻链互 补决定区域3(CDR L3)序列。在一些实施方式中，所述的经过 多样性处理的编码互补决定区域2(CDR2)序列的核酸序列能够 编码重链互补决定区域2(CDR H2)序列。在一些实施方式中， 所述的经过多样性处理的编码互补决定区域2(CDR2)序列的核 酸序列能够编码轻链互补决定区域2(CDR L2)序列。在一些实 施方式中，所述的经过多样性处理的编码互补决定区域1(CDR1) 序列的核酸序列能够编码重链互补决定区域1(CDR H1)序列。 在一些实施方式中，所述的经过多样性处理的编码互补决定区域 1(CDR1)序列的核酸序列能够编码轻链互补决定区域1(CDR  L1)序列。

在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列包括这样的序 列，或者来自于这样的序列，所述的序列是一种人类重链可变基 因序列中的至少一部分，其中所述的人类重链可变基因序列选 自：重链可变序列1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69(VH1-69)， 重链可变序列1-18(VH1-18)，重链可变序列3-30(VH3-30)， 重链可变序列3-48(VH3-48)，重链可变序列3-23(VH3-23)， 以及重链可变序列5-51(VH5-51)。在一些实施方式中，所述的 受体骨架核酸序列包括这样的序列，或者来自于这样的序列，所 述的序列是一种人类κ轻链可变基因序列中的至少一部分。例 如，所述的人类κ轻链可变基因序列选自：κ轻链可变序列1-33 (VK1-33)，κ轻链可变序列1-39(VK1-39)，κ轻链可变序列 3-11(VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)，以及κ轻链 可变序列3-20(VK3-20)。在一些实施方式中，所述的受体骨架 核酸序列包括这样的序列，或者来自于这样的序列，所述的序列 是一种人类λ轻链可变基因序列中的至少一部分。例如，所述的 人类λ轻链可变基因序列选自：λ轻链可变序列1-44(VL1-44) 以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。

在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至 少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻 链受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，在本发明描述的所述方法中同样包括下 述的步骤：(e)将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种表达 载体之中，其中所述的核酸文库能够编码免疫球蛋白的可变结构 域，以及(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的表达载体 进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白可变结构 域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免 疫球蛋白可变结构域是由所述的文库进行编码的。在一些实施方 式中，所述的表达载体是一种噬菌体或者或者是噬菌体载体。在 一些实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。

本发明提供了用以制备大量核酸的方法，其中每一种核酸能 够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构域，所述的免疫球蛋白可 变结构域中包括大量的互补决定区域3(CDR3)序列，所述的互 补决定区域3(CDR3)序列是分别从来自于一个经过免疫的非人 类的哺乳动物物种或者非人类的物种的所述的免疫球蛋白可变 结构域中分离得到的。本发明同样提供了用以制备大量核酸的方 法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可变结构 域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定区域2 (CDR2)序列，所述的互补决定区域2(CDR2)序列是分别从 来自于一个经过免疫的非人类的哺乳动物物种的所述的免疫球 蛋白可变结构域中分离得到的。本发明同样提供了用以制备大量 核酸的方法，其中每一种核酸能够编码一个人类免疫球蛋白的可 变结构域，所述的免疫球蛋白可变结构域中包括大量的互补决定 区域1(CDR1)序列，所述的互补决定区域1(CDR1)序列是 分别从来自于一个经过免疫的非人类的哺乳动物物种的所述的 免疫球蛋白可变结构域中分离得到的。

在一些实施方式中，所述的非人类的物种是非人类的灵长动 物类，啮齿动物类，犬科动物类，猫科动物类，羊，山羊，牛类， 马类，驼科的家族成员之一，美洲驼类，骆驼类，单峰骆驼类， 或者是猪类。

在一些实施方式中，所述的方法包括下述的步骤：(a)提供 大量的受体骨架核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不 同的人类免疫球蛋白可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中包 括第一个骨架区域(FR1)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨 架区域(FR3)，以及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架 区域1(FR1)与骨架区域2(FR2)区域之间被互补决定区域1 (CDR1)区域进行了间隔；所述的骨架区域2(FR2)与骨架区 域3(FR3)区域之间被互补决定区域2(CDR2)区域进行了间 隔；并且所述的骨架结构3(FR3)以及骨架结构4(FR4)区域 之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列 中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶 识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔；(b)提供大量 的经过多样性处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码互 补决定区域3(CDR3)序列，其中所述的互补决定区域3(CDR3) 序列是从所述的经过免疫的非人类的哺乳动物中分离得到的，其 中所述的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每一个序列在 其每一个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用一 种IIs型限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一个进行消 化，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3(CDR3) 区域，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型限制性酶 识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步骤(a)中 所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进行消化，其 中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限制性酶识别 位点进行结合；以及(d)将步骤(c)中所述的经过消化的核酸 序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化 的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定 区域3(CDR3)区域，这样一来可以利用所述的核酸序列或者所 述的氨基酸序列对所述的骨架区域3(FR3)以及骨架区域4(FR4) 区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决 定区域3(CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且一个完整的免疫球蛋 白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中所述的编码序列中 不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点。 同样可以使用大量的经过多样性处理的核酸序列来实现这样的 步骤，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域2(CDR2)序 列，所述的互补决定区域2(CDR2)序列是从所述的经过免疫的 非人类的哺乳动物中分离得到的。同样可以使用大量的经过多样 性处理的核酸序列来实现这样的步骤，其中所述的核酸序列能够 编码互补决定区域1(CDR1)序列，所述的互补决定区域1 (CDR1)序列是从所述的经过免疫的非人类的哺乳动物中分离 得到的。

在一些实施方式中，步骤(b)是通过下述的方式来实现的： 使用寡核苷酸引物对来自于一种经过免疫的非人类的哺乳动物 中的所述的互补决定区域3(CDR3)序列进行扩增，其中在所述 的寡核苷酸引物中含有一个Fok I IIs型限制性位点。在一些实施 方式中，对所述的寡核苷酸引物进行设计，从而增强所述的哺乳 动物互补决定区域3(CDR3)序列以及所述的受体骨架之间所具 有的兼容性，其中所述的受体骨架能够编码一种人类免疫球蛋白 的可变结构域。在一些实施方式中，对所述的寡核苷酸引物进行 设计，用以对存在于所述的哺乳动物的互补决定区域3(CDR3) 序列的边界上的所述序列进行修饰，从而允许经由具有兼容性的 粘性末端而被有效的连结至所述的受体骨架之中，其中所述的受 体骨架能够编码一种人类免疫球蛋白的可变结构域。在一些实施 方式中存在于所述的互补决定区域3(CDR3)区域的侧翼之上的 所述的哺乳动物的DNA序列可能并不是通过断裂作用来产生粘 性末端的，其中所述的断裂作用是由IIS型限制性酶所产生的， 所述的粘性末端能够与所述的经过消化的受体骨架所具有的粘 性末端具有兼容性。在这样的情形中，可以对用来进行扩增的所 述的寡核苷酸进行设计，从而对所述的靶向哺乳动物序列进行修 饰，这样一来在利用一种IIS型限制性酶进行切断之后，所述的 粘性末端是具备兼容性的并且可以进行有效的连结。同样可以通 过使用寡核苷酸引物对所述的互补决定区域2(CDR2)序列进行 扩增的方式来实现这样的步骤，其中所述的互补决定区域2 (CDR2)序列来自于所述的经过免疫的非人类的哺乳动物，所 述的寡核苷酸引物中含有一种IIs型限制性位点。同样可以通过 使用寡核苷酸引物对所述的互补决定区域1(CDR1)序列进行扩 增的方式来实现这样的步骤，其中所述的互补决定区域1(CDR1) 序列来自于一种经过免疫的非人类的哺乳动物，所述的寡核苷酸 引物中含有一种IIs型限制性位点。

在一些实施方式中，步骤(b)是通过下述的方式来实现的： 使用寡核苷酸引物对来自于所述的非人类的哺乳动物中的所述 的可变重链互补决定区域3(CDR H3)序列进行扩增，其中在所 述的寡核苷酸引物中含有一个Fok I IIs型限制性位点。这样的步 骤同样可以通过下述的方式来实现：使用寡核苷酸引物对来自于 所述的非人类的哺乳动物中的所述的互补决定区域2(CDR2)序 列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引物中含有一个Fok I IIs型 限制性位点。这样的步骤同样可以通过下述的方式来实现：使用 寡核苷酸引物对来自于所述的非人类的哺乳动物中的所述的互 补决定区域1(CDR1)序列进行扩增，其中在所述的寡核苷酸引 物中含有一个Fok I IIs型限制性位点。

在一些实施方式中，在步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs 型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。在 一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点是BsmBI识别 位点，BsaI识别位点，FokI识别位点或者是上述识别位点的组合。

在一些实施方式中，所述的编码互补决定区域3(CDR3)序 列的经过多样性处理的核酸序列能够编码重链互补决定区域3 (CDR3)(CDR H3)序列。在一些实施方式中，所述的编码互 补决定区域3(CDR3)序列的经过多样性处理的核酸序列能够编 码轻链互补决定区域3(CDR3)(CDR L3)序列。在一些实施方 式中，所述的编码互补决定区域2(CDR2)序列的经过多样性处 理的核酸序列能够编码重链互补决定区域2(CDR2)(CDR H2) 序列。在一些实施方式中，所述的编码互补决定区域2(CDR2) 序列的经过多样性处理的核酸序列能够编码轻链互补决定区域2 (CDR2)(CDR L2)序列。在一些实施方式中，所述的编码互 补决定区域1(CDR1)序列的经过多样性处理的核酸序列能够编 码重链互补决定区域1(CDR1)(CDR H1)序列。在一些实施方 式中，所述的编码互补决定区域1(CDR1)序列的经过多样性处 理的核酸序列能够编码轻链互补决定区域1(CDR1)(CDR L1) 序列。

在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列包括这样的序 列，或者来自于这样的序列，所述的序列是一种人类重链可变基 因序列中的至少一部分，其中所述的人类重链可变基因序列选 自：重链可变序列1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69(VH1-69)， 重链可变序列1-18(VH1-18)，重链可变序列3-30(VH3-30)， 重链可变序列3-48(VH3-48)，重链可变序列3-23(VH3-23)， 以及重链可变序列5-51(VH5-51)。

在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列包括这样的序 列，或者来自于这样的序列，所述的序列是一种人类κ轻链可变 基因序列中的至少一部分。例如，所述的人类κ轻链可变基因序 列选自：κ轻链可变序列1-33(VK1-33)，κ轻链可变序列1-39 (VK1-39)，κ轻链可变序列3-11(VK3-11)，κ轻链可变序列 3-15(VK3-15)，以及κ轻链可变序列3-20(VK3-20)。在一些 实施方式中，所述的受体骨架核酸序列包括这样的序列，或者来 自于这样的序列，所述的序列是一种人类λ轻链可变基因序列中 的至少一部分。例如，所述的人类λ轻链可变基因序列选自：λ 轻链可变序列1-44(VL1-44)以及λ轻链可变序列1-51(VL1-51)。

在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至 少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻 链受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，所述的方法中同样包括下述的步骤： (e)将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种表达载体之中， 其中所述的核酸文库能够编码免疫球蛋白的可变结构域，以及 (f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的表达载体进行转化 并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白可变结构域进行表 达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免疫球蛋白 可变结构域是由所述的文库进行编码的。在一些实施方式中，所 述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，所述的 表达载体是一种噬菌体或者是噬菌体载体。

附图的简要说明

附图1A是一种蛋白质结构域的示意图，其中所述的蛋白质 结构域中具有一个骨架以及环，所述的环能够提供与另外一种蛋 白质或者分子进行接触的残基。对几个位置进行了描述：一个具 有经过了适当折叠的区域的稳定的蛋白质结构域；经过适当折叠 的环，其中所述的环被插入到一个具有有限的内在稳定性的结构 域之内；一个本身固有的稳定的蛋白质结构域，其中所述的结构 域所具有的稳定性受到所述的环区域的影响。

附图1B是不同类型的蛋白质个体文库的示意图，其中所述 的文库是使用不同的多样性策略来进行建立的。

附图2是一种抗体可变受体骨架的示意图。指示出了骨架区 域，互补决定区域(CDR)以及IIS-RM型限制性位点。

附图3是一种策略的示意图，其中所述的策略被用来从天然 的个体中捕获可变重链的互补决定区域3(CDRH3)序列。

附图4是一种使用含有IIS-RM型限制性酶的引物所带来的 益处的示意图，其中所述的限制性酶被用来进行所述的扩增作用 以及天然的互补决定区域(CDR)在受体骨架中的插入。

附图5是一幅示意图，描述的是所选择的可变重链以及轻链 所具有的生殖细胞系基因序列，其中所述的生殖细胞系基因序列 被用来进行所述的受体骨架的建立。

附图6是一种扩增策略的示意图，所述的策略被用来进行所 述的受体骨架的建立，所述的建立是通过向所述的生殖细胞系序 列中加入一个填充片段以及一个骨架区域4(FR4)区域的方式 来实现的。

附图7，上栏是一幅示意图，描述的是所述的重链可变(VH) 受体骨架的填充片段所具有的序列详细信息。由所述的限制性酶 BsmBI进行识别以及切断的DNA序列分别被表示在红色的框内 以及黑色的框内并且被表示在所述附图的下栏中。带有下划线的 是与所述的抗体可变序列相对应的所述的阅读框。

附图8是一个示意图，描述的是所述的20个受体骨架所具 有的序列。

附图9是所述的pNDS 1载体的示意图，所述的示意图是所 述载体单独的示意图或者是与一种虚拟的重链可变区域或者一 种虚拟的轻链可变区域进行结合了的示意图。

附图10是一个表格，描述的是所述的可变重链的互补决定 区域3(CDRH3)序列所具有的序列，其中所述的序列是从一种 人类cDNA来源中重新获得的并且被插入到人类的受体骨架之 内。

附图11是一个表格，表示的是对用于可变重链(VH)，可变 κ轻链(VK)以及可变λ轻链(Vλ)中的合成性的互补决定区 域(CDR)序列所进行的设计。根据所述的Kabat编号方案对所 述的位置进行了编号。通过使用一种指定的密码子多样性处理策 略(NNS，NVK，NVT，DVT)对所述的互补决定区域(CDR) 所具备的理论上的多样性进行了表示。在框内表示的是在可变重 链(VH)的互补决定区域(CDR)合成中所采用的所述策略。

附图12是一个示意图，表示的是被插入到一种受体骨架之 中的合成性的互补决定区域(CDR)所具有的序列详细信息。

附图13是一个示意图，表示的是初始文库以及为了建立次 级文库所进行的所述的链的重新结合。

附图14是一个示意图，表示的是与可变轻链(VL)的合成 性文库进行结合的所述的受体可变重链(VH)文库的建立，以 及对所述的可变重链互补决定区域3(CDRH3)个体的捕获，其 中所述的个体是来源于人类或者非人类的。

附图15是一个示意图，表示的是所述的MnA、MiB以及 MiC文库的建立，其中使用了所述的可变重链互补决定区域3 (CDRH3)个体作为一种多样性的来源，所述的个体来自于天然 的小鼠或者来自于利用人类干扰素γ(hIFNγ)或者人类正常T 细胞表达和分泌因子(hCCL5/RANTES)进行免疫的小鼠。所述 的文库所具备的大小在上栏中被进行了表示。所述的下栏表示的 是在这些文库中发现的所述的可变重链互补决定区域3 (CDRH3)的长度分布。

附图16是一系列的图表，描述的是在利用所述的次级文库 AD1以及AE1对人类干扰素γ(hIFNγ)进行筛选的过程中所 述的噬菌体输出量滴定(phage output titration)。

附图17是一系列的图表，描述的是在利用所述的次级文库 AD1以及AE1对单克隆抗体5E3进行筛选的过程中所述的噬菌 体输出量滴定(phage output titration)。

附图18是一系列的图表，描述的是在所述的AE1以及AD1 文库中发现的所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3)的长度 所具有的频率以及在经历过三轮针对所述的单克隆抗体5E3所 进行的筛选之后所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3)的长 度所具有的频率。已经表示出了所述的每一种可变重链互补决定 区域3(CDR H3)所具有的长度在所述的不同的重链可变(VH) 家族中所具有的分布。然而，当可变重链互补决定区域3(CDR  H3)具有超过16个氨基酸的长度时，由所述的Illumina测序平 台所提供的70bp的序列不能够覆盖足够的骨架序列用以明确的 识别出所述的重链可变1(VH1)家族，并且因此所述的重链可 变(VH)家族被表示为未确定。

附图19是一系列的图表，描述的是使用经过纯化的6种单 链抗体片段(scFv)制剂所得到的剂量应答酶联免疫吸附检测 (ELISA)，其中所述的制剂能够作用于小鼠的5E3或者一种不 相关的小鼠抗体1A16。所述的七个克隆能够编码不同的单链抗 体片段(scFv)。克隆A6是一种对人类干扰素γ(hIFNγ)具有 特异性的单链抗体片段(scFv)并且被用来作为一种阴性对照。

附图20是一个图表，描述的是使用经过纯化的单链抗体片 段(scFv)制剂所得到的剂量应答酶联免疫吸附检测(ELISA)， 其中所述的制剂能够作用于人类干扰素γ(hIFNγ)，以及与一 种对人类干扰素γ(hIFNγ)具有特异性的阳性单链抗体片段 (scFv)所进行的比较(A6)。

附图21是一个图表，描述的是所述的经过纯化的单链抗体 片段(scFv)制剂在一项荧光素酶报告基因检测中所具有的抑制 性作用，其中所述的荧光素酶报告基因检测是由人类干扰素γ (hIFNγ)来进行驱动的。将两种单链抗体片段(scFv)备选物 (AD1R4P1A9以及AE14R3P2E4)所具有的抑制活性与所述的 一种阳性对照单链抗体片段(scFv)(G9)以及一种阴性对照单 链抗体片段(scFv)(D11)所具有的活性进行了比较。

附图22是一个图表，描述的是所述的经过纯化的单链抗体 片段(scFv)制剂在一项II类主要组织相容性复合体(MHCII) 诱导检测中所具有的抑制性作用，其中所述的抑制性作用是针对 人类干扰素γ(hIFNγ)所进行的应答。将所述的两种单链抗体 片段(scFv)备选物(AD1R4P1A9以及AE14R3P2E4)所具有 的抑制活性与所述的一种阴性对照单链抗体片段(scFv)(D11) 所具有的活性进行了比较。

附图23是一系列的图表，描述的是所述的两种备选物 AD1R4P1A9以及AE14R3P2E4在一项荧光素酶报告基因检测中 所具有的抑制性作用，其中所述的荧光素酶报告基因检测是由人 类干扰素γ(hIFNγ)来进行驱动的，所述的两种备选物被重新 格式化成为免疫球蛋白G(IgG)。将所述的两种免疫球蛋白(Ig) 所具有的抑制活性与一种不相关的免疫球蛋白G(IgG)所具有 的活性进行了比较，其中所述的不相关的免疫球蛋白G(IgG) 能够直接作用于人类正常T细胞表达和分泌因子(RANTES) (NI-0701)。

附图24是一系列的图表，描述的是使用所述的免疫球蛋白G (IgG)G11以及DA4所得到的剂量应答酶联免疫吸附检测 (ELISA)，其中所述的免疫球蛋白G(IgG)G11以及DA4能够 作用于小鼠的5E3，嵌合型大鼠的5E3以及所述相对应的小鼠和 大鼠的同型抗体。

附图25是一系列的图表，描述的是一种用于在不同稀释度 的小鼠血清内对所述的小鼠5E3进行检测的酶联免疫吸附检测 (ELISA)，其中在所述的检测中使用所述的抗个体基因型的免 疫球蛋白(IgG)G11以及DA4作为捕获抗体。

附图26是一个图表，描述的是在利用所述的文库MnA以及 MiB针对人类干扰素γ(hIFNγ)进行筛选的过程中噬菌体的输 出/输入比例。

附图27是一个图表，描述的是在一项单链抗体片段(scFv) 的酶联免疫吸附检测(ELISA)中获得的所述命中率，其中所述 的酶联免疫吸附检测(ELISA)是利用来自于所述的MnA、MiB 以及MiC文库中的克隆进行筛选的，并且是在每一轮针对人类 干扰素γ(hIFNγ)所进行的筛选之后进行的。将所述的阈值设 定为利用所述的A6对照单链抗体片段(scFv)所获得的信号的 一半。

