用于治疗多发性骨髓瘤的联合治疗

摘要

本发明提供了一种治疗受试者的多发性骨髓瘤的方法，包括对该受试者给予化合物1与硼替佐米的组合的步骤。本发明进一步提供了一种治疗受试者的多发性骨髓瘤的方法，包括对该受试者给予化合物1与美法仑的组合的步骤。

说明书

技术领域

用于多发性骨髓瘤的联合药物治疗。

背景技术

多发性骨髓瘤(MM)，一种浆细胞瘤，构成了所有血液系统恶性 肿瘤的约10％(1)。蛋白酶体抑制剂(PI)硼替佐米在MM中的临床 成功验证了泛素蛋白酶体系统(UPS)作为一种用于药物发展的引人注 意的靶标(2)。蛋白酶体是一种多亚基蛋白复合体，负责降解错折叠 的以及损伤的蛋白连同细胞内信号中间体(3)。由于它们的调节异常 的信号传导途径，赘生性细胞很大程度上依赖于UPS，并且因此，对 于蛋白酶体的抑制作用是特别敏感的(4)。在蛋白酶体的抑制作用之 后MM细胞的凋亡通过多种机理发生，包括下调促存活NF-κB信号、 抑制血管发生、激活错折叠的蛋白胁迫应答、诱导内在的以及外在的 细胞死亡路径、以及抑制MM细胞附着到骨髓基质细胞上(5-8)。

在复发的MM中两个成功的单试剂II期试验之后，2003年，临床 发展的第一PI，硼替佐米(还被称为PS-341或[(1R)-3-甲基-1-({(2S)-3- 苯基-2-[(吡嗪-2-基羰基)氨基]丙酰基}氨基)丁基]硼酸)被PDA批准(9， 10)。硼替佐米与其他药剂结合也显示出了显著的活性。在临床前研 究中，亚毒性浓度的硼替佐米克服了MM细胞对化学治疗药(包括美 法仑、阿霉素或米托蒽醌)的耐受性(11-13)。此外，硼替佐米增强 了用于MM的新颖的疗法的活性，包括来那度胺、三氧化二砷、以及 组蛋白脱乙酰基酶或PKC的抑制剂，连同二代PI(14-18)。协同的体 外活性转变为增强了测试基于硼替佐米的联合治疗的临床研究中的体 内疗效。在对具有或没有硼替佐米(V)的美法仑以及泼尼松(MP) 进行评估的第III期VISTA试验中，与对于MP治疗59％相比(P＝ 0.003)，VMP与3年总存活率72％相关(19)。值得注意地，在某些 情况下，将硼替佐米加入到一个方案中可以令对治疗失效的患者再度 敏感。例如在第II期研究中，美法仑治疗之后复发的60％的MM患者 随后对硼替佐米/美法仑的联合治疗有响应(20)。类似地，硼替佐米 联合沙利度胺以及地塞米松在MM患者的复发人群中产生了63％的总 响应率，他们中73％已经早先暴露于沙利度胺(21)。

尽管硼替佐米的批准改变了MM的治疗，但是相当大比例的患者 未能对硼替佐米治疗作出响应。一项最近研究的结果表明了不同的蛋 白酶体表达以及活性水平可能构成MM肿瘤对使用PI的处理的可变灵 敏度的基础(22)。此外，甚至是最初对硼替佐米响应的患者也面临 了几乎是必然的复发。越来越多的证据表明了小群体的抗药性癌干细 胞可能对缓和之后的MM的复发有责任(23-26)。这些细胞表达了正 常的记忆性B细胞的表面抗原特征，缺乏血浆细胞标记CD138，并且 不会分泌抗体(24)。此外，当面对通常使用的抗骨髓瘤药物(例如 地塞米松、来那度胺、环磷酰胺)时，CD138-阴性干细胞群体表现出 比其余的恶性细胞群体的更大的耐药性(24)。例如，单试剂的硼替 佐米对抗产生大量的免疫球蛋白的MM细胞是活性的(27)，但是对 CD138-阴性MM细胞的生长具有极小的作用(24)。这些数据突出了 对于靶向癌干细胞、连同肿瘤群体内的其余的恶性浆细胞亚型的新的 MM疗法的需要。

对于新颖的、更有效的或更好容忍的PI的研究导致了化合物1的 合成(还称为[(1R)-1-[[(2S，3R)-3-羟基-2-[6-苯基-吡啶-2-羰基)]氨基]-1- 氧代丁基]氨基]-3-甲基丁基硼酸；Bernardini等人，美国申请号US 2005/0107307)。像硼替佐米一样，化合物1是肽硼酸类别中的一种可 逆的PI(28)。与通过静脉(IV)浓集给药的硼替佐米相比，化合物1 在临床前研究中作为一种口服配制品是活性的(28，29)。此外，当 与硼替佐米相比时，在体外的原发性MM浆细胞内以及在体内的 RPMI8226MM异种移植物内化合物1均显示出相似的或更好的单一药 剂抗肿瘤活性(29)。化合物1具有以下化学结构：

对于可以为多发性骨髓瘤患者提供最好的长期结果的治疗选择仍 然存在着一种需要。这种需要对于用于复发的或难治疗疾病的患者的 新疗法是尤其迫切的。直到在此披露的研究，化合物1与硼替佐米或 美法仑的联合治疗还从未进行研究。这些联合治疗为MM患者(包括 那些具有复发的或难治疗的疾病的患者)提供了有吸引力的治疗选择。

所有引用的参考文献通过引用结合在此。

概述

提供了使用化合物1治疗受试者的多发性骨髓瘤的方法。在一个 实施方案中，给予该受试者化合物1与硼替佐米的组合。优选地，该 硼替佐米作为药物前体进行给药。优选地，该硼替佐米通过静脉内或 口服进行给药。

优选地，该硼替佐米给药的剂量是在约0.5mg/m²至约2mg/m²的 范围内。优选地，该硼替佐米给药的剂量是在约0.7mg/m²至约1.3 mg/m²的范围内。

优选地，该硼替佐米按照给药方案周期进行给药，其中硼替佐米 的给药是每3至7天持续2至4周，接着是约7至21天的休止期，在 这个休止期过程中不给予硼替佐米。优选地，该硼替佐米按照给药方 案周期进行给药，其中硼替佐米是在21天周期的第1、4、8以及11 天给予的。优选地，该硼替佐米按照给药方案周期进行给药，其中硼 替佐米是在28天周期的第1、4、8以及11天给予的。优选地，该方 案周期重复至少一次。

在另一个实施方案中，给予该受试者化合物1与美法仑的组合。 优选地，该美法仑作为药物前体进行给药。优选地，该美法仑通过口 服或静脉内进行给药。

优选地，该美法仑给药的剂量是在约0.025mg/kg至约0.5mg/kg 的范围内。优选地，该美法仑给药的剂量是在约0.025mg/kg至约0.3 mg/kg的范围内。

优选地，该美法仑按照给药方案周期进行给药，其中美法仑的给 药是每3至7天持续1至2周，接着是约4-6周休止期，在这个休止期 过程中不给予美法仑。优选地，该美法仑按照给药方案周期进行给药， 其中美法仑的给药是每天一次持续约4至约7天，接着是约4-6周的休 止期。优选地，该美法仑按照给药方案周期进行给药，其中美法仑的 给药是每天一次持续约4至约5天，接着是约4-6周的休止期。优选地， 该方案周期重复至少一次。

优选地，该化合物1作为药物前体进行给药。优选地，该化合物1 药物前体是化合物1的药学上可接受的酯的形式。优选地，该化合物1 通过静脉内或口服进行给药。

优选地，该化合物1给药的剂量是在约0.5mg/m²至约5mg/m²的 范围内。优选地，该化合物1给药的剂量是在约1mg/m²至约3mg/m²的范围内。优选地，该化合物1按照给药方案周期进行给药，其中化 合物1的给药是每3至14天持续2至4周，接着是约7至21天的休 止期，在这个休止期过程中不给予化合物1。

优选地，该化合物1按照给药方案周期进行给药，其中化合物1 是在21天周期的第1、4、8以及11天给予的。优选地，该化合物1 按照给药方案周期进行给药，其中化合物1是在28天周期的第1、4、 8以及11天给予的。优选地，该化合物1按照给药方案周期进行给药， 其中化合物1是在28天周期的第1、8以及15天给予的。优选地，该 化合物1按照给药方案周期进行给药，其中化合物1是在21天周期的 第1以及15天给予的。优选地，该化合物1按照给药方案周期进行给 药，其中化合物1是在28天周期的第1以及15天给予的。优选地， 该方案周期重复至少一次。

优选地，该化合物1是在21天周期或28天周期的第1、5以及9 天给予的并且硼替佐米是在21天周期或28天周期的第3、8以及12 天给予的。优选地，硼替佐米是在21天周期或28天周期的第1、5以 及9天给予的并且该化合物是在21天周期或28天周期的第3、8以及 12天给予的。

附图说明

图1.化合物1作为一种单试剂或与其他抗MM疗法联合抑制了 MM细胞系的生存力。A，使用所指示的浓度的化合物1孵育48小时 后通过MTS测定评估了MM1S(三角形)以及RPMI8226(正方形) 的生存力。B，将MM1S细胞在所指示的浓度下暴露于载体对照物(黑 色条)、化合物1(白色条)、硼替佐米(带条纹的条)或这两种试剂 (阴影条)中48小时，并且通过MTS测定对生存力进行定量化。C， 将RPMI8226细胞暴露于载体对照物(黑色条)、美法仑米(40μM) (白色条)、化合物1(在所指示的浓度下)(带条纹的条)或这两种 试剂(阴影条)中48小时，并且通过MTS测定对生存力进行定量化。 曲线图的数据是使用6个重复实验的平均值的平均±标准偏差 (SEM)。在B和C中，联合指数(CI)在阴影条之上示出。C1值低 于0.9指示了协同活性；C1值在0.9与1.1之间指示了加和活性，并且 C1值高于1指示了拮抗活性。