附图28是一个图表，表示的是在结合试验中给出不同水平 的信号的所述单链抗体片段(scFv)所具有的分布频率，其中所 述的结合是针对人类干扰素γ(hIFNγ)而言的，其是通过利用 来自于所述的MnA以及MiB文库中的克隆而获得的。

附图29是一个图表，描述的是使用经过纯化的单链抗体片 段(scFv)制剂所得到的剂量应答酶联免疫吸附检测(ELISA)， 其中所述的制剂能够作用于人类干扰素γ(hIFNγ)，并且是从 来自于所述的MnA以及MiB文库中的克隆中获得的，以及与一 种对人类干扰素γ(hIFNγ)具有特异性的阳性单链抗体片段 (scFv)所进行的比较(A6)。

发明详述

合成性的蛋白质文库并且特别是合成性的抗体文库是具有 吸引力的，因为在所述的文库建立的过程中可能能够选择所述的 构建单元，其中所述的构建单元用于组成这样的合成性的蛋白质 并且包含了所期望的特征。然而，一个很重要的局限性是这样的 合成性蛋白质的所述部分所具有的随机性能够生成大量的变体， 这通常能够导致非功能性的蛋白质并且因此能够显著的降低所 述的功能性文库的大小及其性能。合成性多样性所具有的另外一 个局限性是用来对所述的随机的氨基酸延伸所具有的理论上的 多样性进行覆盖所需要的所述文库的大小并不能够被覆盖，这归 因于实际应用上的局限性。即使利用展示系统例如一种核糖体展 示，可以建立并且采用一种10¹³至10¹⁴的多样性，其中所述的多 样性能够最大程度的覆盖所述的具有9个氨基酸延伸的全部的随 机选择。由于所述的天然可变重链互补决定区域3(CDR H3)(在 本发明中同样也被称之为所述的重链互补决定区域3或者VH  CDR3)所具有的平均尺寸在9以上并且可以具有超过20个氨基 酸的长度，合成性的多样性并不是一个用以建立这样的互补决定 区域(CDR)的可行性途径。

某些方法的组合能够在所述的DNA序列中导入错误，其中 所述的被组合的方法是一般情况下被用来进行DNA操作的方法 以及那些被用在一种蛋白质文库的建立过程中的方法。这样的错 误能够导致在所述的DNA所具有的阅读框内发生的改变，使所 述的DNA将不再编码一种功能性的多肽。通常情况下，通过使 用DNA片段的组装而建立起来的抗体文库中含有15％至45％的 这样的序列，所述的序列在进行蛋白质的翻译时没有存在于所述 的正确的阅读框之内，其中所述的DNA片段的组装是通过聚合 酶链式反应(PCR)和/或限制性克隆的方式来进行的。这些非功 能性的文库成员能够危及所述的抗体筛选以及识别过程所具有 的效率并且因此被认为是上述领域中的一种局限性。在本发明中 描述的所述方法允许向一种抗体文库中进行一种更为强有力的 导入，这种强有力的导入是通过使用一种可供选择的克隆策略的 方式来实现的。通常情况下所述的骨架内序列所具有的频率大约 为90％。本发明所具有的另外一个优点是能够将选定的受体抗体 可变骨架与互补决定区域(CDR)环进行组合，其中所述的互补 决定区域(CDR)环具有进行正确折叠的高度概率。所述的方法 允许对所述的长互补决定区域(CDR)进行捕获，其中难以利用 合成性的随机选择途径对所述的长互补决定区域(CDR)进行覆 盖。此外在本发明所描述的所述方法中不需要在所述的受体抗体 可变编码区域内进行任何的修饰，用于对所述的经过多样性处理 的序列进行克隆。这种方法所具备的另外一个优点是可以在同一 组所述的受体抗体骨架内捕获到几种多样性的来源。这样的来源 包括但不局限于：来自于人类或者其他的哺乳动物的天然抗体互 补决定区域(CDR)，来自于鸡抗体的互补决定区域(CDR)，抗 体样分子所具有的互补决定区域(CDR)，来自于T细胞受体的 可变环，其中所述的抗体样分子例如是来自于骆驼的VHH，来 自于鲨鱼的免疫球蛋白NAR(IgNAR)。除此之外，天然的互补 决定区域(CDR)可以来自于天然的动物或者经过免疫的动物。 在后者的情形中，所述的重新获得的互补决定区域(CDR)被富 集在所述的序列中，其中所述的序列是参与到所述抗原的识别过 程中的序列，所述的抗原是用于进行免疫的抗原。

在本发明中描述的所述方法具有的一个独特的特征是能够 从非人类的物种中对所述的重链互补决定区域3(CDR3)编码序 列进行有效的捕获并且将它们插入到人类免疫球蛋白骨架内。使 用这样的方法因此可能能够建立不同的抗体结合位点并且允许 尝试一种不同的三维空间，其中所述的抗体结合位点适合来自于 另外一个物种的所述的被捕获的可变重链互补决定区域3 (CDRH3)个体。这样的方法允许建立具有新的特异性的人类抗 体，与人类可变重链互补决定区域3(CDRH3)个体可以利用的 靶向相比，其中所述的人类抗体能够作用于一种不同范围的靶向 类别以及表位。此外，这样的新的抗体能够编码人类骨架以及互 补决定区域1(CDR1)以及互补决定区域2(CDR2)区域并且 因此适合用于进行人类的治疗。

在这个方法中，被选定的蛋白质结构域，例如是抗体可变结 构域，可以是被进行过修饰的，其中所述的修饰是通过导入一种 填充序列的方式来实现的，所述的填充序列将可以被用来作为经 过多样性处理的序列的整合位点。经过整合作用，所述的填充片 段可以被完全的去除，因此留下完整的所述的受体蛋白质的编码 区域以及所述被插入的蛋白质片段(即，所述的互补决定区域 (CDR))。这种整合事件是由一种IIs型限制性酶的使用来进行 介导的，其中所述的限制性酶能够对存在于所述的DNA序列之 中的一个指定的位点进行识别但是在距离这一位点指定的距离 处对所述的DNA进行切断。这种途径具有两个主要的优点：(1) 它能够允许对所述的受体骨架进行消化但是不会对它们的编码 序列产生影响(不需要进行工程化处理来添加沉默的限制性位 点)；以及(2)它能够允许所述的天然的经过多样性处理的序列 进行消化以及克隆，而明显不会占有具有兼容性的限制性位点。

正如上文中所描述的，为了建立抗体序列的文库和/或进行抗 体序列的展示所进行的先前的尝试与本发明中提供的所述方法 存在不同。例如，一些方法需要对所述的每一个互补决定区域 (CDR)进行移植，例如在美国专利No.6300064中描述的方法， 在所述的方法中需要在所述的每一个互补决定区域(CDR)的边 界上进行工程化处理来建立限制性酶位点，而不仅仅是在所述的 可变重链互补决定区域3(CDR H3)区域内。在其他的方法中， 对来自于天然来源的互补决定区域(CDR)序列进行扩增以及重 新排列，正如在例如美国专利No.6989250中所描述的。在一些 方法中，例如在美国专利申请公开号No.20060134098中描述的 那些方法中，将来自于一个小鼠(或者其他的哺乳动物)的序列 添加到一个人类骨架中去，这样一来上述得到的抗体具有来源于 鼠科动物的互补决定区域1(CDR1)以及互补决定区域2(CDR2) 区域以及一个来源于人类的互补决定区域3(CDR3)区域。其他 的方法，例如在美国专利申请公开号No.20030232333中描述的 那些方法中，建立这样的抗体，所述的抗体具有合成性的互补决 定区域1(CDR1)和/或互补决定区域1(CDR1)/互补决定区域 2(CDR2)区域以及一个天然的互补决定区域3(CDR3)区域。 然而，这些方法都不能够提供这样的文库，其中所述的文库中含 有稳定的骨架区域以及经过了正确折叠的互补决定区域(CDR)。

在本发明中提供的所述方法能够设计出用于进行多样性克 隆的所述的抗体受体骨架。已经设计出一种策略，用于向所述的 选定的人类抗体结构域的互补决定区域3(CDR3)内导入多样性， 而能够避免对所述的原始骨架所具有的序列进行修饰。所述的策 略依靠的是在所述的免疫球蛋白编码区域之外所进行的IIs型限 制性位点的插入。这种类型的限制性酶能够对具有4-7个碱基对 的不对称的以及未中断的序列进行识别但是在高达20个碱基的 指定距离处切断DNA，其中所述的碱基是独立于在所述的切断 位点上发现的DNA序列的。为了利用这个系统将所述的经过多 样性处理的序列克隆至选定的骨架之内，对受体骨架进行设计， 其中所述的受体骨架中含有一个用以取代所述的互补决定区域3 (CDR3)的填充DNA片段，在所述的填充DNA片段中包括两 个IIs型限制性位点。相类似的，利用侧翼序列来建立经过多样 性处理的DNA序列，其中在所述的侧翼序列中包括IIs型限制性 位点。假设由所述的限制性酶生成的所述粘性末端是具有兼容性 的并且所述的阅读框保持不变，所述的DNA片段可以被连结至 所述的受体骨架之内并且在所述的新的受体抗体骨架环境中对 所编码的互补决定区域3(CDR3)进行恢复(附图2)。

在本发明中提供的所述方法能够捕获天然的互补决定区域 (CDR)多样性。在所述的策略中同样需要利用到IIs型限制性 酶，其中对所述的策略进行研发从而使其捕获到经过多样性处理 的蛋白质片段，用来作为一种多样性来源。作为一个例子，可以 设计一种寡核苷酸引物，其中所述的寡核苷酸引物对编码所述的 免疫球蛋白所具有的可变重链互补决定区域3(CDR H3)的DNA 序列的侧翼区域具有特异性，即，对所述的可变区域所具有的侧 翼区域3(FR3)以及侧翼区域4(FR4)具有特异性。这样的寡 核苷酸在其5’末端上含有一个IIs型限制性酶的位点，而它们的 3’部分能够与所述的靶向DNA序列进行匹配。所使用到的所述 的限制性酶位点优选的是这样的一种酶，所述的酶能够对远离所 述的DNA识别位点处的DNA进行切断，其中所述的限制性酶位 点例如是FokI。这对于所述的方法而言是一个关键的要素，因为 它能够允许所述的天然DNA序列进行有效的扩增，这是因为它 能够在所述的引物所具有的3’末端与存在于所述的可变重链互 补决定区域3(CDR H3)侧翼之上的所述DNA之间保持一种良 好的匹配状态，同时能够允许所述的可变重链互补决定区域3 (CDRH3)编码序列所进行的切离，其中所述的切离是通过在所 述的互补决定区域(CDR)与骨架区域之间的边界上所进行的 DNA的断裂来实现的(附图3)。对于使用那些在它们的识别位 点上进行DNA的切断的II型酶类而言，对所述的互补决定区域 (CDR)编码序列所进行的这种精确的切离是非常困难的，这是 因为所述的相对应的限制性位点并不是存在于所述的天然DNA 序列之中的并且在扩增的过程中进行这种位点的导入将是困难 的，这归因于较差的引物退火。因此这种方法能够允许所述的经 过多样性处理的蛋白质序列进行扩增并且能够将它们插入到任 意的受体抗体骨架之中，而不论被扩增的多样性的来源如何(附 图4)。

在本发明中所提供的方法能够制备一种核酸文库，其中每一 个核酸能够编码一个免疫球蛋白的可变结构域，所述的方法是通 过下述的步骤来实现的：(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其 中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域， 每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FR1)，第二个 骨架区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以及第四个骨架区 域(FR4)，其中所述的骨架区域1(FR1)与骨架区域2(FR2) 区域之间被一个互补决定区域1(CDR1)区域进行了间隔；所述 的骨架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个互补 决定区域2(CDR2)进行了间隔；并且所述的骨架结构3(FR3) 以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个填充核酸序列进行了间 隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识 别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的核酸序 列进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其 中所述的核酸序列能够编码互补决定区域3(CDR3)区域或者编 码氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域 3(CDR3)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处 理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型 限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs型限制性酶对所述的大量 的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化，其中 所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域3(CDR3)区域， 所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域3(CDR3)区域 所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型 限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步 骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进 行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限 制性酶识别位点进行结合；以及(d)将所述的经过消化的核酸 序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化 的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定 区域3(CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决 定区域3(CDR3)所具备的功能，这样一来可以利用所述的核酸 序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域3(FR3)以及骨 架区域4(FR4)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够 编码所述的互补决定区域3(CDR3)区域，所述的氨基酸序列能 够实现一种互补决定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且一 个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中 所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限 制性酶识别位点。

在本发明中所提供的方法能够制备一种核酸文库，其中每一 个核酸能够编码一个免疫球蛋白的可变结构域，所述的方法是通 过下述的步骤来实现的：(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其 中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域， 每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域(FR1)，第二个 骨架区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以及第四个骨架区 域(FR4)，其中所述的骨架区域1(FR1)与骨架区域2(FR2) 区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸 序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制 性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔；所述的骨 架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个互补决定 区域2(CDR2)进行了间隔，并且所述的骨架结构3(FR3)以 及骨架结构4(FR4)区域之间被一个互补决定区域3(CDR3) 进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中 所述的核酸序列能够编码互补决定区域1(CDR1)区域或者编码 氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域1 (CDR1)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处 理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型 限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs型限制性酶对所述的大量 的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化，其中 所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域1(CDR1)区域， 所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域1(CDR1)区域 所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型 限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步 骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进 行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限 制性酶识别位点进行结合；以及(d)将所述的经过消化的核酸 序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化 的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定 区域1(CDR1)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决 定区域1(CDR1)所具备的功能，这样一来可以利用所述的核酸 序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域1(FRI)以及骨 架区域2(FR2)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够 编码所述的互补决定区域1(CDR1)区域，所述的氨基酸序列能 够实现一种互补决定区域1(CDR1)区域所具备的功能，并且一 个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中 所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限 制性酶识别位点。

在本发明中所提供的方法能够制备一种核酸文库，其中每一 个核酸能够编码一个免疫球蛋白的可变结构域，所述的方法是通 过下述的步骤来实现的：(a)提供大量的受体骨架核酸序列，其 中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白可变结构域， 每一个受体骨架核酸序列中包括第一个骨架区域(FR1)，第二个 骨架区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以及第四个骨架区 域(FR4)，其中所述的骨架区域1(FR1)与骨架区域2(FR2) 区域之间被一个互补决定区域1(CDR1)进行了间隔，所述的骨 架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区域之间被一个填充核酸 序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs 型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个 随机的核酸序列进行了间隔；并且所述的骨架结构3(FR3)以 及骨架结构4(FR4)区域之间被一个互补决定区域3(CDR3) 进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的核酸序列，其中 所述的核酸序列能够编码互补决定区域2(CDR2)区域或者编码 氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域2 (CDR2)区域所具备的功能，其中所述的大量的经过多样性处 理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包括一个IIs型 限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs型限制性酶对所述的大量 的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进行消化，其中 所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域2(CDR2)区域， 所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区域2(CDR2)区域 所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b)中所述的IIs型 限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs型限制性酶对步 骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的填充核酸序列进 行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a)中所述的IIs型限 制性酶识别位点进行结合；以及(d)将所述的经过消化的核酸 序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤(c)中所述的经过消化 的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定 区域2(CDR2)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决 定区域2(CDR2)所具备的功能，这样一来可以利用所述的核酸 序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域2(FR2)以及骨 架区域3(FR3)区域之间进行间隔，其中所述的核酸序列能够 编码所述的互补决定区域2(CDR2)区域，所述的氨基酸序列能 够实现一种互补决定区域2(CDR2)区域所具备的功能，并且一 个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重新建立，其中 所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所述的IIs型限 制性酶识别位点。

在一些实施方式中，在上文中列出的所述方法的步骤(a) 以及步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点可以被不同的IIs 型限制性酶进行识别。例如，在一些实施方式中，所述的IIs型 限制性酶识别位点是BsmBI识别位点，BsaI识别位点，FokI识 别位点或者是上述识别位点的组合。

在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列来自于一种人 类基因序列。例如，在一些实施方式中，所述的人类序列是一种 人类重链可变基因序列或者是来自于一种人类重链可变基因序 列的序列。在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因序列选 自：重链可变序列1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69(VH1-69)， 重链可变序列1-18(VH1-18)，重链可变序列3-30(VH3-30)， 重链可变序列3-48(VH3-48)，重链可变序列3-23(VH3-23)， 以及重链可变序列5-51(VH5-51)。

在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类κ轻链可变 基因序列或者是来自于一种人类κ轻链可变基因序列的序列。例 如，在一些实施方式中，所述的人类κ轻链可变基因序列选自： κ轻链可变序列1-33(VK1-33)，κ轻链可变序列1-39(VK1-39)， κ轻链可变序列3-11(VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)， 以及κ轻链可变序列3-20(VK3-20)。

在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变 基因序列或者是来自于一种人类λ轻链可变基因序列的序列。例 如，在一些实施方式中，所述的人类λ轻链可变基因序列选自： λ轻链可变序列1-44(VL1-44)以及λ轻链可变序列1-51 (VL1-51)。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包 括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然 存在的互补决定区域3(CDR3)序列，来自于人类的天然存在的 免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋 白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的 环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具 有多样性的多肽。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域3(CDR3)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列或者来自于这样的 免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类 中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫 原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为 被暴露在一种特定的抗原之下。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包 括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然 存在的互补决定区域1(CDR1)序列，来自于人类的天然存在的 免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋 白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的 环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具 有多样性的多肽。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域1(CDR1)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列或者来自于这样的 免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类 中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫 原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为 被暴露在一种特定的抗原之下。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域1(CDR1)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包 括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然 存在的互补决定区域2(CDR2)序列，来自于人类的天然存在的 免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋 白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的 环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具 有多样性的多肽。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域2(CDR2)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列或者来自于这样的 免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类 中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫 原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为 被暴露在一种特定的抗原之下。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域2(CDR2)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至 少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻 链受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，在本发明提供的所述方法中同样包括下 述的步骤：(e)将步骤(d)中所述的核酸文库克隆至一种表达 载体之中，其中所述的核酸文库能够编码免疫球蛋白的可变结构 域，以及(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的表达载体 进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白可变结构 域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中所述的免 疫球蛋白可变结构域是由所述的文库进行编码的。

在一些实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。 在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。

在本发明中提供的所述方法能够建立或者制备一种靶向特 异性抗体、所述抗体的抗体可变区域或者所述抗体的一部分，所 述的方法是通过下述的步骤来实现的：(a)提供大量的受体骨架 核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白 可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域 (FR1)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以 及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架区域1(FR1)与骨 架区域2(FR2)区域之间被一个互补决定区域1(CDR1)区域 进行了间隔，所述的骨架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区 域之间被一个互补决定区域2(CDR2)区域进行了间隔，并且所 述的骨架结构3(FR3)以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个 填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列中包括至少 两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶识别位点之 间被一个随机的核酸序列进行了间隔；(b)提供大量的经过多样 性处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域 3(CDR3)区域或者编码氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实 现所述的互补决定区域3(CDR3)区域所具备的功能，其中所述 的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每一个序列在其每一 个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs型 限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一个或者对所述的氨 基酸序列进行消化，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决 定区域3(CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补 决定区域3(CDR3)区域所具备的功能，所述的限制性酶能够与 步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用 一种IIs型限制性酶对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架 之中的填充核酸序列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤 (a)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合；(d)将步骤(c) 中所述的经过消化的核酸序列或者所述的氨基酸序列连结至步 骤(c)中所述的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码 所述的互补决定区域3(CDR3)区域，所述的氨基酸序列能够实 现所述的互补决定区域3(CDR3)所具备的功能，这样一来可以 利用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域3 (FR3)以及骨架区域4(FR4)区域之间进行间隔，其中所述的 核酸序列能够编码所述的互补决定区域3(CDR3)区域，所述的 氨基酸序列能够实现一种互补决定区域3(CDR3)区域所具备的 功能，并且一个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重 新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所 述的IIs型限制性酶识别位点；(e)将步骤(d)中所述的核酸文 库克隆至一种表达载体之中，其中所述的核酸文库能够编码免疫 球蛋白可变结构域；(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的 表达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白 可变结构域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中 所述的免疫球蛋白可变结构域是由所述的文库进行编码的；(g) 利用一种靶向抗原与步骤(f)中所述的大量的免疫球蛋白结构 域进行接触；以及(h)确定哪些被表达的免疫球蛋白可变结构 域编码序列能够与所述的靶向抗原进行结合。

在本发明中提供的所述方法能够建立或者制备一种靶向特 异性抗体、所述抗体的抗体可变区域或者所述抗体的一部分，所 述的方法是通过下述的步骤来实现的：(a)提供大量的受体骨架 核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白 可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域 (FR1)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以 及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架区域1(FR1)与骨 架区域2(FR2)区域之间被一个填充核酸序列进行了间隔，其 中所述的填充核酸序列中包括至少两个IIs型限制性酶识别位 点，所述的两个限制性酶识别位点之间被一个随机的核酸序列进 行了间隔，所述的骨架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区域 之间被一个互补决定区域2(CDR2)区域进行了间隔，并且所述 的骨架结构3(FR3)以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个互 补决定区域3(CDR3)进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性 处理的核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域1 (CDR1)区域或者编码氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实 现所述的互补决定区域1(CDR1)区域所具备的功能，其中所述 的大量的经过多样性处理的核酸序列中的每一个序列在其每一 个末端上包括一个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs型 限制性酶对所述的大量的核酸序列中的每一个或者对所述的氨 基酸序列进行消化，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决 定区域1(CDR1)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补 决定区域1(CDR1)区域所具备的功能，所述的限制性酶能够与 步骤(b)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用 一种IIs型限制性酶对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架 之中的填充核酸序列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤 (a)中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合；(d)将步骤(c) 中所述的经过消化的核酸序列或者所述的氨基酸序列连结至步 骤(c)中所述的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码 所述的互补决定区域1(CDR1)区域，所述的氨基酸序列能够实 现所述的互补决定区域1(CDR1)所具备的功能，这样一来可以 利用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域1 (FR1)以及骨架区域2(FR2)区域之间进行间隔，其中所述的 核酸序列能够编码所述的互补决定区域1(CDR1)区域，所述的 氨基酸序列能够实现一种互补决定区域1(CDR1)区域所具备的 功能，并且一个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重 新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所 述的IIs型限制性酶识别位点；(e)将步骤(d)中所述的核酸文 库克隆至一种表达载体之中，其中所述的核酸文库能够编码免疫 球蛋白可变结构域；(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的 表达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白 可变结构域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中 所述的免疫球蛋白可变结构域是由所述的文库进行编码的；(g) 利用一种靶向抗原与步骤(f)中所述的大量的免疫球蛋白结构 域进行接触；以及(h)确定哪些被表达的免疫球蛋白可变结构 域编码序列能够与所述的靶向抗原进行结合。

在本发明中提供的所述方法能够建立或者制备一种靶向特 异性抗体、所述抗体的抗体可变区域或者所述抗体的一部分，所 述的方法是通过下述的步骤来实现的：(a)提供大量的受体骨架 核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码截然不同的免疫球蛋白 可变结构域，每一个受体骨架核酸序列中含有第一个骨架区域 (FR1)，第二个骨架区域(FR2)，第三个骨架区域(FR3)，以 及第四个骨架区域(FR4)，其中所述的骨架区域1(FR1)与骨 架区域2(FR2)区域之间被一个互补决定区域1(CDR1)进行 了间隔，所述的骨架区域2(FR2)与骨架区域3(FR3)区域之 间被一个填充核酸序列进行了间隔，其中所述的填充核酸序列中 包括至少两个IIs型限制性酶识别位点，所述的两个限制性酶识 别位点之间被一个随机的核酸序列进行了间隔，并且所述的骨架 结构3(FR3)以及骨架结构4(FR4)区域之间被一个互补决定 区域3(CDR3)进行了间隔；(b)提供大量的经过多样性处理的 核酸序列，其中所述的核酸序列能够编码互补决定区域2(CDR2) 区域或者编码氨基酸序列，所述的氨基酸序列能够实现所述的互 补决定区域2(CDR2)区域所具备的功能，其中所述的大量的经 过多样性处理的核酸序列中的每一个序列在其每一个末端上包 括一个IIs型限制性酶识别位点；(c)利用一种IIs型限制性酶对 所述的大量的核酸序列中的每一个或者对所述的氨基酸序列进 行消化，其中所述的核酸序列能够编码所述的互补决定区域2 (CDR2)区域，所述的氨基酸序列能够实现所述的互补决定区 域2(CDR2)区域所具备的功能，所述的限制性酶能够与步骤(b) 中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合，并且利用一种IIs 型限制性酶对步骤(a)中所述的来自于所述的受体骨架之中的 填充核酸序列进行消化，其中所述的限制性酶能够与步骤(a) 中所述的IIs型限制性酶识别位点进行结合；(d)将步骤(c)中 所述的经过消化的核酸序列或者所述的氨基酸序列连结至步骤 (c)中所述的受体骨架之中，其中所述的核酸序列能够编码所 述的互补决定区域2(CDR2)区域，所述的氨基酸序列能够实现 所述的互补决定区域2(CDR2)所具备的功能，这样一来可以利 用所述的核酸序列或者所述的氨基酸序列对所述的骨架区域2 (FR2)以及骨架区域3(FR3)区域之间进行间隔，其中所述的 核酸序列能够编码所述的互补决定区域2(CDR2)区域，所述的 氨基酸序列能够实现一种互补决定区域2(CDR2)区域所具备的 功能，并且一个完整的免疫球蛋白可变结构域编码序列被得以重 新建立，其中所述的编码序列中不含有步骤(a)以及(b)中所 述的IIs型限制性酶识别位点；(e)将步骤(d)中所述的核酸文 库克隆至一种表达载体之中，其中所述的核酸文库能够编码免疫 球蛋白可变结构域；(f)在一个宿主细胞内对步骤(e)中所述的 表达载体进行转化并且在足以能够使所述的大量的免疫球蛋白 可变结构域进行表达的条件下对所述的宿主细胞进行培养，其中 所述的免疫球蛋白可变结构域是由所述的文库进行编码的；(g) 利用一种靶向抗原与步骤(f)中所述的大量的免疫球蛋白结构 域进行接触；以及(h)确定哪些被表达的免疫球蛋白可变结构 域编码序列能够与所述的靶向抗原进行结合。

在一些实施方式中，在本发明所提供的所述方法中进一步的 包括下述的步骤：(i)对所述的免疫球蛋白可变结构域编码序列 进行测序，其中所述的编码序列能够与所述的靶向抗原进行结 合。

在一些实施方式中，在步骤(a)以及步骤(b)中所述的IIs 型限制性酶识别位点可以被不同的IIs型限制性酶进行识别。

在一些实施方式中，所述的IIs型限制性酶识别位点是BsmBI 识别位点，BsaI识别位点，FokI识别位点或者是上述识别位点的 组合。

在一些实施方式中，所述的受体骨架核酸序列来自于一种人 类基因序列。例如，在一些实施方式中，所述的人类序列是一种 人类重链可变基因序列或者是来自于一种人类重链可变基因序 列的序列。例如，在一些实施方式中，所述的人类重链可变基因 序列选自：重链可变序列1-2(VH1-2)，重链可变序列1-69 (VH1-69)，重链可变序列1-18(VH1-18)，重链可变序列3-30 (VH3-30)，重链可变序列3-48(VH3-48)，重链可变序列3-23 (VH3-23)，以及重链可变序列5-51(VH5-51)。

在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类κ轻链可变 基因序列或者是来自于一种人类κ轻链可变基因序列的序列。例 如，在一些实施方式中，所述的人类κ轻链可变基因序列选自： κ轻链可变序列1-33(VK1-33)，κ轻链可变序列1-39(VK1-39)， κ轻链可变序列3-11(VK3-11)，κ轻链可变序列3-15(VK3-15)， 以及κ轻链可变序列3-20(VK3-20)。

在一些实施方式中，所述的人类序列是一种人类λ轻链可变 基因序列或者是来自于一种人类λ轻链可变基因序列的序列。例 如，在一些实施方式中，所述的人类λ轻链可变基因序列选自： λ轻链可变序列1-44(VL1-44)以及λ轻链可变序列1-51 (VL1-51)。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包 括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然 存在的互补决定区域3(CDR3)序列，来自于人类的天然存在的 免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋 白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的 环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具 有多样性的多肽。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域3(CDR3)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列或者来自于这样的 免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类 中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫 原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为 被暴露在一种特定的抗原之下。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域3(CDR3)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包 括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然 存在的互补决定区域1(CDR1)序列，来自于人类的天然存在的 免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋 白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的 环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具 有多样性的多肽。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域1(CDR1)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列或者来自于这样的 免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类 中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫 原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为 被暴露在一种特定的抗原之下。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列能够实现一种互补决 定区域1(CDR1)区域所具备的功能，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括合成性的序列。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸包 括下述的序列，或者来自于下述的序列，所述的序列选自：天然 存在的互补决定区域2(CDR2)序列，来自于人类的天然存在的 免疫球蛋白(Ig)序列，来自于哺乳动物的天然存在的免疫球蛋 白(Ig)序列，来自于存在于哺乳动物中的T细胞受体所具有的 环状区域内的天然存在的序列，以及其他的天然存在的大量的具 有多样性的多肽。

在一些实施方式中，所述的大量的经过多样性处理的核酸能 够编码互补决定区域2(CDR2)区域，并且所述的大量的经过多 样性处理的核酸包括这样的免疫球蛋白序列或者来自于这样的 免疫球蛋白序列，其中所述的免疫球蛋白序列是天然存在于人类 中的免疫球蛋白序列，所述的人类已经被暴露在一种特定的免疫 原之下，或者是来自于动物中的序列，所述的动物已经被认定为 被暴露在一种特定的抗原之下。

在一些实施方式中，所述的大量的受体骨架核酸序列包括至 少一种可变重链(VH)受体骨架核酸序列以及至少一种可变轻 链受体骨架核酸序列的混合。

在一些实施方式中，所述的表达载体是一种噬菌体载体。在 一些实施方式中，所述的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。

除非另外定义，在本发明中所使用的科学术语以及技术术语 将具有本领域普通技术人员普遍所理解的含义。进一步的，除非 上下文中另有需要，单数的术语将包括复数形式并且复数的术语 将包括单数形式。一般而言，在本发明所描述的细胞和组织培养， 分子生物学，以及蛋白质和寡核苷酸或者多核苷酸化学以及杂交 中利用的命名学以及技术是本领域中熟知的并且被普遍使用的。 标准的技术被用来进行重组DNA，寡核苷酸的合成，以及组织 的培养和转化(例如，电穿孔，脂质转染法)。根据制造商的说 明书或者根据本领域普遍完成的或者根据本发明中的描述来实 现酶反应以及纯化技术。前述的技术以及操作步骤一般而言是根 据本领域中熟知的常规方法以及按照在本说明书中引用和讨论 到的各种不同的一般性的以及更具体的参考文献中的描述来实 现的。参见例如Sambrook等人所著的Molecular Cloning：A  Laboratory Manual《分子克隆实验室手册》(第2版，冷泉港实验 室出版社，冷泉港，纽约(1989年))。在本发明所描述的分析化 学，合成有机化学，以及药物和制药化学中利用的命名学以及实 验室操作步骤和技术是本领域中熟知的并且被普遍使用的。标准 的技术被用来进行化学合成，化学分析，药物的制备，配制，以 及递送，以及对患者的治疗。

当根据本发明公开进行使用时，除非另外指明，下述的术语 将被理解为具有下述的含义：

当在本发明中进行使用时，所述的术语“抗体”指的是免疫 球蛋白分子以及免疫球蛋白(Ig)分子所具有的免疫活性部分， 即，含有一个能够与一种抗原进行特异性的结合(发生免疫反应) 的抗原结合位点的分子。“特异性的结合”或者“发生免疫反应” 或者“免疫特异性的结合”意味着所述的抗体能够与所期望的抗 原中的一个或者多个抗原决定簇发生反应并且不会与其他多肽 发生反应或者以低得多的亲和性(平衡结合常数＞10^-6)进行结合。 抗体包括，但不局限于，多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体， dAb(结构域抗体)，单链抗体，F_ab，F_ab’，以及F _(ab’)2片段，单 链抗体片段(scFv)，以及F_ab表达文库。

已知所述的基本抗体结构单元包括一个四聚体。每一个四聚 体是由两个相同的多肽链对组成的，每一个对中含有一条“轻” 链(大约25千道尔顿)以及一条“重”链(大约50-70千道尔 顿)。在每一条链的氨基末端部分包括一个具有大约100至110 个或者更多个氨基酸的可变区域，所述的可变区域主要负责进行 抗原的识别。在每一条链的羧基末端部分定义了一个恒定区域， 所述的恒定区域主要负责效应器功能。一般而言，从人类中获得 的抗体分子涉及到下述类型中的任意一个：免疫球蛋白G(IgG)， 免疫球蛋白M(IgM)，免疫球蛋白A(IgA)，免疫球蛋白E(IgE) 以及免疫球蛋白D(IgD)，这些类型通过存在于所述分子中的所 述重链所具有的性质来形成彼此之间的差异。某些类型也存在亚 类型，例如免疫球蛋白G1(IgG1)，免疫球蛋白G2(IgG2)，以 及其他。此外，在人类中，所述的轻链可以是一条κ轻链或者是 一条λ轻链。

当在本发明中进行使用时，所述的术语“单克隆抗体(MAb)” 或者“单克隆抗体组合物”指的是一种抗体分子的群体，所述的 抗体分子仅含有一种分子类型的抗体分子，其中所述的抗体分子 是由一个唯一的轻链基因产物以及一个唯一的重链基因产物所 构成的。特别是，在所述群体的所有分子中，所述单克隆抗体的 互补决定区域(CDR)是相同的。单克隆抗体含有一个抗原结合 位点，能够与所述抗原上的一个特定的表位发生免疫反应，其中 所述抗原的特征在于对其具有唯一的结合亲和性。

所述的术语“抗原结合位点”或者“结合部分”指的是参与 抗原结合的所述的免疫球蛋白分子中的部分。所述的抗原结合位 点是由所述的重链(“H”)以及轻链(“L”)上所具有的N-末端 可变(“V”)区域上的氨基酸残基形成的。三个高度可变的伸展 存在于所述的重链以及轻链的可变区域内，被称之为“超变区 域”，其中所述的超变区域介于较为保守的侧翼伸展之间，所述 的伸展被称之为“骨架区域”或者“FR”。因此，所述的术语“骨 架区域(FR)”指的是天然存在于免疫球蛋白的超变区域之间或 者邻近超变区域的氨基酸序列。在一个抗体分子中，一条轻链上 所具有的三个超变区域与一条重链上所具有的三个超变区域在 三维空间内相对于彼此进行排列从而形成了一个抗原结合表面。 所述的抗原结合表面与一种结合抗原的所述三维表面是互补的， 并且所述的重链以及轻链中的每一条上所具有的所述三个超变 区域被称之为“互补决定区域”或者“CDR”。依照在Kabat  Sequences of Proteins of Immunological Interest《具有免疫学兴趣 的蛋白质的Kabat序列》中的定义(National Institutes of Health， Bethesda，Md.(1987年以及1991年))，或者Chothia & Lesk(于 1987年)在J.Mol.Biol.《分子生物学杂志》196：901-917中发 表的文章，Chothia等人(于1989年)在Nautre《自然》342： 878-883中发表的文章，对每一个结构域内的氨基酸进行分配。

当在本发明中进行使用时，所述的术语“表位”包括能够与 一种免疫球蛋白、一个单链抗体片段(scFv)、或者一种T细胞 受体进行特异性结合的任何的蛋白质决定簇。所述的术语“表位” 包括能够与一种免疫球蛋白或者一种T细胞受体进行特异性结 合的任何的蛋白质决定簇。表位决定簇通常是由分子的化学活性 表面基团(groupings)例如氨基酸或者糖侧链构成的并且通常具 有特异性的三维结构特征，以及特异性的电荷特征。例如，抗体 可以反向作用于一种多肽所具有的N-末端肽或者C-末端肽。当 所述的解离常数≤1微摩时，我们说一种抗体与一种抗原发生了 特异性的结合，其中所述的解离常数例如是≤100纳摩，优选的 ≤10纳摩并且更为优选的≤1纳摩。

当在本发明中进行使用时，所述的术语“免疫结合”以及“免 疫结合特性”指的是发生在一个免疫球蛋白分子与一种抗原之间 的非共价相互作用类型，其中所述的免疫球蛋白分子对于所述的 抗原而言是具有特异性的。所述的免疫结合相互作用所具有的强 度或者亲和性可以通过所述相互作用的解离常数(K_d)来表达， 其中较小的解离常数代表了较高的亲和性。可以使用本领域熟知 的方法对所选取的多肽的免疫结合特性进行量化。有一种这样的 方法需要测量所述的抗原结合位点/抗原复合体的形成以及解离 的速率，其中那些速率取决于所述的构成复合体的配偶体的浓 度，所述相互作用的亲和性，以及能够在两个方向上同等的对所 述的速率产生影响的几何参数。因此，可以通过对所述的浓度以 及所述的实际结合速率和实际解离速率进行计算，从而同时确定 出所述的“结合速率常数(K_on)”以及“解离速率常数(K_off)” (参见于(1993年)在Nature《自然》361：186-87中发表的文 章)。所述的解离速率常数与结合速率常数的比值能够消除不涉 及到亲和性的全部参数，并且等于所述的解离常数(K_d)(参见， 一般而言，Davies等人(于1990年)在Annual Rev Biochem《生 物化学年度评论》59：439-473中发表的文章)。当所述的平衡结 合常数(K_d)≤1微摩时，例如，≤100纳摩，优选的≤10纳摩， 并且更为优选的≤1纳摩时，可以说本发明所述的抗体能够与其 靶向进行特异性的结合，其中所述的平衡结合常数是通过例如放 射性配体结合检测或者本领域技术人员已知的类似检测测量得 到的。

当在本发明中进行使用时，所述的术语“分离的多核苷酸” 应当指的是一种基因组多核苷酸，cDNA多核苷酸，或者合成来 源的多核苷酸或者是上述多核苷酸的某种组合，凭借所述的来 源，使得所述的“分离的多核苷酸”(1)不与一种多核苷酸的全 部或者一部分相互关联，其中在所述的多核苷酸中所述的“分离 的多核苷酸”是天然存在的，(2)与一种多核苷酸发生了可操作 性的连接，其中所述的多核苷酸是在天然状态下不发生连接的， 或者(3)并不天然的作为一个更长的序列中的一部分。依照本 发明所述的多核苷酸包括这样的核酸分子，所述的核酸分子是能 够编码在本发明中所述的重链免疫球蛋白分子的核酸分子，以及 能够编码所述的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。

在本发明中所提及的所述术语“分离的蛋白质”指的是一种 cDNA蛋白质，重组RNA蛋白质，或者合成来源的蛋白质或者 上述蛋白质的某种组合，凭借所述的来源、或者衍生的来源，所 述的“分离的蛋白质”(1)不与天然存在的蛋白质相互关联，(2) 不含有具有相同来源的其他蛋白质，例如，不含有海洋蛋白，(3) 通过一种来自于不同物种的细胞进行表达，或者(4)不是天然 存在的。

当在本发明中进行使用时，所述的术语“多肽”被作为一个 通称进行使用，指的是天然蛋白质，多肽序列的片段，或者多肽 序列的类似物。因此，天然蛋白质片段以及类似物属于所述的多 肽属的种类。根据本发明的多肽包括在本发明中所述的重链免疫 球蛋白分子，以及所述的轻链免疫球蛋白分子，以及由包括所述 的重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子的组合所形成抗 体分子，并且反之亦然，也包括其片段以及类似物，其中所述的 轻链免疫球蛋白分子是例如是一种κ轻链免疫球蛋白分子。

当在本发明中进行使用时，所述的术语“天然存在的”在被 应用于宾语中时指的是这样的事实：所述的宾语是可以在自然界 中发现的。例如，一种存在于所述的有机体(包括病毒)中的多 肽或者多核苷酸序列，其中所述的多肽或者多核苷酸序列可以从 一种天然来源中被分离出来，并且其没有被实验室或者其他的人 进行有意的修饰，则这样的多肽或者多核苷酸序列是天然存在 的。

在本发明中所使用的所述术语“可操作性的连接”指的是被 进行这种描述的组分所处的位置关系允许它们能够以它们既定 的方式来发挥功能。一个调控序列与一个编码序列进行“可操作 性的连接”，指的是所述的调控序列以这样的一种方式进行连结， 使得在与所述的调控序列相兼容的条件下，能够完成所述的编码 序列的表达。