图2.化合物1单独地或与硼替佐米联合并不能抑制正常外周血单 核细胞(PBMC)的生存力。A，将来自一位健康的志愿者的PBMC用 载体对照物(黑色条)、单独的化合物1(3.0nM)(白色条)、单独 的硼替佐米(所指示的浓度)(带条纹的条)、或化合物1(3.0nM) +硼替佐米(所指示的浓度)(阴影条)孵育48小时，之后通过MTS 测定对细胞生存力进行测定。B，将来自与在A中相同的健康志愿者的 PBMC用载体对照物(黑色条)、单独的硼替佐米(3.0nM)(白色条)、 单独的化合物1(所指示的浓度)(带条纹的条)、或化合物1(所指 示的浓度)+硼替佐米(3.0nM)(阴影条)孵育，之后使用MTS 测定对细胞生存力进行测定。C，将来自第二位健康的志愿者的PBMC 用载体对照物(黑色条)、单独的化合物1(3.0nM)(白色条)、单 独的硼替佐米(所指示的浓度)(带条纹的条)、或化合物1(3.0nM) +硼替佐米(所指示的浓度)(阴影条)孵育48小时，之后通过MTS 测定对细胞生存力进行测定。D，将来自3位健康志愿者的PBMC用 增加浓度的化合物1孵育48小时，之后使用MTS测定对细胞生存力 进行确定。每个图示(A-D)代表三个独立的实验。

图3.化合物1与硼替佐米联合诱导了MM细胞的凋亡。将 RPMI8226细胞用(A)载体对照物、(B)化合物1(2.5nM)，(C)硼 替佐米(2.5nM)或(D)化合物1(2.5nM)加硼替佐米(2.5nM)孵 育30小时，然后使用流式细胞术分析将对于碘化丙锭(PrI)以及膜联 蛋白V的染色阳性的百分比进行定量化。早期凋亡的细胞是PrI阴性并 且膜联蛋白V阳性的。

图4.化合物1抑制了人类MM肿瘤的生长。使用IV化合物1药 物治疗28天之后，与对照物相比血清hIgG水平(A)基本上是不可能 检测到的(对于1mg/kg，P＝0.0001并且对于3mg/kg，P＝0.0002)。 类似地，与在相同的时间点上使用单独的稀释剂治疗的小鼠相比，以1 或3mg/kg IV给予的化合物1减小了肿瘤的体积(B)(与对照相比， 对于每个剂量P＝0.0001)。从第21天开始，对于带有人类LAGκ-1B 肿瘤的小鼠使用载体对照物或所指示的浓度的化合物1每周治疗两次 持续该研究的持续时间，并且每周对肿瘤的体积进行评估。与对照物 治疗的小鼠相比，使用化合物1以3mg/kg IV或10mg/kg口服化合物 1每周两次治疗的小鼠在14天治疗之后显示出了显著地更小的肿瘤(C) (分别为P＝0.0008以及P＝0.0028)。数据展示为平均值的平均±标 准偏差，使用每组7-8只小鼠。

图5.化合物1与硼替佐米或美法仑联合显著地抑制了骨髓瘤肿瘤 的生长。所有这些研究中均是在第7天开始治疗。带有LAGκ-1A或 LAGκ-1B肿瘤的小鼠使用载体对照物、单独的化合物1(1mg/kg)、 单独的硼替佐米(0.5mg/kg)、或化合物1加硼替佐米(A-C)每周治 疗两次。在对照物治疗的以及联合疗法治疗的LAGκ-1A肿瘤之间的生 长差异首先在开始治疗后28天变得显著(对于A和B，分别为hIgG： P＝0.0028；肿瘤体积：P＝0.0265)。使用化合物1加硼替佐米治疗的 带LAGκ-1B的小鼠比载体治疗的小鼠在治疗21天之后发展了显著地 更小的肿瘤(C)(P＝0.0014)。化合物1与硼替佐米联合将LAGκ-1B 肿瘤体积的进展从35天延迟到70天。此外，治疗28天之后，接受联 合治疗的小鼠内的肿瘤与使用单独的PI治疗的那些相比也更小(对于 单独使用化合物1以及单独使用硼替佐米相比，分别为P＝0.0039以及 P＜0.0001)。化合物1与美法仑联合抑制了LAGκ-1A肿瘤的生长。 带有LAGκ-1A肿瘤的小鼠使用载体对照物每周两次、单独的化合物1 (1mg/kg)每周两次、单独的美法仑(1mg/kg)每周一次或化合物1 每周两次加美法仑(D-F)每周一次进行治疗。治疗3周之后，与载体 治疗的肿瘤相比，暴露于化合物1与美法仑的联合的肿瘤在hIgG分泌 (P＝0.0012)以及肿瘤体积(P＝0.032)两者方面显示出显著的减小 (分别为D和E)。化合物1与美法仑的联合也阻止了LAGκ-1B肿瘤 体积的增加。带有LAGκ-1B肿瘤的小鼠使用载体对照物每周两次、单 独的化合物1(1mg/kg)每周两次、单独的美法仑(3mg/kg)每周一 次或化合物1每周两次加美法仑每周一次进行治疗。当化合物1与美 法仑联合时，治疗三周之后，肿瘤体积减小到几乎不可能检出的程度 (F)，(P＝0.0019)。在部分A-F中，数据展示为平均值的平均±标 准偏差，使用每组7-8只小鼠。

图6.使用化合物1以及硼替佐米治疗的LAGκ-1B肿瘤显示出凋 亡的标记物诱导凋亡因子(AIF)表达的增加。使用载体对照物(A)、 单独的化合物1(1mg/kg)(B)、单独的硼替佐米(0.5mg/kg)(C)或 两种药剂(D)治疗之后，对从带有LAGκ-1B的小鼠上切下的肿瘤进 行切片并且对于AIF染色，图E-H，来自与使用同种型对照物染色的 A-D的相同的肿瘤的切片。对载玻片同时进行染色。

图7.口服化合物1抑制了人类MM肿瘤的生长。分别使用化合 物1以10mg/kg每周两次(hIgG：P＝0.0011；肿瘤体积：P＝0.001) 以及以5mg/kg(hIgG：P＜0.0001；肿瘤体积：P＜0.0001)每周一次 治疗三周以及四周之后，对副蛋白水平以及肿瘤体积的显著抑制(分 别为A和B)。在治疗五周过程中的体重变化(C)。类似地，以5mg/kg 每天一次或以10mg/kg每周两次给药在第35天导致了在LAGκ-1B模 型(D)中显著的肿瘤体积抑制(分别为P＝0.0327；P＝0.0018)。

说明性实施方案的详细说明

如在此使用的，当提及一个可测量的值，例如一个量值、持续时 间、等等时，术语“约”意思是包括从指定的值±10％的变化。例如， 短语“约50％”包括50％的±10％，或从45％至55％。

如在此处使用的，术语“受试者”被定义为温血动物，优选哺乳 动物，包括人。在一个优选实施方案中，该受试者是灵长类。在一个 甚至更优选实施方案中，该受试者是人。

提供了治疗受试者的多发性骨髓瘤的方法。在一个实施方案中， 给予该受试者化合物1与硼替佐米的组合。硼替佐米([(1R)-3-甲基 -1-({(2S)-3-苯基-2-[(吡嗪-2-基羰基)氨基]丙酰基}氨基)丁基]硼酸；由 Millennium Pharmaceuticals在商品名Velcade下推向市场的)具有以 下化学结构：

我们已经发现了使用根据本发明的化合物1与硼替佐米的组合来 治疗多发性骨髓瘤的方法协同地治疗了多发性骨髓瘤。这是出人意料 的，因为化合物1以及硼替佐米均是可逆的硼酸蛋白酶体抑制剂，这 些抑制剂通过激活外在的以及内在的凋亡信号传导途径诱导了细胞死 亡(7，29)。此外，两种药剂均主要是靶向蛋白酶体糜蛋白酶样的催 化活性，具有较小的半胱天冬酶样的抑制作用以及极小的胰蛋白酶样 活性抑制作用(29，34)。因此，化合物1以及硼替佐米看上去具有 类似的作用机理。此外，这些化合物具有非常类似的化学结构。因此， 化合物1与硼替佐米一起诱导了对抗体外的MM细胞以及体内肿瘤(特 别是非分泌型肿瘤)的增强的活性的手段并不清楚。

在另一个实施方案中，给予该受试者化合物1与美法仑的组合。 我们已经发现了使用根据本发明的化合物1与美法仑的组合来治疗多 发性骨髓瘤的方法协同地治疗了多发性骨髓瘤。

美法仑(4-[双(2-氯乙基)氨基]-L-苯丙氨酸；由GlaxoSmithKline在 商品名Alkeran下出售)具有以下化学结构：

在本发明中所使用的化合物1、硼替佐米和/或美法仑能以任何合 适的化学形式给予，包括作为药物前体，例如该母体化合物的药学上 可接受的盐的形式和/或药学上可接受的酯的形式。优选地，该母体化 合物的药学上可接受的盐或酯的衍生物在给药时转化成母体化合物。 如在此所使用的，“药学上可接受的盐”是指母体化合物的衍生物， 其中通过将该化合物制成它的酸式或碱式盐进行改性。药学上可接受 的盐的实例包括，但不限于：碱性残基(例如胺类)的无机或有机酸 式盐类；酸性残基(例如羧酸或硼酸类)的碱或有机盐类；以及类似 物。如在此所使用的，“药学上可接受的酯类”是指母体化合物的衍 生物，其中通过将一种酸残基制成它的一种酯而进行改性。药学上可 接受的酯的实例包括，例如，硼酸酯类(即，一种硼酸化合物的酯衍 生物)，以及环硼酸酯类。环硼酸酯类的实例包括但不限于：蒎烷二 醇硼酸酯、频哪醇硼酸酯、1，2-乙二醇硼酸酯、1，3-丙二醇硼酸酯、1，2- 丙二醇硼酸酯、2，3-丁二醇硼酸酯、1，1，2，2-四甲基乙二醇硼酸酯、1，2- 二异丙基乙二醇硼酸酯、5，6-癸二醇硼酸酯、1，2-二环己基乙二醇硼酸 酯、二环己基1，1′-二醇、以及1，2-二苯基-1，2-乙二醇硼酸酯。

因此，在某些实施方案中，该化合物1和/或硼替佐米作为母体化 合物的硼酸酯衍生物给予。在一个实施方案中，该化合物1作为化合 物1的硼酸酯衍生物给予。在一个实施方案中，该硼替佐米作为硼替 佐米的硼酸酯衍生物给予。