当在本发明中进行使用时，所述的术语“控制序列”指的是 这样的一种多核苷酸序列，所述的多核苷酸序列对于实现所述编 码序列的表达以及加工而言是必不可少的，其中所述的编码序列 是与所述的多核苷酸序列进行连结的。这样的控制序列所具有的 性质存在差异，这取决于存在于原核生物中的宿主有机体，这样 的控制序列一般而言包括存在于真核细胞中的启动子，核糖体结 合位点，以及转录终止序列，一般而言，这样的控制序列包括启 动子以及转录终止序列。所述的术语“控制序列”在最低程度上 意在包括所有这样的组分，所述的组分的存在对于表达以及加工 而言是必不可少的，并且还可以包括其他的组分，其中所述的其 他的组分的存在是有利的，例如，前导序列以及融合配偶体序列 (fusion partner sequences)。在本发明中所提及的所述术语“多 核苷酸”指的是具有至少10个碱基长度的核苷的聚合硼，可以 是核糖核苷或者脱氧核糖核苷或者是上述任何类型的核苷的修 饰形式。所述的术语包括单链形式的DNA以及双链形式的DNA。

当在本发明中进行使用时，所述的二十种常规的氨基酸以及 它们的缩略语是依照常规的用法来进行使用的。参见Immunology - A Synthesis《免疫学合成方法》(第二版，E.S.Golub以及 D.R.Gren编辑，Sinauer Associates，Sunderland Mass，(1991年))。 所述的二十种常规氨基酸所具有的立体异构体(例如，D-氨基 酸)，非天然氨基酸例如α-，α-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸， 乳酸，以及其他非常规的氨基酸同样可能成为本发明所述的多肽 中的适合的组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟基脯氨酸，γ- 羧基谷氨酸盐，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰基赖氨酸， O-磷酸化丝氨酸，N-乙酰基丝氨酸，N-甲酰基甲硫氨酸，3-甲基 组氨酸，5-羟基赖氨酸，σ-N-甲基精氨酸，以及其他类似的氨基 酸以及亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。依照标准的用法以及 惯例，在本发明中所使用的所述多肽标记中，所述的左例方向是 所述的氨基末端方向而右侧的方向是所述的羧基末端方向。

当被应用于多肽时，所述的术语“本质上的同一性”指的是 当进行最佳比对时，例如通过使用默认间隙重量的GAP程序或 者BESTFIT程序进行比对时，两个肽序列享有至少80％的序列 同一性，优选为至少90％的序列同一性，更加优选为至少95％的 序列同一性，并且最优选为至少99％的序列同一性。

优选的，在不相同的残基位置上进行了不同的保守性的氨基 酸取代。

保守性的氨基酸取代指的是具有类似侧链的残基之间的相 互替换能力。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸，丙 氨酸，缬氨酸，亮氨酸，以及异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链 的一组氨基酸是丝氨酸以及苏氨酸；具有含有酰胺的侧链的一组 氨基酸是天冬酰胺以及谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸 是苯丙氨酸，酪氨酸以及色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是 赖氨酸，精氨酸，以及组氨酸；并且具有含有硫的侧链的一组氨 基酸是半胱氨酸以及甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代的基团 是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨 酸，丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。

正如在本发明中所讨论的，可以预期的是，在抗体或者免疫 球蛋白分子所具有的氨基酸序列中发生的次级变化被包含在本 发明的范围之内，只要所述的氨基酸序列中的变化保持在至少 75％，更加优选为至少80％，90％，95％，并且最优选为99％。 特别的，保守性的氨基酸取代是可以预期的。保守性的取代是指 那些在一个氨基酸家族之内发生的取代，其中所述的一个氨基酸 家族之内的氨基酸指的是它们的侧链是相关的。遗传编码的氨基 酸一般被划分为下述的家族：(1)酸性氨基酸，为天冬氨酸，谷 氨酸；(2)碱性氨基酸，为赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非极 性氨基酸，为丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯 丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；以及(4)不带电荷的极性氨基酸， 为甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸， 酪氨酸。所述的亲水性的氨基酸包括精氨酸，天冬酰胺，天冬氨 酸，谷氨酰胺，谷氨酸，组氨酸，赖氨酸，丝氨酸，以及苏氨酸。 所述的疏水性的氨基酸包括丙氨酸，半胱氨酸，异亮氨酸，亮氨 酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，色氨酸，酪氨酸以及缬氨酸。 其他的氨基酸家族包括(i)丝氨酸以及苏氨酸，它们属于所述的 脂肪族-羟基家族；(ii)天冬酰胺以及谷氨酰胺，它们属于所述 的含有酰胺的家族；(iii)丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸以及异亮氨 酸，它们属于所述的脂肪族家族；以及(iv)苯丙氨酸，色氨酸， 以及酪氨酸，它们属于所述的芳香家族。例如，可以合理的预料 到，利用异亮氨酸或者缬氨酸对亮氨酸进行单独的取代，利用谷 氨酸对天冬氨酸进行单独的取代，利用丝氨酸对苏氨酸进行单独 的取代，或者利用一种结构相关的氨基酸对另一种氨基酸进行类 似的取代，这样的取代将不会对所得到的分子的结合或者性质产 生重要的影响，特别是当所述的取代不涉及到存在于一个骨架位 点内的氨基酸的时候。可以通过对所述的多肽衍生物所具有的特 异性活性进行检测的方式，来容易的确定一种氨基酸的变化是否 产生了一种功能性的肽。检测方法在本发明中进行了详细的描 述。本领域普通技术人员能够容易的制备出抗体或者免疫球蛋白 分子的片段或者类似物。优选的片段或者类似物的氨基末端以及 羧基末端出现在临近功能性结构域的边界处。可以通过将所述的 核苷酸序列和/或氨基酸序列的数据与公共序列数据库或者私人 序列数据库进行比较的方式，从而对结构性结构域以及功能性结 构域进行识别。优选的，使用计算机化的比较方法来识别序列基 序或者预测的蛋白质的构象结构域，其中所述的序列基序或者预 测的蛋白质的构象结构域是存在于具有已知的结构和/或功能的 其他蛋白质中的。用来对折叠成一种已知的三维结构的蛋白质序 列进行识别的方法是已知的。参见Bowie等人(于1991年)在 Science《科学》253：164中发表的文章。因此，前述的例子证 明了，本领域技术人员能够对这样的序列基序以及结构构象进行 识别，所述的序列基序以及结构构象可以被用来定义本发明所述 的结构性结构域以及功能性结构域。

优选的氨基酸取代是具有下述性质的那些：(1)降低了对于 蛋白质水解的易感性，(2)降低了对于氧化作用的易感性，(3) 改变了用于形成蛋白质复合体的结合亲和性，(4)改变了结合亲 和性，以及(5)赋予这样的类似物以其他的物理化学性质或者 功能性质，或者对上述性质进行了修饰。除了所述的天然存在的 肽序列之外，类似物可以包括序列的各种突变蛋白。例如，可以 在所述的天然存在的序列中(优选的在形成分子间接触的结构域 之外的多肽部分中)进行一个或者多个氨基酸的取代(优选的是 保守性的氨基酸取代)。一种保守性的氨基酸取代不应当在本质 上改变所述的母本序列所具有的结构性质(例如，一个发生取代 的氨基酸不应当趋向于破坏存在于所述的母本序列中的螺旋，或 者破坏能够定义所述的母本序列的其他类型的二级结构)。本领 域认可的多肽的二级结构以及三级结构的例子在下述文献中有 所描述：Proteins，Structure and Molecular Principles《蛋白质， 结构以及分子的基本原理》(Creighton编辑，W.H.Freeman and  Company，纽约(1984年))；Introdution to Protein Structure《蛋 白质结构的介绍》(C.Branden以及J.Tooze编辑，Garland出版 社，纽约N.Y.(于1991年))；以及Thornton等人(于1991年) 在Nature《自然》354：105中发表的文章。

当在本发明中进行使用时，所述的术语“标记”或者“标记 的”指的是一种可探测性的标记的导入，例如，通过向一种生物 素化的半族多肽中导入一个放射性标记的氨基酸或者连接物的 方式，其中能够利用标记的亲和素(例如，含有荧光标记或者酶 活性的链霉亲和素，所述的链霉亲和素可以通过光学方法或者量 热方法进行探测)对所述的放射性氨基酸或者连接物进行探测。 在某些情形中，所述的标记或者标记物同样可以是治疗性的。对 多肽以及糖蛋白进行标记的各种不同的方法是本领域已知的并 且可以对其进行使用。用于多肽的标记物的例子包括，但不局限 于，下述：放射性同位素或者放射性核(例如，³氢，¹⁴碳，¹⁵氮，³⁵硫，⁹⁰钇，⁹⁹锝，¹¹¹铟，¹²⁵碘，¹³¹碘)，荧光标记物(例 如，异硫氰酸荧光素(FITC)，若丹明，镧系元素的磷化物)，酶 标记物(例如，辣根过氧化物酶，p-半乳糖苷酶，荧光素酶，碱 性磷酸酶)，化学发光试剂，生物素化的基团，由二级报告物识 别出的预先确定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列，次级抗 体的结合位点，金属结合结构域，表位标签)。在一些实施方式 中，标记物是通过各种不同长度的间隔臂进行连接的，从而降低 了潜在的位阻现象。当在本发明中进行使用时，所述的术语“药 物试剂或者药物”指的是这样的一种化学化合物或者组合物，当 将其恰当的给患者施用时，所述的化学化合物或者组合物能够诱 发一种期望的治疗效应。

本发明中的其他的化学术语是依照本领域常规的用法进行 使用的，所述的常规用法是例如在The McGraw-Hill Dictionary of  Chemical Terms《McGraw-Hill化学术语词典》(Parker S.编辑， McGraw-Hill，圣弗朗西斯科(1985年))中所进行列举的。

当本发明中进行使用时，所述的术语“本质上纯的”指的是 一个目标种类是以占主要地位的种类而存在的(即，以摩尔计， 其比存在于所述的组合物之中的任何的各个其他种类都更加充 足)，并且优选的当一种本质上纯化的部分是一个组合物时，在 所述的组合物中所述的目标种类包含了占全部存在的大分子种 类的至少大约50％(以摩尔计)。

一般而言，一种本质上纯的组合物将包括占存在于所述的组 合物中的全部大分子种类的至少大约80％，更加优选为至少大约 85％，90％，95％，以及99％。最优选的，所述的目标种类被纯 化为具有实质上的均一性(利用常规的探测方法不能在所述的组 合物中探测出污染物种)，其中所述的组合物在实质上是由单一 的大分子种类组成的。

所述的术语患者包括人类宿主以及兽类宿主。

可以利用熟知的技术对抗体进行纯化，其中所述的技术例如 是使用蛋白质A或者蛋白质G的亲和色谱法，所述的亲和色谱 法主要能够提供免疫血清中的所述的免疫球蛋白G(IgG)片段。 随后，或者可供选择的，可以将所述的特异性的抗原或者是所述 抗原的一个表位固定化在一个柱上，其中所述的抗原是所述的免 疫球蛋白所寻找的抗原，用以通过免疫亲和色谱法对所述的免疫 特异性抗体进行纯化。对免疫球蛋白所进行的纯化在例如D. Wilkinson(The Scientist《科学家》，由The Scientist，Inc.，出版， Philadelphia PA，第14卷，第8期(2000年4月17日)，第25-28 页)发表的文章中进行了讨论。

本发明将在下述的实施例中被进行进一步的描述，所述的实 施例并不能够对由所述的权利要求所描述的本发明的范围进行 限制。

实施例

实施例1：免疫球蛋白可变生殖细胞系基因的克隆

选择七个人类重链可变生殖细胞系基因(重链可变序列1-2， 重链可变序列1-69，重链可变序列1-18，重链可变序列3-30，重 链可变序列3-48，重链可变序列3-23，重链可变序列5-51)，五 个人类κ轻链可变生殖细胞系基因(κ轻链可变序列1-33，κ轻 链可变序列1-39，κ轻链可变序列3-11，κ轻链可变序列3-15， κ轻链可变序列3-20)以及两个人类λ轻链可变生殖细胞系基因 (λ轻链可变序列1-44，λ轻链可变序列1-51)，用以构建所述 的文库(参见Lefranc，M.P.等人于1999年在Nucleic Acids  Research《核酸研究》27，209-212中发表的文章)。之所以选择 这些基因，是因为它们常常被用在人类表达的抗体个体中并且由 它们所编码的骨架能够表现出良好的稳定性以及表达曲线，无论 是在单个的结构域还是在一个重链可变(VH)/轻链可变(VL) 对的情形中(参见Ewert S等人于2003年1月17日在J Mol Biol. 《分子生物学杂志》325(3)：531-53中发表的文章)。两组特异 性的引物被用来从人类基因组DNA中对这些基因进行扩增，其 中所述的扩增是通过巢式聚合酶链式反应(PCR)来实现的。这 种方式是必要的，因为相同的家族所具有的生殖细胞系基因的5’ 序列是相同的或者是非常相似的。对于每一个基因而言，第一对 引物被设计成为对所述的5’以及3’未翻译区域具有特异性，其中 所述的第一对引物被称之为基因组定位物，所述的未翻译区域存 在于所述的生殖细胞系基因的侧翼之上。所述的第二对被设计成 为对所述的骨架1区域(FR1)的开端以及所述的骨架2区域 (FR2)的末端具有特异性。将所述的14个独立的聚合酶链式反 应(PCR)产物克隆至pGEMT-easy载体(Promega，Madison WI) 之中并且通过测序的方式对它们的同一性以及完整性进行验证。 上述被选定的生殖细胞系基因所具有的氨基酸序列在附图5中被 表示出来。

所使用到的所述的引物以及引物的组合在下文中被表示出 来：

基因组定位物

5 K1-33 TGTTTCTAATCGCAGGTGCCAGATG(序列识别号：120)

3 K1-33 ATTTATGTTATGACTTGTTACACTG(序列识别号：121)

5 K1-39 TATTTGTTTTTATGTTTCCAATCTC(序列识别号：122)

3 K1-39 CCTTGGAGGTTTATGTTATGACTTG(序列识别号：123)

5 K3-11 TTATTTCCAATTTCAGATACCACCG(序列识别号：124)

3 K3-11 TTGTTGGGGTTTTTGTTTCATGTGG(序列识别号：125)

5 K3-15 TATTTCCAATTTCAGATACCACTGG(序列识别号：126)

3 K3-15 ATGTTGAATCACTGTGGGAGGCCAG(序列识别号：127)

5 K3-20 TTATTTCCAATCTCAGATACCACCG(序列识别号：128)

3 K3-20 TTTTGTTTCAAGCTGAATCACTGTG(序列识别号：129)

5 L1-44 ATGTCTGTGTCTCTCTCACTTCCAG(序列识别号：130)

3 L1-44 TTCCCCATTGGCCTGGAGCACTGTG(序列识别号：131)

5 L1-51 GTGTCTGTGTCTCTCCTGCTTCCAG(序列识别号：132)

3 L1-51 CTTGTCTCAGTTCCCCATTGGGCTG(序列识别号：133)

5 H1-2 ATCTCATCCACTTCTGTGTTCTCTC(序列识别号：134)

3 H1-2 TTGGGTTTCTGACACCCTCAGGATG(序列识别号：135)

5 H1-18 CAGGCCAGTCATGTGAGACTTCACC(序列识别号：136)

3 H1-18 CTGCCTCCTCCCTGGGGTTTCTGAA(序列识别号：137)

5 H1-69 CCCCTGTGTCCTCTCCACAGGTGTC(序列识别号：138)

3 H1-69 CCGGCACAGCTGCCTTCTCCCTCAG(序列识别号：139)

5 DP-47 GAGGTGCAGCTGTTGGAG(序列识别号：140)

5 H3-23 TCTGACCAGGGTTTCTTTTTGTTTGC(序列识别号：141)

3 H3-23 TTGTGTCTGGGCTCACAATGACTTC(序列识别号：142)

5 H3-30 TGGCATTTTCTGATAACGGTGTCC(序列识别号：143)

3 H3-30 CTGCAGGGAGGTTTGTGTCTGGGCG(序列识别号：144)

5 H3-48 ATATGTGTGGCAGTTTCTGACCTTG(序列识别号：145)

3 H3-48 GGTTTGTGTCTGGTGTCACACTGAC(序列识别号：146)

5 H5-a GAGTCTGTGCCGGAAGTGCAGCTGG(序列识别号：147)

对编码序列具有特异性

5 VH1 TATCAGGTGCAGCTGGTGCAG(序列识别号：148)

5 VH3 TATCAGGTGCAGCTGGTGGAG(序列识别号：149)

5 VH5 TATGAGGTGCAGCTGGTGCAG(序列识别号：150)

3 VH1/3 ATATCTCTCGCACAGTAATACAC(序列识别号：151)

3 VH3 ATATCTCTCGCACAGTAATATAC(序列识别号：152)

3 VH5 ATATGTCTCGCACAGTAATACAT(序列识别号：153)

5 VK1 TATGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTC(序列识别号： 154)

3 DPK9 ATAGGAGGGGTACTGTAACT(序列识别号：155)

3 DPK1 ATAGGAGGGAGATTATCATA(序列识别号：156)

5 DPK22_L6 TATGAAATTGTGTTGACGCAGTCT(序列识别号：157)

3 DPK22 ATAGGAGGTGAGCTACCATACTG(序列识别号：158)

5 DPK21 TATGAAATAGTGATGACGCAGTCT(序列识别号：159)

3 DPK21 ATAGGAGGCCAGTTATTATACTG(序列识别号：160)

3 L6 CAGCGTAGCAACTGGCCTCCTAT(序列识别号：161)

5 DPL2 TACAGTCTGTGCTGACTCAG(序列识别号：162)

3 DPL2 ATAGGACCATTCAGGCTGTCATC(序列识别号：163)

5 DPL5 TATCAGTCTGTGTTGACGCAG(序列识别号：164)

3 DPL5 ATAGGAGCACTCAGGCTGCTAT(序列识别号：165)

被用来对选定的生殖细胞系基因进行扩增的引物组合

实施例2：受体骨架的建立

对所选定的生殖细胞系基因所具有的序列进行分析，用以判 断是否存在所述的IIs型限制性位点。在所述被选定的抗体可变 生殖细胞系基因中不存在BsmBI位点。在所述的pNDS1的骨架 中发现了两个BsmBI位点，所述的pNDS1是一种噬菌体载体， 其中在所述的噬菌体载体中可以对所述的受体骨架进行克隆。可 以通过定点诱变的方式将这两个位点进行去除这样一来可以将 唯一的BsmBI位点导入到所述的受体骨架所具有的填充DNA序 列之中。可以通过多重巢式聚合酶链式反应(PCR)对每一个生 殖细胞系基因进行扩增，其目的在于在所述的骨架区域3(FR3) 序列所具有的3’末端上添加一个填充DNA序列，在所述的填充 DNA序列之后是一个编码骨架区域4(FR4)的序列，其中所述 的序列对每一个相对应的可变片段(可变重链，可变κ轻链，可 变λ轻链)而言具有特异性。可变重链骨架区域(VH FR4)所 具有的氨基酸序列与所述的骨架区域4(FR4)区域相对应，其 中所述的骨架区域4(FR4)区域是由所述的生殖细胞系J基因 JH1，JH3，JH4以及JH5来进行编码的。可变κ轻链骨架区域(VK  FR4)所具有的氨基酸序列与所述的骨架区域4(FR4)区域相对 应，其中所述的骨架区域4(FR4)区域是由所述的生殖细胞系J 基因JK1来进行编码的。可变λ轻链骨架区域(Vλ FR4)所具 有的氨基酸序列与所述的骨架区域4(FR4)区域相对应，其中 所述的骨架区域4(FR4)区域是由所述的生殖细胞系J基因JL1， JL2，以及JL3来进行编码的。通过在位置106上(精氨酸或者 甘氨酸)进行一个单个氨基酸的取代的方式，可以建立所述的可 变κ轻链骨架区域4(Vk FR4)的两种变体。对于以所述的生殖 细胞系基因重链可变序列3-23(VH3-23)为基础的所述受体骨 架而言，同样可以构建出两种变体，其中所述的两种变体的区别 在于在位置94上的单个的氨基酸(赖氨酸和精氨酸)，所述的氨 基酸是存在于所述的骨架区域3(FR3)上的最后一个残基。在 所述的最后的扩增步骤过程中，分别在所述的可变重链(VH) 所具有的5’末端以及3’末端上导入SfiI/NcoI位点以及XhoI位点。

与之相类似的，分别在所述的可变轻链(VL)所具有的5’ 末端以及3’末端上导入SalI位点以及NotI位点(附图6)。对所 述的填充片段进行设计，使得所述的翻译阅读框发生移动，因此 能够对来自于所述的受体骨架之中的任何一种功能性蛋白质所 进行的表达进行阻止(附图7)。在下文中列出的是在这个过程中 所使用到的所述引物。