可以使用任何合适的给药方法。例子包括注射(皮下、静脉内、 胃肠外、腹膜内、鞘内、等等)、口服、吸入以及经皮给药。当通过 注射给予时，该注射可以是浓集或连续的输注。该化合物1以及硼替 佐米可以分开地(例如，作为顺序的注射、注射以及口服给药、或分 开的口服给药)或者作为混合物一起(例如，以单独的注射或单独的 口服给药，例如通过给予包含化合物1与硼替佐米两者的单片剂)给 予该受试者。以相同的方式，该化合物1以及美法仑可以分开地或作 为混合物一起给予该受试者。本发明的化合物在药学上可接受的组合 物中的比例或浓度可以变化，取决于许多因素，包括剂量、化学特征 (例如，疏水性)以及给药途径。

例如，硼替佐米适合于口服给药或静脉内注射。例如，硼替佐米 从Millennium Pharmaceuticals在商品名Velcade下可得，作为一次性 使用的小瓶中的无菌冻干粉末，它包括3.5mg的硼替佐米以及35mg 的膨胀剂甘露醇。这种粉末由临床医生使用3.5mL的0.9％NaCl进行 复水用于注射。该硼替佐米作为Velcade冻干的配制品中的一种甘露醇 硼酸酯而存在并且在复水之后作为与母体硼酸平衡的甘露醇硼酸酯存 在(42)。因此，在一个实施方案中，该硼替佐米通过静脉内(IV)注 射给予。在另一个实施方案中，该硼替佐米经口给药，优选地以一种 片剂或胶囊。在一个实施方案中，该硼替佐米以药物前体的形式(例 如一种硼酸酯)通过注射给予。在一个实施方案中，该硼替佐米以药 物前体的形式(例如一种硼酸酯)经口给予。

例如，美法仑适合于口服给药或静脉内注射。例如，美法仑从 Glaxo SmithKline在商品名Alkeran下可得，作为一种薄膜包衣片剂用 于口服给药或者作为一次性使用的小瓶中的无菌冻干粉末。该薄膜包 衣片剂包括2mg的美法仑以及赋形剂胶态二氧化硅、交聚维酮、羟丙 甲纤维素、聚乙二醇/PEG 400、硬脂酸镁、微晶的纤维素、以及二氧化 钛。这种冻干的粉末包括与50mg的美法仑等效的美法仑盐酸盐以及 20mg的聚乙烯吡咯酮。使用所提供的小瓶的无菌稀释液将这种粉末进 行复水用于注射，该稀释液包括0.2g柠檬酸钠、6.0mL的丙二醇、0.52 mL的乙醇(96％)以及用于注射的总计10mL的水(43)。因此，在 一个实施方案中，该美法仑作为盐酸盐通过静脉内(IV)注射给予。在 另一个实施方案中，该美法仑经口给药，优选地以一种片剂或胶囊。

例如，化合物1适合于通过IV给药或通过口服剂型例如以片剂或 胶囊给药(28，29)。例如，化合物1目前处于具有实体瘤或非何杰 金氏淋巴瘤的患者的人的第I期临床研究的评估中。在第I期研究中， 化合物1作为一次性使用小瓶中的无菌冻干粉末来提供，它包括4mg 的化合物1、196mg的膨胀剂羟丙基-β-环糊精以及156.8mg的膨胀剂 甘露醇。该粉末在注射之前使用5mL或10mL(取决于所打算的剂量) 无菌注射水(0.9％NaCl)、或5％的甘露醇进行复水。因此，在一个 实施方案中，该化合物1通过静脉内(IV)注射给予。在另一个实施方 案中，该化合物1经口给药，优选地以一种片剂或胶囊。在一个实施 方案中，该化合物1以药物前体的形式(例如一种硼酸酯)通过注射 给予。在一个实施方案中，该化合物1以药物前体的形式(例如一种 硼酸酯)经口给予。

化合物1与硼替佐米或化合物1与美法仑的组合优选地以对于治 疗多发性骨髓瘤有效的量值给予，例如对于预防、减轻、或改善疾病 的症状、延长正在治疗的受试者的存活率、防止不希望的细胞生长、 或减小在受试者中已经存在的良性细胞群或恶性肿瘤的尺寸。根据在 此提供的详细披露内容以及实例，确定该组合中每种药剂的有效量值 是在本领域普通技术人员的能力之内。该有效量值可以变化，取决于 以下因素，例如正在治疗或抑制的细胞生长的类型、受试者的大小、 癌细胞生长或肿瘤的严重性、给药的频率(例如，每天一次对比几天 一次)、化合物给药的方式、患者的健康以及并发病情况、处方医师 的判断以及经验(例如，使用相同的或类似的药物)、给药的方法、 所给予的剂型的生物利用率特征、所选择的给药方案、以及并行治疗 的类型(例如附加的化学治疗剂)。例如，美国专利号5,427,916描述 了用于预测抗肿瘤治疗在单个的患者内的有效性的方法，并且展示了 一些可以与本发明的治疗方案结合使用的方法。例如，有效的剂量可 以从体外或动物模型试验系统内衍生的剂量反应曲线外推，并且可以 是基于该患者的表面积。

治疗能以较小的剂量起始，这些剂量小于该化合物的最适宜剂量。 此后，能以小增幅增加该剂量，直至达到在这些情况下的最适宜效应。 如果希望的话可以将总体的每日剂量分开，并且在该天内以多个部分 给药。为了使剂量方案最佳化，化合物1与硼替佐米或化合物1与美 法仑联合治疗多发性骨髓瘤的有效性可以通过比较在经受抗癌治疗的 患者所获得的两个或更多该时间点上的肿瘤测量进行监测。总体上， 优选的是在开始治疗之前从患者获得初始的肿瘤负荷评估并且在治疗 过程中在不同的时间点获得一个或多个另外的评估。在这样一种使用 中，在治疗之前确定了肿瘤负荷的一个基线确定并且在治疗的过程中 确定了癌症肿瘤内的变化。作为替代方案，在治疗的过程中可以做出 两个或更多个顺序的测定而无需肿瘤负荷的一个预处理基线测量。在 这样一种使用中，应该从受试者做出肿瘤负荷的第一评估作为一个基 线水平用于确定肿瘤负荷是正在增加或减小。

化合物1与硼替佐米或化合物1与美法仑的给药方案例如给药时 间安排和/或顺序可以进行改变，取决于以下因素，例如每种剂型的药 物代谢动力学、正在治疗或抑制的细胞生长的类型、受试者的大小、 癌细胞生长或肿瘤的严重性、以及有效的剂量。化合物1与硼替佐米 或化合物1与美法仑的给药时间安排和/或顺序可以由治疗医师很容易 地进行改变以根据以上考虑以及本详细披露内容使效率优化并且副作 用最小化。

根据本发明对于化合物1、硼替佐米、以及美法仑的给药方案存在 很大的灵活性。在某些实施方案中，该给药方案可以从已知的对于这 些药物适当的给药方案进行适配。例如，硼替佐米(1.3mg/m²)已经 被核准用于通过作为3-5秒的浓集IV注射与口服美法仑(9mg/m²)以 及口服泼尼松(60mg/m²)给药持续九个如表1中示出的6周治疗周期 而治疗以前未能治疗的多发性骨髓瘤。在周期1-4中，硼替佐米每周两 次在第1、4、8、11、22、25、29以及32天给予。在周期5-9中，硼 替佐米每周一次在第1、8、22以及29天给予(42)。

如果在该治疗方案的过程中观察到了显著的药物相关的毒性(例 如，血液毒性)，则可以跳过和/或减少随后的硼替佐米剂量(例如， 从1.3mg/m²至1mg/m²，并且有可能至0.7mg/m²)。另外地或可替代 地，在下一个周期中美法仑不能减少25％(42)。

作为另一个实例，硼替佐米被核准通过作为3-5秒的浓集IV注射 在3周周期的第1、4、8以及11天给药接着是10天(第12-21天)的 休止期而治疗复发的或难治的多发性骨髓瘤。对于多于8周的延长的 治疗，硼替佐米可以按标准的方案或者每周一次持续4周(第1、8、 15以及22天)接着13天(第23-35)的休止期的一个维持方案而给药 (42)。

如果在该治疗方案的过程中观察到了显著的药物相关的毒性(例 如，血液毒性、神经病性疼痛和/或周围神经病变)，则可以跳过和/或 减少随后的硼替佐米剂量(例如，从1.3mg/m²至1mg/m²，并且有可 能至0.7mg/m²)(42)。

对于在本发明的联合中的应用，该硼替佐米方案可以是与经核准 的多发性骨髓瘤方案类似的或不同的，包括以上提出的那些。例如， 该硼替佐米可以比经核准的方案多少更频繁地进行给药，并且可以任 选地以更高或更低的剂量给药。

该硼替佐米能以任何合适的剂量与化合物1结合而给药。适当的 硼替佐米的剂量可以是在约0.5mg/m²至约7mg/m²的范围内，如约0.5 mg/m²至约5mg/m²，例如约0.5mg/m²至约3mg/m²。适当的硼替佐米 剂量典型地是范围从约0.5mg/m²至约2mg/m²。优选地，该硼替佐米 的剂量是在约0.6mg/m²至约1.5mg/m²的范围内。更优选地，该硼替 佐米的剂量是在约0.7mg/m²至约1.3mg/m²的范围内。优选的硼替佐 米剂量包括但不限于0.7mg/m²、1mg/m²、或1.3mg/m²。以上的剂量 适合于任何硼替佐米给药的方法，并且尤其是适合于皮下或静脉内给 药，其中静脉内给药是优选的。硼替佐米的口服剂量典型地是在以上 范围的最高端处，例如约1mg/m²至约5mg/m²的范围内，约1.5mg/m²至约4mg/m²，或约2mg/m²至约3mg/m²。

该硼替佐米可以根据任何合适的方案与化合物1以上述的剂量而 给药。该硼替佐米剂量的量值在该给药方案内可以是恒定的或变化的。 优选地，该硼替佐米剂量在该方案过程中保持在一个恒定的水平，除 非观察到显著的药物相关的毒性，在这种情况下，随后的剂量可以减 少例如约20％-30％。该硼替佐米可以在与化合物1相同的或不同的天 给药。在一个实施方案中，在方案过程中该硼替佐米和化合物1可以 在相同的天给药。适当的硼替佐米方案典型地范围是从一天一次的剂 量至一周一次的剂量或甚至一个月一次的剂量。优选地，该硼替佐米 以比每天一次更不频繁地给药，例如每2-14天一次的剂量。优选地， 该硼替佐米以每3至7天、例如每3至4天一次给药。优选地，该方 案包括，在使用硼替佐米治疗一或多周(例如2、3、或4周)之后， 一个至少5天(例如，约7至21天的时期)的不给予硼替佐米的时期。 优选地，该休止期是约10至17天，例如约10天或约17天。例如， 该硼替佐米可以在21天周期的第1、4、8以及11天给药，其中第12-21 天是休止期。作为另一个实例，该硼替佐米可以在28天周期的第1、4、 8以及11天给药，其中第12-28天是休止期。作为另一个实例，该硼 替佐米可以每周一次持续4周(例如一个35天周期的第1、18、15以 及22天)进行给药，接着是13天的休止期(例如一个35天周期的第 23至35天)。这种计划的给药周期可以重复一次或多次。例如，该计 划的周期可以重复至观察到最大的响应，再加一个或两个额外的周期。 作为另一个实例，该计划的周期可以重复6至12个周期。任选地，完 成该初始周期之后，可以使用一个“维持方案”，其中该硼替佐米以 比在该初始方案中更不频繁地进行给药，例如每周一次或每两周一次。 该维持方案可以继续持续一个固定的时期，总体上是1-2年亦或不确定 地只要患者继续表现出没有疾病进展的迹象并且容忍这种治疗而没有 显著的毒性。

该化合物1能以任何合适的剂量与硼替佐米结合而给药。适当的 化合物1的剂量可以是在约0.5mg/m²至约10mg/m²的范围内，如约 0.5mg/m²至约5mg/m²，或约0.5mg/m²至约3mg/m²。适当的化合物 1剂量典型地是范围从约0.5mg/m²至约3mg/m²。优选地，该化合物1 的剂量是在约1mg/m²至约3mg/m²的范围内。更优选地，该化合物1 的剂量是在约1.5mg/m²至约2.5mg/m²的范围内。优选的化合物1的 剂量包括但不限于1.1mg/m²、1.5mg/m²、1.8mg/m²、2.1mg/m²、或 2.4mg/m²。以上的剂量适合于任何化合物1给药的方法，并且尤其是 适合于皮下或静脉内给药，其中静脉内给药是优选的。化合物1的口 服剂量典型地是处于以上范围的最高端处，例如约1mg/m²至约7 mg/m²。在一个实施方案中，该化合物1的口服剂量可以是约2mg/m²至约6mg/m²，如约3mg/m²至约5mg/m²。示例性的化合物1的口服 剂量包括但不限于2mg/m²、3mg/m²、4mg/m²、5mg/m²、或6mg/m²。

该化合物1可以根据任何合适的方案与硼替佐米以上述的剂量而 给药。该化合物1剂量的量值在该给药方案内可以是恒定的或变化的。 优选地，该化合物1剂量在该方案过程中保持在一个恒定的水平，除 非观察到显著的药物相关的毒性，在这种情况下，随后的剂量可以减 少例如约20％-30％。该化合物1可以与硼替佐米在相同的或不同的天 给药。在一个实施方案中，在方案过程中该化合物1和硼替佐米可以 在相同的天给药。适当的硼替佐米方案典型地范围是从一天一次的剂 量至一周一次的剂量或甚至一个月一次的剂量。优选地，该化合物1 以比每天一次更不频繁地给药，例如每2-14天一次的剂量。优选地， 该化合物1以每3至28天，例如每7至21天一次给药。例如，该化 合物1可以每周两次进行给药。在另一个实例中，该化合物1可以每 周一次进行给药。在另一个实例中，该化合物1可以每两周一次进行 给药。优选地，该方案包括，在使用化合物1治疗一或多周(例如2、 3、或4周)之后，至少5天(例如，约7至21天的时期)的不给予 化合物1的时期。优选地，该休止期是约10至17天，例如约10天或 约17天。例如，该化合物1可以在21天周期的第1、4、8以及11天 给药，其中第12-21天是休止期。在另一个实施方案中，该化合物1 可以在28天周期的第1、4、8以及11天给药，其中第12-28天是休止 期。在另一个实施方案中，该化合物1可以在28天周期的第1、8以 及15天给药，其中第16-28天是休止期。在另一个实施方案中，该化 合物1可以在21天周期的第1以及8天给药，其中第12-21天是休止 期。在另一个实施方案中，该化合物1可以在28天周期的第1以及8 天给药，其中第12-28天是休止期。在另一个实施方案中，该化合物1 可以在21天周期的第1以及15天给药。在另一个实施方案中，该化 合物1可以在28天周期的第1以及15天给药。如以上提及的，该硼 替佐米可以在该方案的相同的或不同的天给药。例如，该化合物1以 及硼替佐米两者可以在21天周期的第1、4、8以及11天给药。在另 一个实施方案中，该化合物1以及硼替佐米两者可以在28天周期的第 1、4、8以及11天给药。在另一个实施方案中，该硼替佐米可以在21 天周期的第1、4、8以及11天给药，而化合物1可以在该21天周期 的第1以及8天给药。在另一个实施方案中，该硼替佐米可以在28天 周期的第1、4、8以及11天给药，而化合物1可以在该28天周期的 第1以及8天给药。在另一个实施方案中，该硼替佐米可以在28天周 期的第1、4、8以及11天给药，而化合物1可以在该28天周期的第1、 8以及15天给药。在另一个实施方案中，该硼替佐米可以在21天周期 的第1、4、8以及11天给药，而化合物1可以在该21天周期的第1 以及15天给药。在另一个实施方案中，该硼替佐米可以在28天周期 的第1、4、8以及11天给药，而化合物1可以在该28天周期的第1 以及15天给药。在另一个实施方案中，该化合物1可以在21天周期 或28天周期的第1、4、8以及11天给予并且硼替佐米可以在21天周 期或28天周期的第2、5、9以及12天给予。在另一个实施方案中， 该硼替佐米可以在21天周期或28天周期的第1、4、8以及11天给予 并且化合物1可以在21天周期或28天周期的第2、5、9以及12天给 予。在另一个实施方案中，该化合物1可以在21天周期或28天周期 的第1以及8天给予并且硼替佐米可以在21天周期或28天周期的第2、 5、9以及12天给予。在另一个实施方案中，该化合物1可以在28天 周期的第1、8以及15天给予并且硼替佐米可以在28天周期的第2、5、 9以及12天给予。在另一个实施方案中，该硼替佐米可以在21天周期 或28天周期的第1、4、8以及11天给予并且化合物1可以在21天周 期或28天周期的第2以及9天给予。在另一个实施方案中，该化合物 1可以在21天周期或28天周期的第1以及15天给予并且硼替佐米可 以在21天周期或28天周期的第2、5、9以及12天给予。在另一个实 施方案中，该硼替佐米可以在21天周期或28天周期的第1、4、8以 及11天给予并且化合物1可以在21天周期或28天周期的第2以及16 天给予。在另一个实施方案中，该化合物1可以在21天周期或28天 周期的第1以及8天给予并且硼替佐米可以在21天周期或28天周期 的第4以及11天给予。在另一个实施方案中，该化合物1可以在28 天周期的第1、8以及15天给予并且硼替佐米可以在28天周期的第4 以及11天给予。在另一个实施方案中，该硼替佐米可以在21天周期 或28天周期的第1以及8天给予并且化合物1可以在21天周期或28 天周期的第4以及11天给予。在另一个实施方案中，该硼替佐米可以 在21天周期或28天周期的第1以及8天给予并且化合物1可以在21 天周期或28天周期的第1以及8天给予。在另一个实施方案中，该化 合物1可以在21天周期或28天周期的第1、5以及9天给予并且硼替 佐米可以在21天周期或28天周期的第3、8以及12天给予。在另一 个实施方案中，该化合物1可以在28天周期的第1、8以及15天给予 并且硼替佐米可以在28天周期的第3、8以及12天给予。在另一个实 施方案中，该硼替佐米可以在21天周期或28天周期的第1、5以及9 天给予并且化合物1可以在21天周期或28天周期的第3、8以及12 天给予。在另一个实施方案中，该化合物1可以在21天周期或28天 周期的第1以及15天给予并且硼替佐米可以在21天周期或28天周期 的第1、6以及11天给予。在另一个实施方案中，该化合物1可以在 28天周期的第1、8以及15天给予并且硼替佐米可以在28天周期的第 1、6以及11天给予。在另一个实施方案中，该硼替佐米可以在21天 周期或28天周期的第1以及11天给予并且化合物1可以在21天周期 或28天周期的第5以及15天给予。在另一个实施方案中，该硼替佐 米可以在28天周期的第1以及11天给药，而化合物1可以在该28天 周期的第1、8以及15天给药。这种计划的给药周期可以重复一次或 多次。例如，该计划的周期可以重复至观察到最大的响应，再加一个 或两个额外的周期。作为另一个实例，该计划的周期可以重复6至12 个周期。任选地，完成该初始周期之后，可以使用一个“维持方案”， 其中该硼替佐米以及化合物1以比在该初始方案中更不频繁地进行给 药，例如每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次。该维持 方案可以继续持续一个固定的时期，总体上是1-2年亦或不确定地只要 患者继续表现出没有疾病进展的迹象并且容忍这种治疗而没有显著的 毒性。

如以上提及的，根据本发明对于化合物1、以及美法仑的给药方案 存在很大的灵活性。在某些实施方案中，该给药方案可以从已知的对 于这些药物适当的给药方案进行适配。例如，口服美法仑(9mg/m²) 已经被核准用于通过与硼替佐米(1.3mg/m²)以及口服泼尼松(60 mg/m²)联合持续九个如表1中示出的6周治疗周期而治疗以前未能治 疗的多发性骨髓瘤。美法仑在每个6-周周期的第1、2、3以及4天给 药(42)。