可变重链(VH)

5 VH1 CAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG(序列识别号：166)

5 VH3-30 CAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAG(序列识别号：167)

5 VH3-23 CAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAG(序列识别号：168)

5 VH3-48 CAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAG(序列 识别号：169)

5 VH5-51 CAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAG(序列识别号：170)

3 VH1/3 CTTACCGTTATTCGTCTCATCTCGCACAGTAATACAC(序列识别号：171)

3 VH3-23 CTTACCGTTATTCGTCTCATTTCGCACAGTAATATAC(序列识别号：172)

3 VH3-48 CTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTG(序列识 别号：173)

3 VH5-51 CTTACCGTTATTCGTCTCATCTCGCACAGTAATACAT(序列识别号：174)

3 VHext1 CAATACGCGTTTAAACCTGGTAAACCGCCTTACCGTTATTCGTCTCA(序 列识别号：175)

3 VHext2 GTTCCCTGGCCCCAAGAGACGCGCCTTCCCAATACGCGTTTAAACCTG (序列识别号：176)

3 VHext3 CCTCCACCGCTCGAGACTGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAAGAG(序 列识别号：177)

可变κ轻链(VK)

5 VK1 CGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTC(序列识别号：178)

5 VK3-11 CGGGTCGACGGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGC(序列识别号：179)

5 VK3-15 CGGGTCGACGGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGC(序列识别号：180)

5 VK3-20 CGGGTCGACGGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGG(序列识别号：181)

3 VK1-33 CCTTACCGTTATTCGTCTCGCTGCTGACAGTAATATGTTGCAATA(序列 识别号：182)

3 VK1-39 CCTTACCGTTATTCGTCTCGCTGCTGACAGTAGTAAGTTGCAAAA(序列 识别号：183)

3 VK3 CCTTACCGTTATTCGTCTCGCTGCTGACAGTAATAAACTGCAAAATC(序列 识别号：184)

3 VKext1 CCAATACGCGTTTAAACCTGGTAAACCGCCTTACCGTTATTCGTCTC(序 列识别号：185)

3 VKext2 GGTCCCTTGGCCGAATGAGACGCGCCTTCCCAATACGCGTTTAAAC(序 列识别号：186)

3 Vkext3R GTGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAATG(序 列识别号：187)

3 VKext3G GTGCGGCCGCCCCTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAATG(序 列识别号：188)

可变λ轻链(Vλ)

5 VL1-44 CGGGTCGACGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCAC(序列识别号：189)

5VL1-51 CGGGTCGACGCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGC(序列识别号：190)

3 VL1-44 CCTTACCGTTATTCGTCTCCTGCTGCACAGTAATAATC(序列识别号：191)

3 VL1-51 CCTTACCGTTATTCGTCTCCTGTTCCGCAGTAATAATC(序列识别号：192)

3 Vlext2 CCCTCCGCCGAACACAGAGACGCGCCTTCCCAATACGCGTTTAAAC(序 列识别号：193)

3 Vlext3 GTGCGGCCGCCCCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAACACAGA (序列识别号：194)

所述的20个最终被装配好的受体骨架所具有的序列在附图8 中被表示出来。

实施例3：含有一种无变化的可变结构域的噬菌体受体载体的建立

首先对所述的噬菌体载体pNDS1进行修饰，从而去除两个 BsmBI位点，其中所述的噬菌体载体pNDS1被用来进行所述的 单链抗体片段(scFv)的表达。通过使用所述的SfiI以及XhoI 限制性位点将一个可变重链序列3-23(VH3-23)结构域克隆至 上述经过修饰的pNDS1之中从而获得所述的噬菌体载体 pNDS_VHdummy，其中在所述的可变重链序列3-23(VH3-23) 中含有一个指定的互补决定区域3(CDR3)序列。这个结构域在 所述的骨架区域4(FR4)区域内含有一个BsmBI位点，通过沉 默位点定点诱变的方式对所述的结构域进行了校正。与此平行 的，在此之后通过使用所述的SalI以及NotI限制性位点将一个 可变κ轻链序列1-39(VK1-39)结构域克隆至上述经过修饰的 pNDS1之中从而获得所述的噬菌体载体pNDS_VKdummy(附图 9)，其中在所述的可变κ轻链序列1-39(VK1-39)中含有一个 指定的互补决定区域3(CDR3)序列。通过使用所述的SalI以 及NotI限制性位点将所述的8个可变重链(VH)受体骨架克隆 至pNDS VKdummy之中。通过使用所述的SfiI以及XhoI限制 性位点将所述的12个可变轻链(VL)受体骨架克隆至 pNDS VHdummy之中。在这一阶段，可以将下文中所列出的上 述得到的20个pNDS噬菌体载体用来进行经过多样性处理的互 补决定区域3(CDR3)的克隆，其中所述的克隆是利用存在于所 述的填充DNA片段之中的所述的BsmBI位点来实现的。

可变重链(VH)受体：pNDS_VH1-2_VKd；pNDS_VH1-18_ VKd；pNDS_VH1-69_VKd；pNDS_VH3-23R_VKd；pNDS_VH3- 23K_VKd；pNDS_VH3-30_VKd；pNDS_VH5-51_VKd；pNDS_V H3-48_VKd.

可变轻链(VL)受体：pNDS_VHd_VK1-33G；pNDS_VHd_ VK1-33R；pNDS_VHd_VK1-39G；pNDS_VHd_VK1-39R；pNDS _VHd_VK3-11G；pNDS_VHd_VK3-11R；pNDS_VHd_VK3-15G； pNDS_VHd_VK3-15R；pNDS_VHd_VK3-20G；pNDS_VHd_VK 3-20R；pNDS_VHd_VL1-44；pNDS_VHd_VK1-51.

实施例4：从人类个体中对天然的可变重链互补决定区域(CDR H3)多样性进行捕获

多种来源的人类cDNA被用来作为模板，用于进行可变重链 互补决定区域3(CDR H3)序列的扩增。这样的来源包括人类胎 儿的脾脏以及男性和女性正常成人外周血纯化细胞库。已经使用 了几种用于进行扩增的策略，其目的在于重新获得可变重链互补 决定区域3(CDR H3)序列，其中所述的可变重链互补决定区域 3(CDR H3)序列是来自于经过重新排列的可变重链(VH)cDNA 的，或者是来自于任意的可变重链(VH)cDNA的，所述的经过 重新排列的可变重链(VH)cDNA是由一种特异性的生殖细胞系 基因进行编码的。

首先，将一种引物混合物与另外一种引物混合物进行组合使 用，其中所述的第一种引物混合物能够与绝大部分的人类可变重 链(VH)家族所具有的5’编码区域进行匹配，而所述的另外一 种引物能够与所有的人类重链连接(JH)区域进行匹配。这样能 够允许绝大部分的重链免疫球蛋白可变基因进行聚合酶链式反 应(PCR)扩增。通过琼脂糖凝胶电泳的方式对具有大约400个 碱基对(bp)的所述预期的扩增产物进行分离并且对其进行纯化。 这种DNA被用来在第二轮聚合酶链式反应(PCR)步骤中作为 模板，其中在所述的第二轮聚合酶链式反应(PCR)步骤中使用 到的是具有13个碱基对以及14个碱基对的引物，所述的引物分 别能够与所述的末端骨架区域3(FR3)区域以及所述的骨架区 域4(FR4)的开端进行匹配。在大多数的情形中，所述的骨架 区域3(FR3)上所具有的最后一个残基是精氨酸或者是赖氨酸 中的一种。由于对于引物的延伸而言所述的最后一个碱基对的匹 配是至关重要的，因而使用到两种不同的5’引物：5VHR_FOK (序列识别号：205，下文中已示出)以及5VHK_FOK(序列识别 号：206，下文中已示出)，其中所述的引物的延伸是通过所述的 聚合酶来实现的。重要的是，在这些引物中同样含有一个FokI 限制性位点，用于进行所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3) 序列的切除(附图4)。对于那些在所述的第二轮聚合酶链式反应 (PCR)步骤中使用到的引物而言，在它们的5’末端上进行生物 素化的处理，用以对下游的纯化步骤进行促进(参见实施例5)。 尽管只有有限数量的碱基对进行了匹配，这种两步的途径能够使 所述的可变重链互补决定区域3(CDR H3)序列进行有效的扩增。 扩增反应是在各种不同的退火温度下(在30℃至70℃之间)以 及利用几种热稳定的DNA聚合酶来进行的，其目的在于确立最 佳的反应条件。已经发现，对于这组引物而言，55-58℃的退火 温度与GoTaq聚合酶(Promega)的组合是最优化的。在2％的 琼脂糖凝胶上对所述的第二轮的扩增产物进行分离并且导致在 所述凝胶的下段部分中形成了一个印迹，相对应于不同长度的可 变重链互补决定区域3(CDR H3)。或者将所述的完整的DNA 印迹从所述的凝胶上或者从一个区域上被提取出来，其目的在于 富集长的可变重链互补决定区域3(CDR H3)，其中所述的区域 相对应的是更大的DNA片段。

或者可供选择的，所述的第一轮扩增反应步骤是通过使用所 述的5’引物5VH3-23H2(序列识别号：201，下文中已示出)来 实现的，其中所述的引物对编码所述的生殖细胞系可变重链序列 3-23(VH3-23)所具有的可变重链互补决定区域2(CDR H2) 的序列具有特异性。由于所述的不同的生殖细胞系基因在这个互 补决定区域(CDR)内是具有多样性的，可以优先对由上述被选 定的生殖细胞系基因所进行编码的可变重链(VH)cDNA进行扩 增。随后的纯化步骤以及扩增步骤是相同的。通过这种方式，可 能可以重新获得来自于一种特异性的骨架环境中的互补决定区 域(CDR)并且将它们重新导入到所述相同的骨架之中，一种类 似的骨架之中或者不同的骨架之中。

下文中列出的是在所述的天然人类可变重链互补决定区域3 (CDR H3)个体的扩增中所使用到的引物。

第一轮聚合酶链式反应(PCR)步骤

5 VH1/5 CCGCACAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG(序列 识别号：195)

5 VH3 CCGCACAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG(序列识 别号：196)

5 VH2 CCGCACAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTTGCTCGAGTCTGG(序列识 别号：197)

5 VH4 CCGCACAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG(序列识 别号：198)

5 VH4DP64 CCGCACAGCCGGCCATGGCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCCGG (序列识别号：199)

5 VH4DP63 CCGCACAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG (序列识别号：200)

5 VH3-23H2 TGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGT(SEQ ID NO：201)

3 HJ1/2 CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACRGTGACCAGGGTGCC(序 列识别号：202)

3 HJ3/6 CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAAGAGACGGTGACCRTKGTCCC(序 列识别号：203)

3 HJ4/5 CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC(序 列识别号：204)

第二轮聚合酶链式反应(PCR)步骤

5 VHR_FOK GAGCCGAGGACACGGCCGGATGTTACTGTGCGAGA(序列识别号： 205)

5 VHK_FOK GAGCCGAGGACACGGCCGGATGTTACTGTGCGAAA(序列识别号： 206)

3 JH1_FOK GAGGAGACGGTGACGGATGTGCCCTGGCCCCA(序列识别号：207)

3 JH2_FOK GAGGAGACGGTGACGGATGTGCCACGGCCCCA(序列识别号：208)

3 JH3456_FOK GAGGAGACGGTGACGGATGTYCCTTGGCCCCA(序列识别号： 209)

实施例5：通过将天然人类可变重链互补决定区域3(CDR H3)克隆至受体骨架中的方式进行初级文库的建立

利用FokI对所述的经过扩增的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)进行消化，并且通过使用带有链霉亲和素涂层的磁 性珠对上述经过切断的末端以及未被消化的DNA进行去除。与 此平行的，使用BsmBI对pNDS可变重链(VH)受体载体进行 消化。由于通过这样的消化作用所产生的所述的突出段是具有兼 容性的，所述的大量天然的可变重链互补决定区域3(CDR H3) 能够被连结在所述的可变重链(VH)受体骨架之中从而重新建 立起所述的合适的阅读框。对所述的经过连结的DNA进行纯化 以及浓缩，用以将其转化至感受态的大肠杆菌(E.coli)XL1蓝 色细胞(Blue cells)中去，并且通过测序的方式对随机的克隆进 行分析，其目的在于检查可变重链互补决定区域3(CDR H3)序 列是否已经被进行了重新构建并且存在于所述的互补决定区域 (CDR)与所述的骨架区域之间的连接是否是正确的(附图10)。 所述的结果表明，所有的克隆中都含有可变重链互补决定区域3 (CDR H3)序列并且所述的阅读框被得以重新恢复，因此能够 编码一种免疫球蛋白的可变重链。除此之外，所有的互补决定区 域(CDR)都是不同的，这表明通过这种方式已经捕获到了具有 很大的多样性的天然存在的序列。所述的可变重链互补决定区域 3(CDR H3)所具有的长度同样是存在变化的并且已经发现了具 有10个至15个残基的相对长的互补决定区域(CDR)，因此强 调了这种途径所具备的优点，其中所述的优点是能够采用长的互 补决定区域(CDR)序列，这样的序列使用合成性的多样性是难 以对其进行覆盖的。

通过使用这种方法，可以将天然的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)序列克隆至所述的pNDS可变重链(VH)受体骨架 中的每一个中去并且将其转化至电转感受态的大肠杆菌(E.coli) TG1细胞中去并且将其放置在2xTYAG生物检测培养板(2xTY 培养基，其中含有100微克/毫升的氨苄西林以及2％的葡萄糖) 之上，其中所述的天然可变重链互补决定区域3(CDR H3)序列 来自于人类外周血纯化细胞库或者来自于人类胎儿脾脏。经过在 30℃下进行的过夜的培养之后，向所述的培养板中添加10毫升 2xTYAG液体培养基并且将所述的细胞从所述的表面之上刮擦下 来并且转移至一个50毫升的聚丙烯试管内。向所述的细胞悬浮 液中添加2xTYAG从而获得最终浓度为17％的丙三醇，其中在所 述的2xTYAG中含有50％的丙三醇。将分成等份的所述的文库在 -80℃的条件下进行保存。在这个方法中，14个初级文库被得以 建立，所述的文库能够提供共计8.1x10⁹个转化体。对180个经 过随机摘取的克隆进行测序，用以确定所述的文库所具有的质量 以及多样性。所有的克隆都能够编码不同的可变重链(VH)序 列并且大于89％的序列是存在于骨架之内的。只有在当它们与一 个虚拟的可变轻链(VL)结构域进行结合的时候，这样的初级 文库才能够含有存在于所述的可变重链互补决定区域3(CDR  H3)之中的多样性。

实施例6：通过将合成性的互补决定区域3(CDR3)克隆至受体骨架中的方式进行初级文库的建立

尽管所述的方法在重新获得天然的多样性的方面是格外有 益的，它同样可以被用来将所述的合成性的多样性整合到所述的 受体骨架之中。针对所述的可变重链(VH)以及可变轻链(VL) 对合成性的互补决定区域3(CDR3)序列进行设计。所述的设计 考虑到了所述的互补决定区域(CDR)所具有的频率以及所述的 多样性处理策略(NNS，DVK，NVT或者DVT密码子)，其中 所述的互补决定区域(CDR)具有一种给定的长度，所述的多样 性处理策略将能够允许在合理数量的转化体的范围之内对所述 的理论上的多样性进行完全的覆盖，其中所述的转化体是存在于 所述的文库之中的(大约5x10⁹个转化体)(附图11)。对于可变 κ轻链(VK)以及可变λ轻链(Vλ)而言，对于维持所述的互 补决定区域(CDR)所具有的正则结构而言的关键残基在所述的 互补决定区域3(CDR3)的设计中是保持恒定不变的。对于所述 的重链而言，只能够对具有共计10个经过多样性处理的位置的 互补决定区域3(CDR3)进行建立，这是因为为了对所述的多样 性进行覆盖而所需要的所述克隆的数量超过了转化效率所具有 的实际限度，其中所述的多样性是由更长的互补决定区域(CDR) 来进行编码的。

使用NNS，NVT，DVK或者DVT随机密码子对具有不同长 度的变性的寡核苷酸进行合成。对于每一个可变重链互补决定区 域3(CDR H3)而言，合成两个寡核苷酸，其中所述的寡核苷酸 能够在位置100z上编码一个甲硫氨酸或者一个苯丙氨酸(附图 11)。利用两个外部的经过生物素化处理的引物对每一个寡核苷 酸进行延伸以及扩增，从而建立编码所述的被设计的互补决定区 域(CDR)的双链DNA片段。这些外部的引物中含有BsmBI限 制性位点，所述的位点随后被用来进行所述的互补决定区域 (CDR)序列的切除以及向所述的受体骨架之中的插入(附图 12)。对所述的经过组装的DNA片段进行处理，但不对其进行凝 胶的纯化以及利用BsmBI进行的消化。通过使用带有链霉亲和 素涂层的磁性珠对上述被切断的末端以及未被消化的DNA进行 去除。通过乙醇沉淀法对上述经过消化的DNA片段进行浓缩并 且将其连结至所述相对应的pNDS可变重链(VH)、可变κ轻链 (VK)或者可变λ轻链(Vλ)的受体载体之中。对连结后的产 物进行纯化并且进行浓缩，用以将其转化至电转感受态的大肠杆 菌(E.coli)TG1细胞中去并且将其放置在2xTYAG生物检测培 养板(2xTY培养基，其中含有100微克/毫升的氨苄西林以及2％ 的葡萄糖)之上。经过在30℃下进行的过夜的培养之后，向所述 的培养板中添加10毫升的2xTYAG液体培养基并且将所述的细 胞从所述的表面之上刮擦下来并且转移至一个50毫升的聚丙烯 试管内。向所述的细胞悬浮液中添加2xTYAG从而获得最终浓度 为17％的丙三醇，其中在所述的2xTYAG中含有50％的丙三醇。 将分成等份的所述的文库在-80℃的条件下进行保存。有共计24 个初级重链文库被得以建立，其中所述的文库能够提供共计 1.6x10¹⁰个转化体。与之相类似的，有13个初级轻链文库被得以 建立，其中所述的文库能够提供共计6.9x10⁹个转化体。只有在 当它们与一个虚拟的可变轻链(VL)结构域进行结合的时候， 这样的初级文库才能够含有存在于所述的可变重链互补决定区 域3(CDR H3)之中的多样性。对共计330个经过随机摘取的克 隆进行测序，用以确定所述的文库所具有的质量以及多样性。所 有的克隆都能够编码不同的可变结构域序列并且大于90％的序 列是存在于骨架之内的。所述的序列所具有的这种低频率与传统 意义上获得的结果截然相反，其中所述的序列在其阅读框内含有 移变(shifts)，所述的传统意义上获得的结果是在构建合成性的 抗体片段文库的过程中所获得的，其中所述的构建使用到的是重 叠聚合酶链式反应(PCR)途径，所述的途径更加倾向于进行插 入作用的导入，并且频繁的报告出所述的功能性克隆所发生的显 著性缺失(15-45％)。

存在于这样的初级文库中的所述多样性被限制在所述的可 变重链互补决定区域3(CDR H3)或者可变轻链互补决定区域3 (CDR L3)中，当它们分别与一个虚拟的可变轻链(VL)或者 可变重链(VH)进行结合的时候。

在下文中列出的是被用来进行合成性的互补决定区域 (CDR)的组装的引物

5 H3_R_生物素 ATGATGCTGCTGGCACGTCTCCGAGA(序列识别号：210)

3 H3_M_生物素 CCACGTCATCCGATCCGTCTCCCCCAATAATCCAT(序列识别号： 211)

3 H3_F_生物素 CCACGTCATCCGATCCGTCTCCCCCAATAATCAAA(序列识别号： 212)

H3_4nnsF

GCTGGCACGTCTCCGAGANNSNNSNNSNNSTTTGATTATTGGGGGAGACG(序列 识别号：213)

H3_4nnsM

GCTGGCACGTCTCCGAGANNSNNSNNSNNSATGGATTATTGGGGGAGACG(序列 识别号：214)

H3_5nnsF

GCTGGCACGTCTCCGAGANNSNNSNNSNNSNNSTTTGATTATTGGGGGAGACG (序列识别号：215)

H3_5nnsM

GCTGGCACGTCTCCGAGANNSNNSNNSNNSNNSATGGATTATTGGGGGAGACG (序列识别号：216)

H3_6nnsF

GCTGGCACGTCTCCGAGANNSNNSNNSNNSNNSNNSTTTGATTATTGGGGGAGAC G(序列识别号：217)

H3_6nnsM

GCTGGCACGTCTCCGAGANNSNNSNNSNNSNNSNNSATGGATTATTGGGGGAGAC G(序列识别号：218)

H3_6dvkF

GCTGGCACGTCTCCGAGADVKDVKDVKDVKDVKDVKTTTGATTATTGGGGGAG ACG(序列识别号：219)

H3_6dvkM

GCTGGCACGTCTCCGAGADVKDVKDVKDVKDVKDVKATGGATTATTGGGGGAG ACG(序列识别号：220)

H3_7dvkF

GCTGGCACGTCTCCGAGADVKDVKDVKDVKDVKDVKDVKTTTGATTATTGGGG GAGACG(序列识别号：221)

H3_7dvkM

GCTGGCACGTCTCCGAGADVKDVKDVKDVKDVKDVKDVKATGGATTATTGGGG GAGACG(序列识别号：222)

H3_7nvtF

GCTGGCACGTCTCCGAGANVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTTTTGATTATTGGGGG AGACG(序列识别号：223)

H3_7nvtM

GCTGGCACGTCTCCGAGANVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTATGGATTATTGGGGG AGACG(序列识别号：224)

H3_8nvtF

GCTGGCACGTCTCCGAGANVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTTTTGATTATTGGG GGAGACG(序列识别号：225)

H3_8nvtM

GCTGGCACGTCTCCGAGANVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTATGGATTATTGG GGGAGACG(序列识别号：226)

H3_9nvtF

GCTGGCACGTCTCCGAGANVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTTTTGATTATT GGGGGAGACG(序列识别号：227)

H3_9nvtM

GCTGGCACGTCTCCGAGANVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTATGGATTATT GGGGGAGACG(序列识别号：228)

H3_9dvtF

GCTGGCACGTCTCCGAGADVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTTTTGATTATT GGGGGAGACG(序列识别号：229)

H3_9dvtM

GCTGGCACGTCTCCGAGADVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTATGGATTATT GGGGGAGACG(序列识别号：230)

H3_10dvtF

GCTGGCACGTCTCCGAGADVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTTTTGAT TATTGGGGGAGACG  (序列识别号：231)

H3_10dvtM

GCTGGCACGTCTCCGAGADVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTATGGAT TATTGGGGGAGACG  (序列识别号：232)

5 KL3_生物素 CCGGTGTAGCGAAGGCGTCTCAGCAG(序列识别号：233)

3 KL3_生物素 TAGGGTCGCCTTGATCGTCTCCCGAAGGTCGG(序列识别号： 234)

K_4nns GAAGGCGTCTCAGCAGNNSNNSNNSNNSCCGACCTTCGGGAGACG(序 列识别号：235)

K_5nns GAAGGCGTCTCAGCAGNNSNNSNNSNNSCCGNNSACCTTCGGGAGACG (序列识别号：236)

K_6nns

GAAGGCGTCTCAGCAGNNSNNSNNSNNSNNSCCGNNSACCTTCGGGAGACG (序列识别号：237)

5 L44W_生物素 CGGTCAGTCGCAATACGTCTCCAGCATGGGAT(序列识别号：238)

5 L44Y_生物素 CGGTCAGTCGCAATACGTCTCCAGCATATGAT(序列识别号：239)

3 L_生物素 CAGGACCAGTCTCGTGAGGATCGTCTCAACAC(序列识别号：240)

L44W_4nns CGTCTCCAGCATGGGATNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (序列识别号：241)

L44Y_4nns CGTCTCCAGCATATGATNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (序列识别号：242)

L44W_5nns

CGTCTCCAGCATGGGATNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC(序列识 别号：243)

L44Y_5nns

CGTCTCCAGCATATGATNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC(序列识 别号：244)

L44W_6nns

CGTCTCCAGCATGGGATNNSNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC(序 列识别号：245)

L44Y_6nns

CGTCTCCAGCATATGATNNSNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC(序 列识别号：246)

5 L51W_生物素 CGGTCAGTCGCAATACGTCTCGAACATGGGAT(序列识别号： 247)

5 L51Y_生物素 CGGTCAGTCGCAATACGTCTCGAACATATGAT(序列识别号：248)

L51W_4nns CGTCTCGAACATGGGATNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (序列识别号：249)

L51Y_4nns CGTCTCGAACATATGATNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (序列识别号：50)

L51W_5nns

CGTCTCGAACATGGGATNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC(序列识 别号：251)

L51Y_5nns

CGTCTCGAACATATGATNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC(序列识别 号：252)

L51W_6nns

CGTCTCGAACATGGGATNNSNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (序列识别号：253)

L51Y-6nns

CGTCTCGAACATATGATNNSNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC(序 列识别号：254)

实施例7：次级文库的建立

为了建立单链抗体片段(scFv)的文库，将所述的初级合成 性轻链文库与所述的初级合成性重链文库或者所述的初级天然 重链文库进行组合(附图13)，其中所述的单链抗体片段(scFv) 在所述的重链以及轻链中均携带着多样性。从每一种初级文库中 对噬菌体DNA进行制备并且利用XhoI/NotI限制性酶对其进行消 化。对所述的DNA片段进行插入，其中所述的DNA片段与来自 于所述的初级合成性文库之中的连接物以及轻链相对应，所述的 插入是通过将其连结至所述的经过消化的初级天然重链载体或 者初级合成性重链载体之中的方式来实现的。或者可供选择的， 在利用XhoI/NotI进行消化以及进行连结之前，同样利用特异性 的引物对所述的连接物-可变轻链(VL)序列进行扩增。通过苯 酚/氯仿提取以及沉淀的方式对连结后的产物进行纯化并且进行 浓缩，并且在此之后将其转化至电转感受态的大肠杆菌(E.coli) TG1细胞中去并且将其放置在2xTYAG生物检测培养板(2xTY 培养基，其中含有100微克/毫升的氨苄西林以及2％的葡萄糖) 之上。经过在30℃下进行的过夜的培养之后，向所述的培养板中 添加10毫升的2xTYAG液体培养基并且将所述的细胞从所述的 表面之上刮擦下来并且转移至一个50毫升的聚丙烯试管内。向 所述的细胞悬浮液中添加2xTYAG从而获得最终浓度为17％的 丙三醇，其中在所述的2xTYAG中含有50％的丙三醇。将分成等 份的所述的文库在-80℃的条件下进行保存。为了对需要进行重 组的所述文库所具有的数量进行限制，通过链的亚类型对它们进 行收集(即，可变重链序列1，可变重链序列3，可变重链序列5， 可变κ轻链序列1，可变κ轻链序列3，可变λ轻链序列1)并且 因此实现了9个文库的组合(即，可变重链序列1x可变κ轻链 序列1，可变重链序列1x可变κ轻链序列3，可变重链序列1x 可变λ轻链序列1，可变重链序列3x可变κ轻链序列1，可变重 链序列3x可变κ轻链序列3，可变重链序列1x可变λ轻链序列 1，可变重链序列5x可变κ轻链序列1，可变重链序列5x可变 κ轻链序列3，可变重链序列5x可变λ轻链序列1).所述的次 级合成性文库所具有的总体大小(在所述的可变重链以及可变轻 链中均携带着合成性的多样性)是7.3x10⁹个转化体。所述的次 级天然文库所具有的总体大小(在所述的可变重链以及可变轻链 中均携带着天然的多样性)是1.5x10¹⁰个转化体。

实施例8：用于展示来自于一种非人类的物种的可变重链互补决定区域3(CDRH3)个体的人类抗体文库的建立

为了对其他可供选择的多样性来源加以利用，其中所述的多 样性来源能够允许在所述的抗体结合位点内探索一个不同的三 维空间，通过下述的方式建立一种文库：对来自于所述的小鼠的 可变重链互补决定区域3(CDRH3)进行捕获并且将它们导入到 大量的人类抗体骨架之中。为了进行这种途径，构建一个受体文 库，其中所述的受体文库中含有大量的可变轻链(VL)基因， 所述的基因具有合成性的可变轻链互补决定区域3(CDR L3)多 样性，并且将所述的受体文库与大量的受体序列进行组合，其中 在所述的受体序列中含有一种填充DNA序列，所述的填充DNA 序列能够迅速的适应IIS型限制性克隆，正如在实施例2中所描 述的。这种文库能够提供用于进行次级文库的快速建立的起始 点，其中所述的次级文库中含有多种来源的天然的(人类以及非 人类的)或者合成性的可变重链互补决定区域3(CDR H3)。在 这个实施例中，所述天然的可变重链互补决定区域3(CDR H3) 多样性是从天然的Balb/c小鼠以及已经经过免疫的小鼠中捕获 到的，其中所述的免疫是利用人类干扰素γ(hIFNγ)或者人类 正常T细胞表达和分泌因子(hCCL5)(hRANTES)所进行的免 疫。

所述的第一个步骤是所述的受体文库的建立，所述文库的建 立是通过将大量的可变轻链(VL)克隆至受体可变重链(VH) 骨架载体之中的方式来实现的，其中在所述的可变轻链(VL) 中含有合成性的可变轻链互补决定区域3(CDR L3)多样性(附 图14)。所述的可变轻链(VL)序列是从在实施例6中所描述的 七个初级合成性文库中得到的，是通过使用引物5’生物素 -VHdummy以及3’生物素-fdtseq.进行聚合酶链式反应(PCR)扩 增的方式来获得的。使用XhoI/NotI对上述得到的含有大约400 个碱基对的片段的可变轻链(VL)进行消化并且在核酸纯化柱 (spin column)上对其进行纯化从而去除引物以及酶类。与之相 类似的，利用XhoI/NotI以及SwaI(SwaI能够切断所述的可变轻 链虚拟的内部)对所述的pNDS可变重链(VH)受体载体进行 消化，其中在所述的可变重链(VH)受体载体之中含有一个可 变重链互补决定区域3(CDR H3)填充物以及一个虚拟的轻链， 并且在Chroma Spin TE柱上对所述的受体载体进行纯化，其中所 述的柱所具有的截断点为1000个碱基对，从而除去所述的可变 轻链(VL)虚拟片段。在此之后将上述经过消化的可变轻链(VL) 片段连结至所述的可变重链(VH)受体载体之中(附图14)。为 了对需要进行重组的所述文库所具有的数量进行限制，通过链的 亚类型对所述的可变重链(VH)受体载体以及可变轻链(VL) 受体载体进行收集(即，可变重链序列1，可变重链序列3，可 变重链序列5，可变κ轻链序列1，可变κ轻链序列3，可变λ轻 链序列1)并且因此实现了9个文库的组合(即，可变重链序列 1x可变κ轻链序列1，可变重链序列1x可变κ轻链序列3，可 变重链序列1x可变λ轻链序列1，可变重链序列3x可变κ轻链 序列1，可变重链序列3x可变κ轻链序列3，可变重链序列1x 可变λ轻链序列1，可变重链序列5x可变κ轻链序列1，可变重 链序列5x可变κ轻链序列3，可变重链序列5x可变λ轻链序列 1)。将连结后的产物转化至电转感受态的大肠杆菌(E.coli)TG1 细胞中去并且将其放置在2xTYAG生物检测培养板(2xTY培养 基，其中含有100微克/毫升的氨苄西林以及2％的葡萄糖)之上。 经过在30℃下进行的过夜的培养之后，向所述的培养板中添加6 毫升的2xTYAG液体培养基并且将所述的细胞从所述的表面之 上刮擦下来并且转移至一个50毫升的聚丙烯试管内。向所述的 细胞悬浮液中添加50％的丙三醇从而获得最终浓度为17％的丙 三醇。将分成等份的所述的文库在-80℃的条件下进行保存。这 种受体文库所具有的总体大小为1.9x10⁹个转化体，其中所述的 文库在所述的可变轻链互补决定区域3(CDR L3)中携带着合成 性的多样性。

所述的接下来的步骤是从一种非人类的来源中对可变重链 互补决定区域3(CDRH3)序列进行分离。从五只天然的或者经 过免疫的Balb/c小鼠的脾脏中分离出所述的细胞并且对总RNA 进行纯化。通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从上述提取 的RNA中分离出cDNA。这种cDNA被用来作为模板，用以对 小鼠的可变重链(VH)进行分离以及扩增，其中所述的扩增是 通过聚合酶链式反应(PCR)来实现的。使用15种不同的5’引 物(每一种小鼠可变重链的亚组使用一个引物)以及一种3’引物 库(四种引物来覆盖所述的重链连接区域)来进行一系列的聚合 酶链式反应(PCR)，其中所述的5’引物对所述的骨架区域1(FR1) 区域所具有的开端具备特异性。对这些第一轮聚合酶链式反应 (PCR)产物进行收集并且在2％的琼脂糖凝胶上对其进行纯化。 上述经过纯化的DNA被用来作为模板，从而实现第二轮聚合酶 链式反应(PCR)，用以对所述的小鼠可变重链互补决定区域3 (CDR H3)区域进行分离。

在第二轮聚合酶链式反应(PCR)中所使用到的所述5’引物 以及3’引物能够分别以小鼠的可变重链(VH)所具有的骨架区 域3(FR3)以及骨架区域4(FR4)区域为靶向。这些引物添加 了一个FokI限制性位点，其目的在于允许对所述的可变重链互 补决定区域3(CDR H3)进行切除并且将其克隆至所述的人类受 体载体之中。然而，对鼠科动物的可变重链(VH)所进行的比 对揭示出：存在于所述的鼠科动物的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)的5’边界上的序列以及位于所述的FokI切断位点的 位置上的序列几乎总是与人类的序列存在一个碱基的差异，然而 在这两种物种之间所述的3’末端却是相匹配的。在下文的表格中 用框格表示出的是通过FokI来进行切断的所述序列：

因此在所述的第二轮扩增步骤的过程中不得不对所述的碱 基进行校正，其目的在于建立粘性末端，其中所述的粘性末端具 备兼容性，能够兼容经由所述的受体骨架的消化作用而产生的所 述粘性末端。可以观察到有效的扩增，这种扩增表明这种转化是 很容易发生的。在所述的3’末端上，那些即将被所述的IIS型限 制性酶进行切断的小鼠序列与人类序列是相同的，因此能够避免 任何的校正问题。

在用于进行所述的第二轮扩增的引物所具有的5’末端上对 其进行生物素化处理，从而对下游的纯化步骤进行促进。利用 BsmBI对所述的受体载体进行消化并且在Chroma Spin TE柱上 对其进行纯化，其中所述的柱具有1000个碱基对的截断点。在 经过消化以及纯化过程之后，以相等摩尔比例的水平对所述的九 种不同的文库组合进行收集，用以进行所述的被捕获的小鼠可变 重链互补决定区域3(CDRH3)的连结。

通过苯酚/氯仿提取的方式对连结后的产物进行纯化并且通 过沉淀的方式对其进行浓缩，在此之后将其转化至感受态的大肠 杆菌(E.coli)TG1细胞中去并且将其放置在2xTYAG生物检测 培养板(2xTY培养基，其中含有100微克/毫升的氨苄西林以及 2％的葡萄糖)之上。经过在30℃下进行的过夜的培养之后，向 所述的培养板中添加6毫升的2xTYAG液体培养基并且将所述的 细胞从所述的表面之上刮擦下来并且转移至一个50毫升的聚丙 烯试管内。向所述的细胞悬浮液中添加50％的丙三醇从而获得最 终浓度为17％的丙三醇。将分成等份的所述的文库在-80℃的条 件下进行保存。能够获得具有相类似的大小的三个文库：MnA， 2.5x10⁸个转化体(携带着一种受限制的天然人类骨架多样性，在 所述的可变重链互补决定区域3内携带着天然小鼠的多样性并且 在所述的可变轻链互补决定区域3内携带着合成性的多样性)； MiB，7.3x10⁷个转化体(携带着一种受限制的天然人类骨架多样 性，在所述的可变重链互补决定区域3内携带着免疫小鼠的抵御 人类干扰素γ(hIFNγ)的多样性并且在所述的可变轻链互补决 定区域3内携带着合成性的多样性)；以及MiC，1.8x10⁸个转化 体(携带着一种受限制的天然人类骨架多样性，在所述的可变重 链互补决定区域3内携带着免疫小鼠的抵御人类正常T细胞表达 和分泌因子(hCCL5)的多样性并且在所述的可变轻链互补决定 区域3内携带着合成性的多样性)。通过测序的方式对随机的克 隆进行分析，其目的在于检查可变重链互补决定区域3(CDR H3) 序列是否已经被进行了重新构建并且存在于所述的互补决定区 域(CDR)与所述的骨架区域之间的连接是否是正确的。所述的 结果表明，在所有的克隆中都含有可变重链互补决定区域3(CDR  H3)序列并且所述的阅读框被得以重新恢复，因此能够编码一种 免疫球蛋白的可变重链。所有的互补决定区域(CDR)都是不同 的并且与典型的小鼠可变重链互补决定区域3(CDR H3)序列相 类似，这表明通过这种方式已经捕获到了具有很大的多样性的天 然存在的小鼠可变重链互补决定区域3(CDRH3)序列。除此之 外，对所述的可变重链互补决定区域3(CDRH3)的长度曲线所 进行的分析表明，在所述的天然文库中已经捕获到了一种高斯曲 线分布，其中所述的高斯曲线分布与在正常的小鼠个体中所具有 的预期的长度分布是相对应的。与此相反的是，在所述的两种免 疫文库中所述的曲线是不同的，这表明已经捕获到了一个不同的 可变重链互补决定区域3(CDRH3)个体(附图15)。

来自于小鼠中的、被用来进行可变重链互补决定区域3 (CDRH3)的扩增的引物

第一轮聚合酶链式反应(PCR)

5’引物：

m5 VH1 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTYCAGCTBCAGCAGTC(序 列识别号：256)

m5 VH2 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTTCACCTGCAGCARTC(序 列识别号：257)

m5 VH3 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTRCAGCTGAAGGAGTC (序列识别号：258)

m5 VH4 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCCAACTVCAGCARCC (序列识别号：259)

m5 VH5 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGATCCAGTTGGTVCAGTC(序 列识别号：260)

m5 VH6 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGSASTC(序 列识别号：261)

m5 VH7 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTC (序列识别号：262)

m5 VH8 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAGTGAARSTTGAGGAGTC (序列识别号：263)

m5 VH9 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAKGTSVAGCTTCAGGAGTC(序 列识别号：264)

m5 VH10 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATC(序 列识别号：265)

m5 VH11 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGRTGGARTC (序列识别号：266)

m5 VH12 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGAAGCTGRTGGAGTC (序列识别号：267)

m5 VH13 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAGTGCAGCTGTTGGAGAC (序列识别号：268)

m5 VH14 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGAAGCTTCTCSAGTC(序 列识别号：269)

m5 VH15 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCARGTTACTCTGAAAGAGT(序 列识别号：270)

3’引物：

m3 HJ1 CCTGAACCGCCGCCTCCGCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC(序列 识别号：271)

m3 HJ2 CCTGAACCGCCGCCTCCGCTCGAGACTGTGAGAGTGGTGCC(序列 识别号：272)

m3 HJ3 CCTGAACCGCCGCCTCCGCTCGAGACAGTGACCAGAGTCCC(序列 识别号：273)

m3 HJ4 CCTGAACCGCCGCCTCCGCTCGAGACGGTGACTGAGGTTCC(序列 识别号：274)

第二轮聚合酶链式反应(PCR)

5’引物：

5 VHR_FOK_生物素 GAGCCGAGGACACGGCCGGATGTTACTGTGCGAGA(序 列识别号：275)

3’引物：

3′mJH1_Fok_生物素 GGGGCGCAGGGACATCCGTCACCGTCTCCTC(序列识别 号：276)

3′mJH2_Fok_生物素 GAGGAGACTGTGAGGGATGTGCCTTGGCCCCA(序列识 别号：277)

3′JH1_Fok GAGGAGACGGTGACGGATGTGCCCTGGCCCCA(序列识别 号：278)

3′mJH4_Fok_生物素 GAGGAGACGGTGACGGATGTTCCTTGACCCCA(序列识 别号：279)