口服美法仑经常作为单试剂以每天6mg的剂量给药。如所要求的 对该剂量基于大约每周间隔所进行的血球计数进行调整。2-3周治疗之 后，中断用药4周，在这个时间过程中，应该小心地进行血球计数。 当白细胞以及血小板计数升高时，可以开始一个每天2mg的维持剂量 (43)。

对于在本发明的联合中的应用，该美法仑方案可以是与经核准的 多发性骨髓瘤方案类似的或不同的，包括以上提出的那些。例如，该 美法仑可以比经核准的方案多少更频繁地进行给药，并且可以任选地 以更高或更低的剂量给药。

该美法仑能以任何合适的剂量与化合物1结合而给药。适当的美 法仑的剂量可以在约0.025mg/kg至约0.5mg/kg的范围内，例如约0.05 mg/kg至约0.3mg/kg。适当的美法仑剂量典型地是范围从约0.025 mg/kg至约0.3mg/kg。优选地，该美法仑的剂量是在约0.05mg/kg至 约0.25mg/kg的范围内。更优选地，该美法仑的剂量是在约0.1mg/kg 至约0.2mg/kg的范围内。优选的美法仑剂量包括但不限于0.1mg/kg、 0.15mg/kg、0.2mg/kg、或0.25mg/kg。以上的剂量适合于任何美法仑 给药的方法，并且尤其是适合于皮下、静脉内或口服给药，其中口服 给药是优选的。

该美法仑可以根据任何合适的方案与化合物1以上述的剂量而给 药。该美法仑剂量的量值在该给药方案内可以是恒定的或变化的。优 选地，该美法仑剂量在该方案过程中保持在一个恒定的水平，除非观 察到显著的药物相关的毒性，在这种情况下，随后的剂量可以减少例 如约20％-30％。该美法仑可以在与化合物1相同的或不同的天给药。 适当的美法仑方案典型地以连贯的天数进行持续一段日子，接着是休 止期。优选地，该美法仑的给药是每天一次持续约3至约7天，接着 是约1-6周的休止期。优选地，该美法仑的给药是每天一次持续约4 至约7天，接着是约4-6周的休止期。优选地，该美法仑的给药是每天 一次持续约4至约5天，接着是约4-6周的休止期。这种方案可以重复 一次或多次。

该化合物1能以任何合适的剂量与美法仑结合而给药。适当的化 合物1的剂量可以是在约0.5mg/m²至约10mg/m²的范围内，如约0.5 mg/m²至约5mg/m²，或约0.5mg/m²至约3mg/m²。适当的化合物1剂 量典型地是范围从约0.5mg/m²至约3mg/m²。优选地，该化合物1的 剂量是在约1mg/m²至约3mg/m²的范围内。更优选地，该化合物1的 剂量是在约1.5mg/m²至约2.5mg/m²的范围内。优选的化合物1的剂 量包括但不限于1.1mg/m²、1.5mg/m²、1.8mg/m²、2.1mg/m²、或2.4 mg/m²。以上的剂量适合于任何化合物1给药的方法，并且尤其是适合 于皮下或静脉内给药，其中静脉内给药是优选的。化合物1的口服剂 量典型地是处于以上范围的最高端处，例如约1mg/m²至约7mg/m²。 在一个实施方案中，该化合物1的口服剂量可以是约2mg/m²至约6 mg/m²，如约3mg/m²至约5mg/m²。示例性的化合物1的口服剂量包 括但不限于2mg/m²、3mg/m²、4mg/m²、5mg/m²、或6mg/m²。

该化合物1可以根据任何合适的方案与美法仑以上述的剂量而给 药。该化合物1剂量的量值在该给药方案内可以是恒定的或变化的。 优选地，该化合物1剂量在该方案过程中保持在一个恒定的水平，除 非观察到显著的药物相关的毒性，在这种情况下，随后的剂量可以减 少例如约20％-30％。该化合物1可以与美法仑在相同的或不同的天给 药。适当的化合物1方案典型地范围是从一天一次的剂量至一周一次 的剂量或甚至一个月一次的剂量。优选地，该化合物1以比每天一次 更不频繁地给药，例如每2-14天一次的剂量。优选地，该化合物1以 每3至28天，例如每7至21天一次给药。例如，该化合物1可以每 周两次进行给药。在另一个实例中，该化合物1可以每周一次进行给 药。在另一个实例中，该化合物1可以每两周一次进行给药。优选地， 该方案包括至少5天(例如约7至21天的一个时期)的一个时期，在 该过程中不给予化合物1。优选地，该休止期是约10至17天，例如约 10天或约17天。例如，该化合物1可以在21天周期的第1、4、8以 及11天给药，其中第12-21天是休止期。在另一个实施方案中，该化 合物1可以在28天周期的第1、4、8以及11天给药，其中第12-28 天是休止期。在另一个实施方案中，该化合物1可以在28天周期的第 1、8以及15天给药，其中第16-28天是休止期。在另一个实施方案中， 该化合物1可以在21天周期的第1以及8天给药，其中第12-21天是 休止期。在另一个实施方案中，该化合物1可以在28天周期的第1以 及8天给药，其中第12-28天是休止期。在另一个实施方案中，该化合 物1可以在21天周期的第1以及15天给药。在另一个实施方案中， 该化合物1可以在28天周期的第1以及15天给药。在一个实施方案 中，该化合物1可以在一个42天周期的第1、4、8、11、22、25、29 以及32天给予并且美法仑可以在一个42天周期的第1、2、3以及4 天给予。在一个实施方案中，该化合物1可以在一个42天周期的第15、 22以及29天给予并且美法仑可以在一个42天周期的第1、2、3以及 4天给予。在另一个实施方案中，该化合物1可以在一个84天周期的 第1、4、8、11、22、25、29、32、43、50、64以及71天给予并且美 法仑可以在一个84天周期的第1、2、3、4、43、44、45以及46天给 予。在另一个实施方案中，该化合物1可以在一个84天周期的第15、 22、29、57、66以及71天给予并且美法仑可以在一个84天周期的第 1、2、3、4、43、44、45以及46天给予。在另一个实施方案中，该美 法仑可以在28天周期的第1、2、3以及4天给药，而化合物1可以在 该28天周期的第1以及15天给药。在另一个实施方案中，该美法仑 可以在28天周期的第1、2、3以及4天给药，而化合物1可以在该28 天周期的第8以及15天给药。在另一个实施方案中，该美法仑可以在 28天周期的第1、2、3以及4天给药，而化合物1可以在该28天周期 的第1、8以及15天给药。在另一个实施方案中，该美法仑可以在一 个42天周期的第1、2、3、4以及5天给药，而化合物1可以在该42 天周期的第1、8、22以及29天给药。这种方案可以重复一次或多次。

一个或多个另外的癌症治疗可以与化合物1以及硼替佐米或化合 物1以及美法仑的给药联合而使用。此种治疗包括癌症试剂，包括但 不限于硼替佐米、美法仑、地塞米松以及其他类固醇类、阿霉素、环 磷酰胺、沙利度胺、来那度胺、三氧化二砷、以及组蛋白脱乙酰基酶 抑制剂。这些试剂的适当剂量在本领域中是已知的。在本发明的另一 方面，添加剂可以是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)例如非格司亭。在 一个优选实施方案中，非格司亭给药的剂量是从第6天开始约5μg/kg/ 天SC至嗜中性细胞恢复到ANC＞1000。ANC是“嗜中性细胞绝对计 数”的缩写。

本发明的联合治疗可以用作治疗过程的一部分，该过程进一步涉 及尝试手术去除癌性生长的部分或全部。例如，这种联合治疗可以在 对于患者的手术治疗之后给予以治疗任何剩余的肿瘤的或转移的细 胞。该治疗还可以在手术之前，以努力收缩肿瘤的尺寸从而减小有待 切除的组织细胞的量值，由此使该手术的侵害和创伤更小。

使用本披露主题的联合治疗来治疗多发性骨髓瘤可以进一步包括 一个或多个使用诱导DNA损害的放射治疗试剂的治疗过程。放射治疗 试剂包括例如γ辐射、X射线、UV辐射、微波、电子发射、放射性同 位素、等等。治疗可以通过使用上述类型的辐射来辐射局部的肿瘤位 点而实现。

本发明的另一个方面涉及用于通过将这些骨髓细胞暴露于本发明 的联合治疗中来净化骨髓(即从骨髓中移出癌细胞)的方法。净化的 骨髓然后可以放回到骨髓从其中移出的受试者内或者置于一个不同的 受试者中。

材料和方法

试剂

将化合物1(4mg；Cephalon，Frazer，PA)溶解在丙二醇(800μL) 中并且加入5％的甘露醇以产生1mg/mL的最终材料浓度；将化合物1 材料溶液在治疗之前立即稀释到所指出的浓度。硼替佐米(Millennium  Pharmaceuticals，Cambridge，MA)以1mg/mL获得并且如所指出的使用 0.9％的氯化钠稀释。将美法仑(Sigma，St.Louis，MO)溶解在100μL 的酸-EtOH(酸-EtOH：47μL浓HCl+1mL的100％EtOH)中并且用 磷酸盐缓冲盐水稀释到1mL。每周制备多个配制品。

细胞系以及原代细胞

人骨髓瘤细胞系RPMI8226从美国种质保存中心(Rockville，MD) 获得。MM1S骨髓瘤细胞系由Dr.Steven Rosen(Northwestern University， Chicago，IL)提供。根据生产厂家的实验报告(Sigma-Aldrich，St.Louis， MO)，通过Histopaque密度梯度离心法分离出正常的外周血单核细胞 (PBMC)。将骨髓瘤细胞系以及PBMC在37℃下在5％二氧化碳(CO₂) 的气氛中保持在加有10％胎牛血清、2mM的L-谷氨酰胺、100IU/mL 的青霉素、100μg/mL的链霉素以及必需氨基酸的RPMI 1640(Omega  Scientific，Tarzana，CA)中。

细胞生存力测定(MTS测定)