实施例9：文库的噬菌体救援

根据标准的噬菌体展示操作技术各自独立的对每一个初级 文库以及次级文库进行救援，其中所述的标准噬菌体展示操作技 术将在下文中进行简要的概述。将大量的来自于所述冷冻的文库 等份的细胞添加到500毫升的2xTYAG之中并且使其在搅拌的状 态下(240rpm)于37℃下生长直至达到0.3至0.5的OD600值， 其中所述的细胞足以能够覆盖至少十倍于所述的文库所具有的 理论多样性。在此之后利用MK13K07辅助噬菌体对所述的培养 物进行双重感染并且于37℃下进行一小时的培养(150rpm)。在 此之后通过下述的方式对所述的培养基进行更换：在2000rpm 的条件下对所述的细胞进行10分钟的离心，去除所述的培养基 并且使所述的小球(pellet)重新悬浮于500毫升2xTY-AK(100 微克/毫升的氨苄西林；50微克/毫升的卡那霉素)之中。在此之 后使所述的培养物在30℃下(240rpm)进行过夜的生长。在4000 rpm的条件下对所述的培养物进行20分钟的离心从而使所述的 细胞呈小球状。对所述的上清液进行收集并且向其中添加30％ (体积/体积)的聚乙二醇(PEG)8000(20％)/2.5M氯化钠， 通过在冰上对所述的混合液进行1小时的培养的方式，使所述的 噬菌体颗粒沉淀下来。通过在10000rpm的条件下进行30分钟 的离心的方式对所述的噬菌体颗粒进行收集并且将其重新悬浮 在10毫升的TE缓冲液(10毫摩的tris盐酸，pH为8.0；1毫摩 的乙二胺四乙酸(EDTA))之中。在10000rpm的条件下对上述 重新悬浮的溶液进行离心，用以清除所述的细菌碎片并且重复进 行所述的沉淀步骤。经过了最终的重新悬浮之后，通过利用大肠 杆菌(E.coli)进行感染以及在280纳米处进行吸收的方式对噬 菌体进行滴定。同样可以通过Western印迹分析对在所述的噬菌 体表面上发生的所述的单链抗体片段(scFv)所具有的展示水平 进行评价，其中在所述的Western印迹分析中使用到了一种抗 -c-myc单克隆抗体。在进行了丙三醇的添加使之达到15％(重量 /体积)的最终浓度之后，将来自于不同文库之中的经过纯化的噬 菌体在-80℃之下进行冷冻保存。

为了能够在选择操作的过程中使用具有可以控制的数量的 文库，将所述的经过纯化的噬菌体分为4个工作文库：AA1-来自 于全部的初级合成性可变重链(VH)文库的噬菌体；AB1-来自 于全部的初级合成性可变轻链(VL)文库的噬菌体；AC1-来自 于全部的初级天然可变重链(VH)文库的噬菌体；AD1-来自于 全部的次级天然文库的噬菌体；AE1-来自于全部的次级合成性文 库的噬菌体；MnA-具有从天然小鼠中捕获到的多样性的文库； MiB-具有从经过免疫的小鼠中捕获到的多样性的文库，其中利用 人类干扰素γ(hIFNγ)对所述的小鼠进行了免疫；MiC-具有从 经过免疫的小鼠中捕获到的多样性的文库，其中利用人类正常T 细胞表达和分泌因子(hCCL5/RANTES)对所述的小鼠进行了免 疫。

实施例10：抗体文库的高通量筛选

可以通过对随机的文库成员进行DNA测序的方式对一种文 库所具有的质量以及多样性进行评价。在绝大部分的情形中对几 百件的克隆进行测序，其中所述的几百件克隆仅仅代表了所述文 库所具有的一个非常小的部分(小于文库成员的1/10000000)。 为了对本发明所提供的所述方法所具有的性能进行分析，使用新 一代测序技术对所述的文库成员中的一个更具代表性的数量进 行分析。从所述的文库AE1中分离出来的DNA被用来作为模板， 用以进行高通量的测序，其中在所述的高通量测序中使用了 illumina Genome Analyzer(illumina基因组分析仪)设备。这种 新一代的DNA测序系统能够允许在几天的时间内对数以十亿计 的碱基进行阅读。所述的测序阅读量相对而言是短的(大约70 个碱基)但是其与我们的文库设计具有完美的兼容性。由于所述 的多样性被局限在所述的互补决定区域3(CDR3)区域内，70 个碱基的阅读量足以能够对所述的可变重链互补决定区域3 (CDRH3)以及所述的骨架3区域的一部分进行覆盖，其中所述 的骨架3区域的一部分是用于进行可变重链(VH)家族的识别 的部分。这项技术已经被用来对几百万的可变重链互补决定区域 3(CDRH3)区域进行测序，其中所述的可变重链互补决定区域 3(CDRH3)是来自于所述的AE1文库的。已经获得了5078705 个序列，共计365666760个碱基。对所述的数据所进行的分析表 明有5007022个序列(占总数的98.6％)是具有唯一性的。共计 有4680882个序列将被明确的归为一种可变重链(VH)家族(可 变重链1，可变重链3以及可变重链5)并且这表示着已经对存 在于所述的AE1文库中的所述可变重链(VH)家族进行了确定 (41％的可变重链1；30％的可变重链3；29％的可变重链5)。一 项重要的发现是所述的发生在骨架内的插入所占的比例存在于 88％至91％的范围之内。这项数据以一种更为统计学的方式证实 了在实施例6中所描述的对所述的24个初级可变重链(VH)合 成性文库进行测序的结果。这种组合的测序数据组证明了在这种 方法中所使用到的所述的IIs型限制性克隆方法是非常强有力 的，能够在所述的24个独立文库的构建过程中实现一种有效的 以及产量高的插入，用以建立了所述的AE1文库所具有的可变 重链(VH)多样性。

对所述的数百万的文库成员所进行的测序代表着一种对抗 体文库而言的史无前例的质量控制步骤。所述的结果证明了所述 的方法能够允许进行高质量的以及高多样性的文库的建立，其中 所述文库的建立是以一种可以复制的并且强有力的方式来实现 的。

实施例11：使用次级文库所进行的噬菌体展示筛选

针对人类干扰素γ(hIFNγ)的液相筛选：在室温条件下， 在旋转混合仪上利用磷酸盐缓冲液(PBS)对分成等份的AD1 以及AE1噬菌体文库(10¹¹-10¹²Pfu)进行一小时的封闭，其中 在所述的磷酸盐缓冲液(PBS)中含有3％(重量/体积)的脱脂 乳。在此之后在室温条件下在旋转混合仪上利用链霉亲和素磁性 珠(Dynal M-280)对经过封闭的噬菌体进行一小时的取消选定。 在此之后在室温条件下在旋转混合仪上利用经过生物素化处理 的人类干扰素γ(hIFNγ)(100纳摩)对被取消选定的噬菌体 进行两小时的体内培养。使用磁性表架对所述的珠子进行捕获并 且在此之后利用磷酸盐缓冲液(PBS)/0.1％的吐温20对其进行 四次洗涤并且利用磷酸盐缓冲液(PBS)对其进行3次洗涤。在 此之后将所述的珠子直接加入到10毫升的处于指数生长期的 TG1细胞之中并且在37℃下在缓慢震荡的条件下(100rpm)对 其进行一小时的培养。对一个等份的所述被感染的TG1进行连 续稀释从而对所述的选择输出量(selection output)进行滴定。 在3000rpm的条件下对剩余的经过感染的TG1进行15分钟的旋 转并且将其重新悬浮在0.5毫升的2xTYAG(2xTY培养基，其中 含有100微克/毫升的氨苄西林以及2％的葡萄糖)之中并且将其 涂抹在2xTYAG琼脂糖生物检测培养板之上。经过在30℃下进 行的过夜的培养之后，向所述的培养板中添加10毫升的2xTYAG 并且将所述的细胞从所述的表面之上刮擦下来并且转移至一个 50毫升的聚丙烯试管内。向所述的细胞悬浮液中添加2xTYAG 从而获得最终浓度为17％的丙三醇，其中在所述的2xTYAG中含 有50％的丙三醇。将分成等份的所述的筛选轮次(selection round) 在-80℃的条件下进行保存。在每一轮之后对噬菌体的输出量进 行滴定并且所述输出量的递增表明发生了所述克隆的富集，其中 所述的克隆对于所述的靶向具有特异性(附图16)。

通过针对所述的大鼠单克隆抗体5E3进行淘选的方式而进行 的选择：在4℃下，利用5E3对免疫试管进行过夜的覆盖，其中 所述的5E3是以10微克/毫升的水平存在于磷酸盐缓冲液(PBS) 之中的，并且在相同的条件下利用一种不相关的大鼠抗体对用于 进行噬菌体的取消选定的免疫试管进行覆盖。在进行洗涤之后在 室温条件下利用磷酸盐缓冲液(PBS)对所述的免疫试管进行封 闭，其中在所述的磷酸盐缓冲液(PBS)中含有3％(重量/体积) 的脱脂乳。在室温条件下在旋转混合仪上利用磷酸盐缓冲液 (PBS)对分成等份的AD1以及AE1噬菌体文库(10¹¹-10¹²Pfu) 进行一小时的封闭，其中在所述的磷酸盐缓冲液(PBS)中含有 3％(重量/体积)的脱脂乳。在此之后在室温条件下在旋转混合 仪上在所述的免疫试管中对经过封闭的噬菌体进行一小时的取 消选定，其中利用一种不相关的大鼠抗体对所述的免疫试管进行 了覆盖。在此之后将被取消选定的噬菌体转移到利用5E3进行覆 盖的所述的免疫试管之中并且在室温条件下在旋转混合仪上对 其进行两小时的培养。利用磷酸盐缓冲液(PBS)/0.1％的吐温 20对所述的试管进行五次洗涤并且利用磷酸盐缓冲液(PBS)对 其进行3次洗涤。利用100毫摩的三乙胺(TEA)对噬菌体进行 10分钟的洗脱并且利用1M的pH为7.5的Tris盐酸对其进行中 和。将噬菌体加入到10毫升的处于指数生长期的TG1细胞之中 并且在37℃下在缓慢震荡的条件下(100rpm)对其进行一小时 的培养。对一个等份的所述被感染的TG1进行连续稀释从而对 所述的选择输出量(selection output)进行滴定。在3000rpm的 条件下对剩余的经过感染的TG1进行15分钟的旋转并且将其重 新悬浮在0.5毫升的2xTYAG(2xTY培养基，其中含有100微克 /毫升的氨苄西林以及2％的葡萄糖)之中并且将其涂抹在 2xTYAG琼脂糖生物检测培养板之上。经过在30℃下进行的过夜 的培养之后，向所述的培养板中添加10毫升的2xTYAG并且将 所述的细胞从所述的表面之上刮擦下来并且转移至一个50毫升 的聚丙烯试管内。向所述的细胞悬浮液中添加2xTYAG从而获得 最终浓度为17％的丙三醇，其中在所述的2xTYAG中含有50％ 的丙三醇。将分成等份的所述的筛选轮次(selection round)在-80 ℃的条件下进行保存。通过在大鼠的5E3以及一种嵌合版本的 5E3之间所进行的交替使用的方式来实现多轮次的筛选，其中在 所述的嵌合版本的5E3中所述的可变区域被融合在了小鼠的恒 定结构域之中。进行这样的交替轮换的轮次，其目的在于对克隆 进行富集并且对抗个体基因型抗体进行建立，其中所述的克隆对 所述的5E3所具有的可变区域存在特异性。在每一轮之后对噬菌 体的输出量进行滴定并且所述输出量的递增表明发生了所述克 隆的富集，其中所述的克隆对于所述的靶向具有特异性(附图 17)。

噬菌体救援：将100微升的细胞悬浮液添加到20毫升的 2xTYAG之中并且在37℃下在搅拌状态下(240rpm)使其进行 生长直至达到0.3至0.5的OD600，其中所述的细胞悬浮液是从 先前的筛选轮次中获得的。在此之后利用3.3x10¹⁰个MK13K07 辅助噬菌体对所述的培养物进行双重感染并且于37℃下对其进 行一小时的培养(150rpm)。在此之后通过下述的方式对所述的 培养基进行更换：在2000rpm的条件下对所述的细胞进行10分 钟的离心，去除所述的培养基并且使所述的小球(pellet)重新悬 浮于20毫升的2xTY-AK(100微克/毫升的氨苄西林；50微克/ 毫升的卡那霉素)之中。在此之后使所述的培养物在30℃下(240 rpm)进行过夜的生长。

用于进行酶联免疫吸附检测(ELISA)的单克隆噬菌体救援： 将单个的克隆摘取放置于微滴定板内并且在37℃下使其进行5-6 小时的生长(100-120rpm)，其中在所述的微滴定板的每个孔内 含有150微升的2xTYAG培养基(2％的葡萄糖)。向每个孔内添 加M13KO7辅助噬菌体从而获得数值为10的感染复数(MOI) (即，存在于所述的培养液之中的每个细胞感染有10个噬菌体) 并且在37℃下对其进行1小时的培养(100rpm)。经过生长之后， 将培养板在3200rpm条件下进行10分钟的离心。小心的去除上 清液，将细胞重新悬浮在150微升的2xTYAK培养基中并且使其 在30℃下进行过夜的生长(120rpm)。为了进行所述的酶联免疫 吸附检测(ELISA)，通过添加150微升的二倍浓度的磷酸盐缓 冲液(PBS)的方式对所述的噬菌体进行封闭并且在此之后在室 温条件下对其进行一小时的培养，其中在所述的磷酸盐缓冲液 (PBS)中含有5％的脱脂乳粉末。在此之后在3000rpm的条件 下对所述的培养板进行10分钟的离心并且将所述的含有噬菌体 的上清液用来进行所述的酶联免疫吸附检测(ELISA)。

噬菌体的酶联免疫吸附检测(ELISA)：利用2微克/毫升的 人类干扰素γ(hIFNγ)或者2微克/毫升的大鼠5E3对酶联免 疫吸附检测(ELISA)培养板(Maxisorb，NUNC)进行过夜的 覆盖，其中所述的人类干扰素γ(hIFNγ)或者大鼠5E3是存在 于磷酸盐缓冲液(PBS)之中的。利用2微克/毫升的牛血清白蛋 白(BSA)或者一种不相关的大鼠单克隆抗体对对照培养板进行 覆盖。在此之后在室温条件下利用3％的脱脂乳/磷酸盐缓冲液 (PBS)对培养板进行1小时的封闭。利用磷酸盐缓冲液以及 0.05％的吐温20对培养板进行三次洗涤并且在此之后对所述的 经过预先封闭的噬菌体上清液进行转移并且在室温条件下对其 进行一小时的培养。在此之后利用磷酸盐缓冲液以及0.05％的吐 温20对培养板进行三次洗涤。向每个孔内添加50微升3％的脱 脂乳/磷酸盐缓冲液(PBS)，其中在所述的磷酸盐缓冲液(PBS) 中含有(辣根过氧化物酶)(HRP)-共轭的抗-M13抗体 (Amersham，以1∶10000的水平对其进行稀释)。经过在室温 条件下对其进行的1小时的培养之后，利用磷酸盐缓冲液以及 0.05％的吐温20对所述的培养板进行5次洗涤。在此之后通过添 加50微升的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(Sigma)以及50 微升2N的硫酸来终止所述反应的方式来展示所述的酶联免疫吸 附检测(ELISA)。在450纳米处读取所述的吸收强度。可以识 别出对人类干扰素γ(hIFNγ)具有特异性的克隆并且在经过所 述的第三轮筛选之后所述的命中率存在于10％至30％的范围之 内。同样可以识别出对5E3的可变区域具有特异性的克隆并且在 经过所述的第三轮筛选之后所述的命中率存在于7％至48％的范 围之内。

噬菌体克隆的测序：使单个的克隆物在每孔5毫升的 2xTYAG培养基(2％的葡萄糖)内生长并且使其在37℃下(120 rpm)进行过夜的生长。第二天对噬菌体DNA进行纯化并且将其 用来进行DNA的测序，其中在所述的DNA测序中使用到这样一 种引物，所述的引物对pNDS1具有特异性，所述的引物是 mycseq，5’-CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG(序列识别号：255)。

大规模单链抗体片段(scFv)的纯化：利用单个的菌落在1 毫升的2xTYAG起始培养液中进行接种并且在振荡条件下(240 rpm)于37℃下对其进行5小时的培养，其中所述的菌落是来自 于刚刚经过划线培养的2xTYAG琼脂糖培养板上的。将0.9毫升 的这种培养物用来接种至400毫升具有相同培养基的培养液之中 并且在剧烈振荡(300rpm)的条件下使其在30℃下进行过夜的 生长。

第二天通过添加400微升1M的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳 糖苷(IPTG)对所述的培养进行诱导并且使所述的培养再持续进 行3小时。通过在4℃下于5000rpm的条件下进行10分钟的离 心的方式对所述的细胞进行收集。将呈现小球状的细胞重新悬浮 在10毫升冰冷的三羟甲基甲氨基乙磺酸(TES)缓冲液中，如上 文中所述，在所述的缓冲液中补充有蛋白酶抑制剂。通过添加15 毫升以1∶5的水平稀释的三羟甲基甲氨基乙磺酸(TES)缓冲液 并且在冰上对其进行1小时的培养的方式来达到渗透压休克。在 4℃下于10000rpm的条件下对细胞进行20分钟的离心用以使细 胞碎片呈小球状。将所述的上清液小心的转移至一个新的试管 内。向所述的上清液内添加咪唑使之达到10毫摩的最终浓度。 向每一个试管内添加1毫升的镍离子金属螯合亲和层析介质树脂 (Ni-NTA)(Qiagen)并且于4℃下在旋转混合仪上对其进行1 小时的培养(20rpm)，其中利用磷酸盐缓冲液(PBS)对所述的 镍离子金属螯合亲和层析介质树脂(Ni-NTA)进行了平衡。在 2000rpm条件下对所述的试管进行5分钟的离心并且小心的去除 所述的上清液。将上述呈小球状的树脂重新悬浮在10毫升冰冷 的(4℃)洗涤缓冲液1(50毫摩的磷酸二氢钠，300毫摩的氯化 钠，10毫摩的咪唑，pH调整至8.0)之中。将所述的悬浮液添加 到一个polyprep柱(Biorad)中。8毫升的洗涤缓冲液2(50毫 摩的磷酸二氢钠，300毫摩的氯化钠，20毫摩的咪唑，pH调整 至8.0)被用来对所述的柱进行洗涤，其中所述的洗涤是通过重 力流动的方式来实现的。利用2毫升的洗脱缓冲液(50毫摩的磷 酸二氢钠，300毫摩的氯化钠，250毫摩的咪唑，pH调整至8.0) 将所述的单链抗体片段(scFv)从所述的柱中洗脱下来。通过在 280纳米处的吸收对馏分进行分析并且对含有蛋白质的馏分进行 收集，在此之后在一个PD10脱盐柱(Amersham)上进行缓冲液 交换，其中所述的脱盐柱被利用磷酸盐缓冲液(PBS)进行了平 衡。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对 存在于磷酸盐缓冲液(PBS)之中的所述单链抗体片段(scFv) 进行分析并且通过在280纳米处才吸收对其进行量化。对上述经 过纯化的单链抗体片段(scFv)进行等分并且将它们在-20℃以及 4℃下进行保存。

实施例12：对在使用高通量的测序方法进行筛选之后获得的互补决定区域3(CDR3)曲线所进行的分析

使用在实施例10中所描述的新一代测序技术，可以对存在 于每一个可变重链(VH)家族之中的所述的可变重链互补决定 区域3(CDR H3)所具有的长度分布进行分析，其中所述的可变 重链(VH)家族是存在于所述的AE1以及AD1文库之中的，以 及存在于所述的输出量之中的，所述的输出量是在所述的第三轮 筛选进行之后获得的。所述的AE1以及AD1文库所生成的曲线 存在明显的区别(附图18)。在所述的AE1文库中所述的可变重 链互补决定区域3(CDR H3)具有的长度分布与文库设计的本意 相符合，具有存在于9-15个氨基酸的范围之内的长度。与此相 反的是，在所述的AD1文库中发现了长得多的可变重链互补决 定区域3(CDR H3)，其中所述的可变重链互补决定区域3(CDR  H3)具有高达22个氨基酸，并且所述的曲线与在人类的天然个 体中观察到的所述的长度分布相符合。这样的结果证实了在所述 的AD1文库的构建过程中已经捕获到了一种人类天然的可变重 链互补决定区域3(CDR H3)个体。在经过三轮针对5E3的筛 选之后所进行的一个类似的分析显示出，已经选定了完全不同的 可变重链互补决定区域3(CDR H3)长度曲线。特别的，在利用 所述的AD1文库所进行的筛选中可以观察到一种可变重链互补 决定区域3(CDR H3)的大量富集，其中所述的可变重链互补决 定区域3(CDR H3)具有8至21个氨基酸的长度。这组数据证 明了在进行过针对相同的靶向所进行的筛选之后，从所述的两个 文库中获得了不同的可变重链互补决定区域3(CDR H3)曲线的 富集。此外，这项分析证明了，通过使用本发明，可以将使用合 成性的多样性非常难以进行覆盖的长的可变重链互补决定区域3 (CDR H3)捕获至被选定的人类骨架之中并且对其进行选定。

实施例13：在结合检测中对识别出的单链抗体片段(scFv)所进行的评价

在一项剂量应答酶联免疫吸附检测(ELISA)中，对经过纯 化的单链抗体片段(scFv)克隆制剂进行测试，其中所述的克隆 是具有不同的序列的克隆，以及是在针对所述的5E3的可变区域 进行的筛选中被识别为呈阳性的克隆，其中测试的内容是与嵌合 型的5E3所进行的结合。同样利用一种不相关的小鼠抗体(1A16) 对这样的制剂进行测试。利用2微克/毫升的小鼠5E3对酶联免 疫吸附检测(ELISA)培养板(Maxisorb，NUNC)进行过夜的 覆盖，其中所述的小鼠5E3是存在于磷酸盐缓冲液(PBS)之中 的。利用2微克/毫升的1A6单克隆抗体对对照培养板进行覆盖。 在此之后在室温条件下利用3％的脱脂乳/磷酸盐缓冲液(PBS) 对培养板进行1小时的封闭。利用磷酸盐缓冲液以及0.05％的吐 温20对培养板进行三次洗涤并且在此之后向其中添加不同浓度 的经过纯化的单链抗体片段(scFv)并且在室温条件下对其进行 一小时的培养。在此之后利用磷酸盐缓冲液以及0.05％的吐温20 对培养板进行三次洗涤。向每个孔内添加50微升3％的脱脂乳/ 磷酸盐缓冲液(PBS)，其中在所述的磷酸盐缓冲液(PBS)中含 有(辣根过氧化物酶)(HRP)-共轭的抗-myc抗体。经过在室温 条件下对其进行的1小时的培养之后，利用磷酸盐缓冲液以及 0.05％的吐温20对所述的培养板进行5次洗涤。在此之后通过添 加50微升的Amplex Red荧光性底物的方式来展示所述的酶联免 疫吸附检测(ELISA)并且在荧光分光光度计上对所述的信号进 行读取。所述的数据表明大多数所述的克隆对5E3能够产生高度 的特异性，因为它们不能够对1A6进行识别并且它们能够直接作 用于所述的5E3所具有的可变区域(附图19)。

与之相类似的，在一项剂量应答试验中，对经过纯化的单链 抗体片段(scFv)克隆制剂进行测试，其中所述的克隆是具有不 同的序列的克隆，以及是在噬菌体酶联免疫吸附检测(ELISA) 中被识别为粘合剂的克隆，所述的粘合剂是作用于人类干扰素γ (hIFNγ)的粘合剂，其中测试的内容是与人类干扰素γ(hIFN γ)所进行的结合。利用2微克/毫升的人类干扰素γ(hIFNγ) 对酶联免疫吸附检测(ELISA)培养板(Maxisorb，NUNC)进 行过夜的覆盖，其中所述的人类干扰素γ(hIFNγ)是存在于磷 酸盐缓冲液(PBS)之中的，并且利用2微克/毫升的牛血清白蛋 白(BSA)对对照培养板进行覆盖，其中所述的牛血清白蛋白 (BSA)是存在于磷酸盐缓冲液(PBS)之中的。在此之后在室 温条件下利用3％的脱脂乳/磷酸盐缓冲液(PBS)对培养板进行 1小时的封闭。利用磷酸盐缓冲液以及0.05％的吐温20对培养板 进行三次洗涤并且在此之后向其中添加不同浓度的经过纯化的 单链抗体片段(scFv)并且在室温条件下对其进行一小时的培养。 在此之后利用磷酸盐缓冲液以及0.05％的吐温20对培养板进行 三次洗涤。向每个孔内添加50微升3％的脱脂乳/磷酸盐缓冲液 (PBS)，其中在所述的磷酸盐缓冲液(PBS)中含有(辣根过氧 化物酶)(HRP)-共轭的抗-myc抗体。经过在室温条件下对其进 行的1小时的培养之后，利用磷酸盐缓冲液以及0.05％的吐温20 对所述的培养板进行5次洗涤。在此之后通过添加50微升的 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物以及50微升2N的硫酸来终 止所述反应的方式来展示所述的酶联免疫吸附检测(ELISA)。 在450纳米处利用吸收分光光度计来读取所述的信号。所述的数 据表明，上述被选定的克隆能够以一种剂量依赖的方式与人类干 扰素γ(hIFNγ)进行结合并且当与一种阳性对照的单链抗体片 段(scFv)A6相比时能够提供一种非常良好的信号，其中所述 的单链抗体片段(scFv)A6对人类干扰素γ(hIFNγ)具有高 度的亲和力(附图20)。

实施例14：单链抗体片段(scFv)对由干扰素γ诱导的报告基因的表达所产生的抑制作用

按照上文中的描述，制备一组选定的单链抗体片段(scFv) 并且对其进行纯化，其中所述的单链抗体片段(scFv)能够对人 类干扰素γ(hIFNγ)产生特异性，并且对其所具有的封闭所述 的人类干扰素γ(hIFNγ)的生物学活性的能力进行测试。将一 种报告基因(萤火虫荧光素酶)转染至所述的人类恶性黑素瘤细 胞系Me67.8之中，其中所述的报告基因是受到所述的可诱导人 类干扰素γ(hIFNγ)的GBP1启动子的驱动的。利用2纳克/ 毫升的人类干扰素γ(hIFNγ)对各种不同浓度的单链抗体片段 (scFv)进行培养并且在此之后将其添加到所述的细胞培养液之 中。经过6小时的培养时间之后，进行所述的荧光素酶报告检测， 并且对所述的发光强度进行测量。将所述的活性与另外一种单链 抗体片段(scFv)进行比较，其中所述的单链抗体片段(scFv) 是从另外一个人类单链抗体片段(scFv)抗体文库中分离出来的， 所述的人类单链抗体片段(scFv)抗体文库是通过对来自于人类 供体的所述的可变重链(VH)/可变轻链(VL)个体所进行的传 统方式上的捕获来构建的(克隆G9)。所述的数据表明，无论是 从合成性的人类多样性文库还是从天然的人类多样性文库(AE1 以及AD1)中分离得到的单链抗体片段(scFv)都能够以一种剂 量依赖的方式对人类干扰素γ(hIFNγ)所具有的生物学活性进 行抑制(附图21)。这样的单链抗体片段(scFv)所具备的抑制 能力优于所述的基准单链抗体片段(scFv)克隆G9。

实施例15：单链抗体片段(scFv)对由干扰素γ诱导的II型主要组织相容性复合体(MHC)的表达所产生的抑制作用

进行一项流式细胞术检测，用于识别出一种完全人类免疫球 蛋白G(IgG)抗体，或者是所述抗体的片段，其中所述的抗体 或者抗体片段能够对II型主要组织相容性复合体(MHC)分子 的表达进行阻滞，其中所述的表达是利用人类干扰素γ(hIFNγ) 来进行诱导的。在将所述的Me67.8细胞放置于培养板中之后， 在存在有各种不同浓度的备选的完全人类抗-干扰素γ(IFNγ) 单克隆抗体的条件下，向培养物中添加5纳克/毫升的重组人类干 扰素γ(IFNγ)。经过了48小时的培养之后，利用经过荧光素 标记的抗-人类II型主要组织相容性复合体(MHC)抗体 (HLA-DR)对细胞进行染色并且使用一种FACSCalibur对其进 行分析。因此，可以对每一种备选抗体所具有的IC50(其中所述 的II型主要组织相容性复合体所进行的表达受到50％程度的抑 制，即，50％的抑制浓度，其中所述的表达是利用干扰素γ(IFN γ)来进行诱导的)进行测量。

所述的经过纯化的完全人类单链抗体片段(scFv)是按照上 文中所进行的描述来制备得到的。对所选定的单链抗体片段 (scFv)对II型主要组织相容性复合体(MHC)在恶性黑素瘤 上所进行的表达所产生的作用进行评价，其中所述的评价是使用 上文中所描述的基于细胞的流式细胞术检测方法来实现的，所述 的表达是利用干扰素γ(IFNγ)来进行诱导的。这样的单链抗 体片段(scFv)能够对II型主要组织相容性复合体(MHC)在 恶性黑素瘤上所进行的表达产生抑制作用，其中所述的表达是利 用干扰素γ(IFNγ)来进行诱导的(附图22)。

实施例17：将单链抗体片段(scFv)重新格式化(reformatting)为免疫球蛋白G(IgG)的形式

利用特异性的寡核苷酸对筛选出来的单链抗体片段(scFv) 所具有的重链可变(V_H)序列以及轻链可变(V_L)序列进行扩增， 从而在所述的5’末端上导入一个前导序列以及一个HindIII限制 性位点。将一个ApaI位点导入到所述重链的3’末端之上，而分 别在所述的λ轻链序列或者所述的κ轻链序列的3’末端上导入 一个AvrII位点以及一个BsiWI位点。利用HindIII/ApaI对上述 经过扩增的可变重链(V_H)序列进行消化并且将其克隆至所述的 pCon-γ1表达载体(LONZA，巴塞尔，瑞士)之中。利用 HindIII/AvrII对上述经过扩增的可变轻链(V_L)λ序列进行消化 并且将其克隆至所述的pCon-λ2表达载体之中并且利用 HindIII/BsiWI对上述经过扩增的可变轻链(V_L)κ序列进行消化 并且将其克隆至所述的pCon-κ表达载体(LONZA，巴塞尔，瑞 士)之中。通过测序的方式对所述的构建进行验证并且在此之后 将其转染至哺乳动物细胞中去。

将存在于它们适合的表达载体之中的所述的重链可变(V_H) 以及轻链可变(V_L)的cDNA序列转染至哺乳动物细胞中去，其 中使用到了所述的Fugene 6转染试剂(Roche，巴塞尔，瑞士)。 简要的说，在6孔培养板内对峰值细胞(Peak cells)进行培养， 其中所述的培养是在2毫升的培养介质中进行的，所述的峰值细 胞(Peak cells)具有每孔6x10⁵个细胞的浓度水平，在所述的 培养介质中含有胎牛血清。将所述的表达载体共同转染至所述的 细胞之中，其中所述的表达载体能够编码所述的备选重链可变 (V_H)序列以及轻链可变(V_L)序列，所述的转染是依照制造商 的说明书利用所述的Fugene 6转染试剂来实现的。在经过转染之 后的第一天，将所述的培养介质抽吸出去，并且向所述的细胞中 添加3毫升新鲜的不含有血清的介质并且在37℃下对其进行三 天的培养。经过三天的培养时期之后，收集含有免疫球蛋白G (IgG)的所述上清液，并且依照制造商的说明书在蛋白质G-琼 脂糖凝胶4B快速流动柱(Sigma，St.Louis，MO)上对其进行纯 化。简要的说，在4℃下，对来自于经过转染的细胞的上清液进 行过夜的培养，其中所述的培养是利用ImmunoPure(G)免疫球 蛋白G(IgG)结合缓冲液(Pierce，Rockford IL)来进行的。在 此之后使样本流经蛋白质G-琼脂糖凝胶4B快速流动柱并且因而 能够使用洗脱缓冲液对所述的免疫球蛋白G(IgG)进行纯化。 在此之后利用磷酸盐缓冲液(PBS)对上述经过洗脱的免疫球蛋 白G(IgG)馏分进行透析并且通过在280纳米处的吸光值对所 述的免疫球蛋白G(IgG)的含量进行量化。通过十二烷基硫酸 钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对纯度以及免疫球蛋白G (IgG)的完整性进行验证。

实施例17：免疫球蛋白G(IgG)对干扰素γ的生物学活性所产生的抑制作用

按照实施例16中所描述的内容，将两种单链抗体片段(scFv) AE1-4-R3-P2E4(2E4)以及A2-AD1-R4P1A9(1A9)重新格式 化为免疫球蛋白G(IgG)，其中在功能性检测中已经证实了上述 两种单链抗体片段(scFv)已经具有针对人类干扰素γ(hIFNγ) 的抑制性活性，并且按照实施例14中所描述的干扰素γ诱导的 报告基因检测中对所述的单链抗体片段(scFv)进行测试。在附 图23中所表示的结果表明，当呈现一种免疫球蛋白G(IgG)的 形态时，1A9以及2E4均能够对所述的人类干扰素γ(hIFNγ) 所具有的活性进行抑制，所具有的IC₅₀分别为42纳摩以及10纳 摩，而一种阴性对照的免疫球蛋白G(IgG)(NI-0701)在这项 检测中没有产生功效。因此从合成性的多样性文库以及天然的多 样性文库中分离得到的这两种备选物可以被重新格式化成为完 全的免疫球蛋白G(IgG)并且能够表现出对所述被选定的靶向 所具有的活性进行的抑制。

实施例18：用于在小鼠的血清内进行5E3的探测的药物代谢动力学检测的开发

按照实施例16中所描述的内容，将两种单链抗体片段(scFv) 备选物AD15E3R3P1 A4以及AD25E3R3P1 G11重新格式化为 完全的人类免疫球蛋白G(IgG)，其中上述的两种单链抗体片段 (scFv)备选物能够与小鼠的单克隆抗体5E3(附图19)发生特 异性的结合。已经在酶联免疫吸附检测(ELISA)中对上述相应 的免疫球蛋白G(IgG)DA4以及G11所具有的特异性进行了证 实，其中所述的特异性指的是针对小鼠5E3以及上述单克隆抗体 的一种嵌合版本所具有的特异性，在所述的嵌合版本中所述的小 鼠可变区域已经被融合至大鼠的恒定免疫球蛋白G(IgG)区域 之中了。在附图24中所表示出的结果证明了所述的免疫球蛋白 G(IgG)DA4以及G11对于所述的5E3的可变区域具有特异性， 因为它们能够与小鼠以及嵌合大鼠的5E3进行结合并且不能够 与小鼠以及大鼠的同型体对照物进行结合。这两种单克隆抗体被 用来开发一种检测，用于对存在于小鼠的血清之中的所述5E3进 行量化，从而进行药物代谢动力学研究。利用5微克/毫升的小鼠 5E3对几种稀释度的小鼠血清进行脉冲(spike)并且通过特定的 方式对其进行连续的稀释，使得在整个的稀释梯度过程中所述的 血清浓度维持在恒定状态上。利用1微克/毫升的免疫球蛋白G (IgG)DA4或者免疫球蛋白G(IgG)G11对Maxisorb培养板 (Nunc，Denmark)进行过夜的覆盖。在利用磷酸盐缓冲液(PBS) 进行封闭之后，向所述的孔内添加1％的牛血清白蛋白(BSA) 稀释梯度的上述经过脉冲的(spiked)血清制品。经过培养以及 洗涤之后，使用一种抗-小鼠κ轻链单克隆抗体使所述的信号进 行展现，其中所述的单克隆抗体与辣根过氧化物酶(HRP)以及 一种荧光底物(Amplex red；Invitrogen)进行了偶联。所述的结 果表明两种抗体都能够被用来对存在于小鼠的血清之中的所述 的小鼠单克隆5E3抗体进行特异性的探测(附图25)。存在于血 清之中的小鼠5E3所具有的探测极限为大约200纳克/毫升并且 所述的血清浓度并没有给所述的检测带来显著性的影响，这表明 免疫球蛋白G(IgG)DA4以及免疫球蛋白G(IgG)G11对小鼠 的5E3具有高度的特异性并且不会与其他的小鼠免疫球蛋白进 行结合。这些试验证明了可以从所述的天然文库或者合成性文库 AE1以及AD1中分离得到具有高度的特异性的抗-个体基因型的 抗体。

实施例19：使用含有可变重链互补决定区域3(CDRH3)多样性的文库所进行的噬菌体筛选，其中所述的可变重链互补决定区域3(CDRH3)多样性是从天然小鼠以及经过免疫的小鼠中捕获到的

在实施例8以及实施例9中所描述的MnA文库、MiB文库 以及MiC文库被用来以平行的方式进行噬菌体的筛选，其中所 述的筛选是针对人类干扰素γ(hIFNγ)所进行的筛选，是依照 在实施例11中所描述的操作步骤来进行的。在所述的筛选步骤 的过程中可以观察到一种类似的噬菌体的富集(附图26)。

在微滴定板形式中单链抗体片段(scFv)所进行的表达：将 单个的克隆摘取放置于微滴定板内并且在37℃下使其进行5-6小 时的生长(100-120rpm)，其中在所述的微滴定板的每个孔内含 有150微升的2xTYAG培养基(2％的葡萄糖)。在280rpm下对 培养板进行离心，丢弃所述的培养基并且将所述的细胞小球重新 悬浮在100微升的2xTYA培养基中，其中在所述的培养基中含 有1毫摩的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。在30℃下 在振荡条件下(100rpm)对所述的培养板进行过夜的培养。经 过生长之后，在3200rpm的条件下对培养板进行10分钟的离心 并且将所述的上清液小心的转移至一个培养板内，其中在所述的 培养板内含有2倍浓缩的磷酸盐缓冲液(PBS)，在所述的磷酸盐 缓冲液(PBS)中含有5％的脱脂乳粉末，用于进行封闭。

单链抗体片段(scFv)的酶联免疫吸附检测(ELISA)：利用 2微克/毫升的人类干扰素γ(hIFNγ)对酶联免疫吸附检测 (ELISA)培养板(Maxisorb，NUNC)进行过夜的覆盖，其中 所述的人类干扰素γ(hIFNγ)是存在于磷酸盐缓冲液(PBS) 之中的。利用2微克/毫升的重组牛血清白蛋白(BSA)(Sigma) 对对照培养板进行覆盖。在此之后在室温条件下利用3％的脱脂 乳/磷酸盐缓冲液(PBS)对培养板进行1小时的封闭。利用磷酸 盐缓冲液(PBS)以及0.05％的吐温20对培养板进行三次洗涤并 且在此之后对所述的经过预先封闭的单链抗体片段(scFv)上清 液进行转移并且在室温条件下对其进行一小时的培养。在此之后 利用磷酸盐缓冲液(PBS)以及0.05％的吐温20对培养板进行三 次洗涤。向每个孔内添加50微升3％的脱脂乳/磷酸盐缓冲液 (PBS)，其中在所述的磷酸盐缓冲液(PBS)中含有(辣根过氧 化物酶)(HRP)-共轭的抗-cMyc抗体(以1∶5000的水平对其 进行稀释)。经过在室温条件下对其进行的1小时的培养之后， 利用磷酸盐缓冲液(PBS)以及0.05％的吐温20对所述的培养板 进行5次洗涤。在此之后通过添加50微升的Amplex Red (Invitrogen)的方式对所述的酶联免疫吸附检测(ELISA)进行 展示。在530纳米处进行激发，并且在590纳米处对荧光强度进 行测量。针对所述的三个文库，在进行过每一轮的筛选之后，对 能够给出所述的对照A6克隆所具有的强度的一半的信号的采样 数所出现的频率进行评价(附图27)。与所述的其他两个文库相 比而言，从所述的MiB文库中获得的所述的命中率显著较高并 且对来自于所述的MiB文库中的所述克隆而言，所述的信号所 具有的平均水平是较高的，这表明具有更高的亲和性的单链抗体 片段(scFv)被得以富集(附图28)。为了对这种观察结果进行 证实，对阳性的克隆进行测序，使其进行大规模的表达，并且依 照实施例13中的描述对其进行纯化从而在剂量应答结合试验中 对其进行测试。与那些来自于所述的天然MnA文库中的单链抗 体片段(scFv)相比，所述的来自于MiB文库中的单链抗体片段 (scFv)全部对人类干扰素γ(hIFNγ)具有较高的明显的亲和 力(附图29)。所述的结果表明，所述的来自于小鼠的可变重链 互补决定区域3(CDRH3)个体可以被捕获至一种人类抗体骨架 环境中，其中利用一种蛋白质对所述的小鼠进行了免疫，所述的 捕获是以一种多产的方式来实现的，从而能够以更高的频率建立 高亲和性的人类抗体片段。使用本发明所述的方法建立起来的文 库因此能够代表着一种强有力的建立抗体的手段，其中所述的抗 体具有治疗潜能。

其他实施方式

尽管本发明已经通过其中的详细说明被进行了描述，前述的 说明意在进行描述并且并不构成对本发明所具有的范围的限制， 所述的范围是由后附的权利要求所具有的范围来定义的。其他的 方面、优点、以及修饰都落入下述的权利要求所具有的范围之内。