将细胞在一个96孔板内以10⁵个细胞/100μL/孔进行接种并且孵 育24小时。将RPMI8226以及MM1S细胞在载体、化合物1、硼替佐 米、美法仑、化合物1+硼替佐米、或化合物1+美法仑的存在下培 养48小时。该孵育时期之后，使用CellTiter 96AQueous的非放射性 细胞增殖测定(Promega，Madison，WI)对细胞生存力进行定量化。每 个孔使用MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-磺苯 基)-2H-四唑鎓，内盐)处理1至4小时，这之后在490nm处记录吸光 度。如通过在490nm的吸光度测量的甲臜(formazan)产品的量与培 养液内活细胞的数目成正比。

使用Chou和Talalay的中效法(30)测定化合物1与硼替佐米或 美法仑之间的体内协同作用。对每种联合分开地评估联合指数(CI)。 对于药物相互作用，如果CI小于0.9则是协同作用或者如果CI大于 1.1则是拮抗作用。在0.9与1.1之间的CI被认为是表明了相加的药物 作用(31)。

通过膜联蛋白V以及碘化丙锭染色的凋亡测定

为了对响应药物治疗的凋亡进行定量，将RPMI8226细胞(5x10⁵细胞/孔)用载体或PI在37℃以及5％的CO₂孵育30小时。作为阳性 对照，将细胞用250ng/mL的放线菌素D孵育24或48小时。然后将 细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，再悬浮到结合缓冲剂(100mM HEPES/NaOH，pH 7.5，包含1.4M NaCl以及25mM CaCl₂)中，并且 用异硫氰酸荧光素(FITC)-结合的膜联蛋白V并且用荧光染料碘化丙 锭(PrI)根据生产厂家的实验报告(BioVision，Mountain View，CA) 进行染色。对于每种药物治疗，记录1x10⁵的门内事件(gated event)。 对于PI以及膜联蛋白V染色两者均是阴性的细胞被认为是活的；膜联 蛋白V阳性、Pr-阴性的细胞被认为是早凋亡的；膜联蛋白阳性、PrI 阳性的被认为是晚凋亡的。流式细胞术分析使用带有Cytomics CXP软 件的Beckman Coulter FC500(Beckman Coulter，Fullerton，CA)血细胞 计数器进行。

SCID小鼠

从Jackson实验室(Bar Harbor，ME)获得6至8周大的雄性重度 联合免疫缺陷症(SCID)小鼠并且保持在我们的动物资源设施内的荧 光特定的无病原体的区域中。所有的动物研究均根据动物保护和利用 委员会批准的科学试验计划进行。将动物使用开他敏、赛拉嗪以及异 氟烷在手术之前麻醉并且当肿瘤达到2cm的直径时使其安乐死。

肌内肿瘤异种移植模型

为了建立LAGκ-1A肿瘤(对硼替佐米和美法仑敏感的)，从已经 发展了同时进行来那度胺治疗的女性MM患者获得骨髓活组织检查。 这种活组织检查之后立即地，对患者使用美法仑以及硼替佐米的组合 进行治疗并且显示了响应。将活组织检查组织手术植入到已麻醉的 SCID小鼠的后肢中并且通过成功的产生多个世代而进行传代。 LAGκ-1B肿瘤(耐硼替佐米以及美法仑)从与LAGκ-1A相同的患者获 得但是从当该患者正在进展同时接受了使用硼替佐米以及美法仑(32) 的治疗时所取的活组织检查中产生。

将骨髓瘤(LAGκ-1A或LAGκ-1B)从已经麻醉的供体小鼠切除、 切片成20至40mm³的片，并且手术植入到已经麻醉的首次接受试验 的SCID小鼠的左侧浅臀部肌肉中。受体小鼠每种接受抗asialo GM1 兔血清(Wako Bioproducts，Richmond，VA)的注射从而抑制免疫活 性。将这些小鼠盲指定到多个实验组之一中，并且在肿瘤植入后7至 21天开始进行治疗。化合物1通过口部管饲法每天(0.5-5.0mg/kg)或 每周两次(5-10mg/kg)进行给药。化合物1也通过每周两次(W，F) 通过口服注射(0.5-3.0mg/kg)或口部管饲法(10mg/kg)如所指出的 进行给药。美法仑(1mg/kg)通过每周腹膜内的(IP)注射(W)而 提供。将硼替佐米(0.5mg/kg)每周两次(T，Th)通过IV注射配药。 对照治疗仅由化合物1稀释剂(3.2mL 5％的甘露醇以及800μL的丙二 醇)组成。

人免疫球蛋白(hIgG)酶联免疫吸附测定

由LAGκ-1A肿瘤(LAGκ-1B肿瘤不分泌副蛋白)分泌的hIgG血 清水平通过ELISA作为肿瘤生长的蛋白标记物进行定量。带有MM肿 瘤的小鼠每周经受眶后采血。产生的样品以13,000rpm旋转30分钟以 分离血清。根据生产厂家说明使用hIgG ELISA试剂盒(Bethyl  Laboratories，Montgomery，TX)。在一个具有KC初级软件的μQuant 微孔板分光光度计(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)上使用550nm 的对比波长确定450nm处的吸光度。图表表示的数据是使用n＝7-8只 小鼠/组的平均±SEM。

肿瘤体积的确定

作为肿瘤生长的一种直接测量，使用卡尺来对肿瘤体积每周进行 评估，并且对于椭圆形的体积应用以下公式(4/3πx[宽度/2]²x[长度 /2])。

肿瘤生长抑制的百分比

肿瘤生长抑制的百分比表示为试验药物组的肿瘤体积比未治疗的 组的肿瘤体积(T/C)。最佳的值是最小的T/C比，该比反映了所实现 的最大的肿瘤生长抑制。根据国家癌症研究所标准指标对于T/C比的 疗效的指标是≤42％(44)。

肿瘤生长延迟

对抗肿瘤的药物治疗的疗效基于在对照与治疗组之间达到一个肿 瘤体积的时间最大差异对于未治疗的肿瘤生长到一个预定尺寸所要求 的时间(t)进行标准化。这个值可以表示为治疗的与对照的生长的延 迟(以天计)(t_t-t_c)(44)。

肿瘤细胞内诱导凋亡因子(AIF)表达的免疫组织化学分析

将LAGκ-1B肿瘤以4％的多聚甲醛进行固定并且切割成5μm的切 片。简言之，将这些切片用具有0.05％的吐温-20(TBST)以及3％的 BSA的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水在室温下封闭1小时并且然后使用 对抗AIF的兔抗体(Sigma，St.Louis，MO)孵育过夜。将这些切片用 TBST洗涤三次并且使用在TBST中1∶500稀释的辣根过氧化物酶 (ARH)-结合的抗兔抗体(KPL，Gaithersburg，MD)在室温下治疗2 小时。将这些载玻片在TBST中洗涤三次并且置于3-氨基-9-乙基咔唑 (AEC)缓冲剂中5分钟，并且使用AEC试剂盒检测颜色(Dako， Glostrup，Denmark)。染色使用Olympus BX51显微镜(Olympus Imaging  America Inc.，Center Valley，PA)证明并且通过Microsuite Biological  Suite程序(Olympus BX51)进行分析。

统计分析

按照治疗组的平均值以及标准偏差进行肿瘤生长以及hIgG水平 的分析。使用学生的t试验来确定治疗组之间的统计的差异显著性。最 小的显著性水平是P＜0.05。

实例

以下实例中提供的数据表明了当化合物1与硼替佐米或化合物1 与美法仑以低剂量联合时与使用标准剂量的单试剂治疗相比本发明的 联合治疗在MM中提供了类似的或更大的疗效。以此方式，药物相关 的毒性，例如对于硼替佐米的周围神经病变以及对于美法仑的骨髓抑 制可以减小或避免(40，41)。在此处所提供的实验中，使用联合治 疗进行治疗的小鼠很好地耐受这种治疗并且经历了极小或没有肿瘤进 展。

实例1.化合物1当与抗MM试剂在体外联合时化合物1对于MM 细胞是细胞毒性的并且是协同作用

将RPMI8226和MM1S细胞在渐增浓度的化合物1(0.1-10nM) 的存在下进行培养。48小时之后，使用MTS测定对细胞生存力进行评 估。化合物1在两种细胞系中均诱导了依赖于浓度的生存力抑制作用 (图1A)。当细胞用化合物1治疗24小时或72小时时，结果是类似 的(数据未示出)。

我们在化合物1加PI硼替佐米或化学治疗剂美法仑的存在下检验 了细胞生存力。首先，MM1S细胞使用固定浓度的化合物1(1.75nM) 以及渐增浓度的硼替佐米(0.5-2.5nM)孵育48小时。在硼替佐米浓 度≤1.5nM下，化合物1的细胞毒性效应被增强了。例如，作为单试 剂，化合物1(1.75nM)以及硼替佐米在最低浓度(0.5nM)下各自 将细胞生存力抑制了约16％。然而，当化合物1(1.75nM)与硼替佐 米(0.5nM)联合时，细胞生存力降低了约43％(图1B)。使用 Chou-Talalay方程来确认这种联合的协同作用(CIs，0.74-0.85)(30， 31)。当使用RPMI8226细胞重复该实验时得到了类似的结果(数据未 示出)。

当RPMI8226细胞使用美法仑(40μM)以及≥6.0nM的化合物 1浓度(IC₅₀＝8.5nM)进行孵育时，观察到了协同的生存力抑制作用 (CIs，0.78-0.87)。例如，在单试剂美法仑(40μM)的存在下细胞生 存力降低了约30％并且在单试剂化合物1(9.0nM)的存在下细胞生存 力降低了64％。当两种药物同时应用时，细胞生存力降低了90％(图 1C)。这些结果一起证明了化合物1联合硼替佐米或美法仑可以协同 地抑制MM细胞生存力。

实例2.化合物1以及硼替佐米是对于赘生性细胞选择性地细胞毒 性的

为了使用两种或更多PI的疗法是在体内可行的，这种联合必须节 省非赘生性细胞。因此，我们测试了化合物1加硼替佐米对正常的 PBMC生存力的作用。将健康的供体PBMC在单独的化合物1、单独 的硼替佐米或两种试剂一起的存在下孵育48小时并且对细胞生存力通 过MTS测定进行定量。在MM细胞中使用接近其IC₅₀的PI的单一疗 法仅适度地抑制了PBMC的生存力(当PBMC使用9nM的化合物1 以及9nM的硼替佐米进行治疗时，分别为约75％和85％活细胞)(图 2A、B)。与给予任一种单独的药剂相比使用PI两者共同孵育并没有 进一步降低或轻微地增加细胞生存力(当两种PI以所有的测试浓度进 行给药时，3％-23％的细胞生存力降低)(图2A，B)。使用得自第二 个健康的供体的PBMC获得了类似的结果(图2C)。为了确定PBMC 是否易受更高浓度的PI的攻击，将PBMC用高达120nM的化合物1 进行孵育。当与对照相比时，在任何试验浓度下均没有观察到细胞生 存力的显著差异(图2D)。当PBMC使用浓度高达120nM的硼替佐 米进行孵育时，得到了类似的结果(数据未示出)。因此，本发明的 联合治疗提供了增强的对抗MM的疗效而没有增加对于正常细胞的毒 性。

实例3.化合物1与硼替佐米联合诱导MM细胞的凋亡

为了确定在使用化合物1以及硼替佐米治疗MM细胞之后所观察 到的细胞生存力的降低是否是由于凋亡，我们使用两种试剂(对于每 种药物以2.5nM)对RPMI8226孵育30小时并且测量使用生存力染料 PrI以及凋亡标记物膜联蛋白V染色的细胞的分数。使用两种PI治疗 之后(38.9％的细胞)比使用任一单独试剂(使用2.5nM化合物1或 2.5nM硼替佐米的治疗，分别为10.4％和17.5％的细胞)治疗之后早凋 亡的细胞百分比(PrI-/膜联蛋白V+)更大(图3)。晚凋亡(PrI+/膜 联蛋白V+)或坏死(PrI+/膜联蛋白V-)的细胞百分比在这个时间点上 在治疗组中没有变化。

实例4.单试剂化合物1在体内抑制了人类MM肿瘤的生长

因为化合物1在体外作为单试剂以及以联合的形式证明了有效的 抗MM效果，我们接下来进行了一系列体内研究。为了这些实验，我 们利用了带有LAGκ-1A(硼替佐米-以及美法仑-敏感的)以及LAGκ-1B (硼替佐米-以及美法仑-耐受的)肿瘤的小鼠，两者最初均得自一个 MM患者的骨髓活组织检查。这些肿瘤接近人类MM并且已经通过小 鼠的多代的传代，具有一致的生长以及化学抗性模式。在肌内植入肿 瘤组织之后，这些小鼠经受了使用口服从0.1至3mg/kg IV或10mg/kg 的逐渐上升的剂量范围的化合物1每周两次的治疗。对照组的小鼠接 受了化合物1稀释剂。

单试剂化合物1IV给药产生了依赖剂量的来自LAGκ-1A肿瘤分 泌的副蛋白减小。更低剂量的化合物1减少了肿瘤hIgG分泌物，并且 更高剂量导致了实质上不可检测的血清hIgG水平(与使用对照物药物 治疗28天之后相比，对于1mg/kg IV化合物1，P＝0.0001并且对于3 mg/kg，P＝0.0002)(图4A)。

不像硼替佐米，化合物1作为一种口服配制品也表现出了活性(28， 29)。在使用口服化合物1治疗的2周内，血清hIgG水平显著地比对 照治疗的动物内的水平更低(P＝0.0007)。通过使用口服化合物1治 疗28天，血清hIgG水平是可以忽略的(与对照治疗的动物相比，P＝ 0.0001)(图4A)。

除了对于副蛋白水平的影响之外，与载体治疗的小鼠相比，单试 剂化合物1减慢了LAGκ-1A肿瘤体积的增加。药物治疗4周之后，与 在相同的时间点上使用对照治疗的异种移植相比，以1或3mg/kg IV 给予的化合物1导致了约15倍的肿瘤的体积的减小(与对照相比，对 于每个剂量P＝0.0001)(图4B)。口服递送的化合物1也抑制了肿 瘤生长。使用口服化合物1治疗14天之后，与使用对照治疗的肿瘤相 比，观察到了显著的肿瘤体积减小(P＝0.0002)，在整个研究持续时 间持续的一种差异(图4B)。类似地，化合物1单一疗法也导致了Ig 水平以及一种不同的MM肿瘤(LAGλ-1)的肿瘤体积的统计上显著地 减小。

化合物1对于肿瘤体积的影响还在带有耐硼替佐米非分泌型 LAGκ-1B肿瘤的小鼠内进行了测试(图4C)。对于LAGκ-1A肿瘤， 化合物1作为一种IV注射液以及作为口服配制品均抑制了肿瘤的生 长。与对照物治疗的小鼠相比，使用化合物1以3mg/kg IV或10mg/kg 口服化合物1治疗的小鼠在14天治疗之后显示出了小了约8至12倍 的肿瘤(分别为P＝0.0008以及P＝0.0028)(图4C)。因为在这些 实验中所使用的LAGκ-1B肿瘤是非分泌型的，所以对带有这些肿瘤的 小鼠进行了血清hIgG水平测试。

实例5.化合物1与硼替佐米联合抑制了硼替佐米敏感的 LAGκ-1A MM肿瘤的生长

因为化合物1与硼替佐米联合在体外诱导了MM细胞的协同凋亡， 我们测试了这种联合在体内对于人类MM肿瘤的影响。我们选择了具 有次最优的单试剂抗肿瘤活性的药物浓度。作为单一疗法，与载体对 照相比化合物1(1mg/kg IV)以及硼替佐米(0.5mg/kg IV)两者仅部 分地抑制了血清hIgG水平以及LAGκ-1A肿瘤体积(图5A、B)。然 而，尽管使用单试剂化合物1或硼替佐米治疗，如通过副蛋白分泌以 及肿瘤体积测量的，保持了渐增的肿瘤生长发展。相比之下，化合物1 与硼替佐米以相同剂量的共同给药消除了可检测到的副蛋白分泌以及 肿瘤体积的增加。在对照物治疗的以及联合疗法治疗的LAGκ-1A肿瘤 之间的生长差异首先在开始治疗后28天变得显著(分别为对于血清 hIgG水平P＝0.0028以及对于肿瘤体积P＝0.0265)(图5A、B)。 在整个实验持续时间过程中保持了肿瘤进展的完全抑制(110天)。此 外，当使化合物1加硼替佐米治疗的小鼠安乐死时，对所切除的后肢 的检验仅显示了肌肉质量而没有肿瘤组织，因为只有红色的肌肉纤维 是可见的并且检验时没有任何血浆细胞。在研究开始时所植入的肿瘤 完全退化了。使用hIg水平的测定显示了对于这种作用的进一步的支持 (图5A)。值得注意地，毒性特征在使用联合以及单试剂的硼替佐米 或化合物1给药的小鼠之间是类似的。所有使用PI联合治疗的小鼠 (7/7)在整个研究持续时间仍然是活的。

在前面的研究中，分泌hIgG的骨髓肿瘤的体积变化与血清人类副 蛋白水平的变化密切相关(15，32)。然而，在这些实验中，来自使 用单试剂化合物1或硼替佐米治疗的肿瘤的副蛋白分泌达到稳定并且 然后从治疗第63天(研究的第70天)之后开始下降；相比之下，肿 瘤体积在研究持续时间内继续增加(图5A、B)。因此，作为单一疗 法，与肿瘤体积相比，每种试剂更有效地抑制了血清hIgG水平的增加。

为了验证这些结果，对于向前70天的样品通过ELISA进行再测 试，并且验证了hIgG水平的减小。这种hIgG水平与肿瘤体积之间相 反的关系表明了存在非分泌型耐药物的MM细胞群，可能是得自癌干 细胞。因此，单独的硼替佐米亦或化合物1可以主要是对MM的分泌 抗体的成熟血浆细胞组分起作用(22)，而不会影响对延迟肿瘤生长 负责的小干细胞群(24)。

相比之下，接受了化合物1以及硼替佐米的组合的带有LAGκ-1A 的小鼠显示出了显著的并且持续的没有肿瘤生长，如通过110天的研 究中对于hIgG和肿瘤体积两者的测量所测定的。这些数据表明了没有 产生副蛋白而繁殖的MM细胞在单试剂PI的存在下对于化合物1以及 硼替佐米联合是敏感的。

实例6.使用化合物1以及硼替佐米的联合治疗克服了耐硼替佐米 的LAGκ-1B肿瘤的药物耐受性

LAGκ-1B肿瘤是对硼替佐米耐受的；并且的确，单独的PI(0.5 mg/kg IV硼替佐米或1mg/kg IV化合物1)仅适度地抑制了这些肿瘤 的生长(图5C)。相比之下，使用化合物1(1mg/kg)加硼替佐米(0.5 mg/kg)治疗的带LAGκ-1B的小鼠比载体治疗的小鼠在治疗仅21天之 后发展了显著地更小的肿瘤(P＝0.0014)。此外，治疗28天之后，接 受联合治疗的小鼠内的肿瘤与使用单独的PI治疗的那些相比也更小 (对于单独使用化合物1以及单独使用硼替佐米相比，分别为P＝ 0.0039以及P＜0.0001)(图5C)。为了确定到肿瘤进展的时间，对 于联合治疗组内小鼠的给药继续。与使用单试剂PI治疗的肿瘤相比， 在联合治疗组内肿瘤体积的进展被延迟了100％(从对于使用单试剂PI 治疗的小鼠，到肿瘤进展为35天，对比对于使用两种PI治疗的动物， 到肿瘤进展为70天)。最后记录了每个治疗组的总存活率。与载体治 疗的小鼠相比，在接受联合方案的同龄组内接受联合治疗的小鼠存活 了长过150％(70天对比28天)。使用单独的PI治疗的小鼠比载体治 疗的小鼠存活了长20％(数据未示出)。使用联合治疗的小鼠显示了 到70天时仅一只小鼠的死亡有可能与药物相关并且使用任一单试剂治 疗的小鼠也经受了一只死亡(各自均与毒性有关)。这些数据一起证 明了化合物1联合硼替佐米可以在体内克服人MM中硼替佐米的耐受 性。

实例7.化合物1与美法仑联合抑制了LAGκ-1A以及LAGκ-1B肿 瘤的生长

因为化合物1与美法仑协同地降低了所培养的MM细胞内的生存 力，并且硼替佐米在实验室(11)以及临床研究(33)中均增强了美 法仑的抗MM作用，所以我们评估了这种具有化合物1的烷基化试剂 在体内的疗效。以低剂量(1mg/kg IP)每周给予单试剂美法仑的治疗 对于带有LAGκ-1A的小鼠内的血清hIgG水平或肿瘤体积没有影响。 同样，给予单试剂化合物1(1mg/kg IV)导致了副蛋白分泌以及肿瘤 体积两者的不显著的减小。然而，治疗3周之后，与载体治疗的肿瘤 相比，暴露于化合物1与美法仑两者的肿瘤在hIgG分泌(P＝0.0012) 以及肿瘤体积(P＝0.032)两者中显示出显著的减小(图5D和E)。 在带有硼替佐米以及美法仑耐受的LAGκ-1B肿瘤内获得了类似的结 果。以3mg/kg IP(比给予带LAGκ-1A的小鼠的剂量高3倍)的单试 剂美法仑或以1mg/kg IV(与带有LAGκ-1A的小鼠给予的相同剂量) 化合物1部分地抑制了肿瘤体积的增加，但是当化合物1与美法仑联 合时，肿瘤体积在治疗三周之后降低到了实际上不可检测的水平(图 5F)。

与单试剂治疗相比，肿瘤生长被阻止了，只要联合治疗在带有任 一种肿瘤类型的小鼠内继续(在LAGκ-1A小鼠内治疗63天并且在 LAGκ-1B小鼠内治疗49天)。此外，联合治疗的耐受性与每种单独试 剂的耐受性类似(数据未示出)。

实例8.使用化合物1以及硼替佐米治疗的LAGκ-1B小鼠的肿瘤 显示出增加的诱导凋亡因子表达

将来自带LAGκ-1B的小鼠的肿瘤在治疗之后切除并且使用AIF (一种凋亡标记物)进行染色。当与载体治疗的肿瘤相比时，使用单 试剂化合物1或硼替佐米治疗的肿瘤显示出了增加的AIF表达。然而， 在使用两种PI治疗的动物取下的肿瘤内AIF表达进一步增加(图6)。 在这个治疗组内完全肿瘤退化之后，接收化合物1与硼替佐米的带 LAGκ-1A小鼠的肿瘤由于缺乏可用的异种移植样品而对于组织学分析 是不可用的。

实例9.单试剂口服化合物1在体内抑制了人类MM肿瘤的生长

这些实验与实例4内描述的那些是类似的并且使用了带有最初得 自人类骨髓活组织检查的LAGκ-1A或LAGκ-1B肿瘤的小鼠。在肌内 植入肿瘤组织(20-40mm3，手术植入到左侧后肢的浅臀部肌肉内)之 后七天，使这些小鼠经受每天一次或每周两次的以逐步上升的剂量使 用化合物1的治疗，剂量范围是从每天口服0.5至5mg/kg或每周两次 口服5至10mg/kg。对照组的小鼠接受了化合物1稀释剂。

口服给予的单试剂化合物1在带有LAGκ-1A的小鼠内显著地抑制 了肿瘤的生长。经口服并且每天以3mg/kg给予的化合物1对于人IgG 水平以及肿瘤体积具有适度的抗骨髓瘤活性。在开始使用化合物1以 10mg/kg每周两次治疗之后，三周(从植入肿瘤组织第28天)后就观 察到了对于人副蛋白分泌物以及肿瘤体积减小两者的显著抑制作用 (hIgG：P＝0.0011；肿瘤体积：P＝0.001)(图7A和7B)。以5mg/kg 每天一次给药PI在第35天还导致了显著的肿瘤抑制(hIgG：P＜0.0001； 肿瘤体积：P＜0.0001)(图7A和7B)。在整个研究的其余时间保持 了统计的显著性。对于以10mg/kg每周两次用化合物1给药的小鼠， 在第21、28、35、42以及49天分别获得了29.3％、17.3％、6.1％、6.1％、 和10.6％的T/C’百分比。当与没有接受治疗的动物相比时，在接受这种 治疗方案的动物内肿瘤体积生长至700mm³被延迟了93.8％(30.5天， 从对于对照32.5天至以10mg/k化合物1的63天)。类似地，对于以 5mg/kg每天用化合物1给药的小鼠，在第28、35、42以及49天分别 获得了25.3％、5.3％、2.7％、和2.1％的T/C’百分比。当与未治疗的对 照组相比时，在接受这种治疗方案的动物内肿瘤体积生长至87.5mm³被延迟了530％(53天，从对于对照从10天至以5mg/kg化合物1的 63天)。总之，这些结果表明了对于每周两次10mg/kg以及每天5mg/kg 的化合物1的方案，在带LAGκ-1A的小鼠内肿瘤尺寸以及肿瘤生长延 迟的显著减小。此外，以10mg/kg用PI每周两次给药的所有小鼠 (15/15)，随访期内给药的存活了五周并且没有给药的存活了三周。 在每天5mg/kg的组内十五只小鼠中两只死于药物相关的毒性。此外， 在治疗终止时(第42天)测量的体重在治疗前以及治疗后之间对于两 个治疗组在水平上没有显著差异(图7C)。

对带有非分泌型LAGκ-1B肿瘤的SCID小鼠内口服给予单试剂化 合物1的作用也进行了评估。与带LAGκ-1A小鼠内获得的结果类似， 它显著地抑制了肿瘤生长而没有显著地体重损失。以5mg/kg给药或以 10mg/kg每周两次给药在第35天导致了显著的肿瘤体积抑制(分别为 P＝0.0327；P＝0.0018)(图7D)。当与没有接受治疗的动物相比时， 在每天接受5mg/kg的动物内肿瘤体积生长至300mm³被延迟了35.5％ (11天，从对于对照31天至对于化合物1治疗的42天)。对于以10 mg/kg每周两次用化合物1给药的小鼠，在第35、42、49以及56天分 别获得了21.6％、27.5％、26.1％、和30.5％的T/C’百分比。当与未治疗 的对照组相比时，在以10mg/kg每周两次接受这种治疗方案的动物内 220mm³的肿瘤体积被延迟了50％(14天，从对于对照28天至化合物 1治疗的42天)。

结论

当以良好的容忍剂量静脉内以及口服给予时，化合物1在体外细 胞系以及体内人肿瘤模型中均显示了显著的单试剂抗MM活性。化合 物1对于体外正常的外周血单核细胞具有可以忽略的细胞毒性效应， 甚至在比MM细胞内产生细胞毒性效应的高十倍的浓度下(数据未示 出)。化合物1增强了一种第二PI、硼替佐米的抗MM活性。这两种 PI一起给药在体外示出了协同的抗MM作用并且阻止了硼替佐米敏感 的LAGκ-1A肿瘤的生长并且当与使用任一PI的单一疗法相比时将硼 替佐米耐受的LAGκ-1B肿瘤的进展显著地延迟了超过100％。值得注 意地，为了在体内克服硼替佐米药物耐受性更高剂量的化合物1不是 必须的。对于带有非分泌型以及耐硼替佐米的肿瘤LAGκ-1B的动物， 一起给予化合物1以及硼替佐米的次佳的剂量对于产生显著的并且持 续的疗效是足够的。以允许继续的肿瘤生长的化合物1的剂量来消除 产生副蛋白的LAGκ-1A细胞支持了最近的报道，表明了PI优选地杀 死具有高Ig分泌的细胞(22，27)。在这些实例中，我们已经表明了 两种PI的联合能够消除这种产生MM细胞群的非副蛋白。

一起给予化合物1以及硼替佐米显著地抑制了副蛋白分泌以及肿 瘤体积的增加这两者。然而，作为单一疗法，与它们的对于肿瘤体积 的抗MM作用相比，每种试剂更有效地抑制了血清hIgG水平的增加。 确切地说，在使用单独的化合物1或硼替佐米治疗的带LAGκ-1A的动 物内，血清hIgG浓度到治疗第63天时稳定，然后降低而肿瘤体积在 该整个实验的持续时间过程中继续增加(82天的治疗)(图5A、B)。 因此，如之前在其他研究中所观察到的，单独的PI可以主要是对MM 的分泌抗体的成熟血浆细胞组分起作用(22)，而不会影响对维持肿 瘤负责的小的非分泌型干细胞群(24)。我们的结果表明了这两种PI 的联合靶向了高分泌型的赘生性血浆细胞连同对使用单试剂PI耐受的 非分泌型肿瘤细胞群这两者。

与使用硼替佐米一样，化合物1与美法仑联合在体外产生了的对 MM细胞生存力的协同的减小(11、12、13)。当加入适度剂量的化 合物1时，作为一种单试剂允许LAGκ-1A不断生长的美法仑的剂量阻 止了肿瘤的进展。此外，化合物1能够使这种耐美法仑的LAGκ-1B肿 瘤化学敏感。这些数据与在化学抗性的MM细胞内显著地降低诱导死 亡所要求的美法仑的浓度的硼替佐米能力一致(11)。在此呈现的数 据表明了对于具有MM患者最佳的联合方案可以涉及与化疗一起的多 种PI。在这些试剂之间在体外观察到的协同作用进一步表明了与标准 剂量的单试剂疗法相比当这两种药物以低剂量联合时可以实现类似的 或更大的疗效。以此方式，药物相关的毒性，例如对于硼替佐米的周 围神经病变以及对于美法仑的骨髓抑制可以减小或避免(40，41)。 在此处所提供的实验中，使用联合治疗而治疗的小鼠与使用单试剂治 疗的动物类似地存活；重要的是，它们经历了极小或没有肿瘤进展而 单一疗法的组由于高的肿瘤负荷必须进行安乐死。

化合物1具有有利的治疗指数，从而节省了正常的人类上皮细胞、 BM原始粒子、BM衍生的基质细胞(29)、以及PBMC，其水平为比对 于显著地降低MM细胞生存力所需要的高10倍；化合物1作为一种单 试剂在人MM肿瘤中是有效的并且是良好地耐受的；化合物1与硼替 佐米以及美法仑联合而协同作用并且使得耐受联合疗法的肿瘤细胞敏 感；化合物1联合硼替佐米阻止了非分泌型以及耐药物的MM细胞的 增殖，这些细胞可以包括癌干细胞群；并且最后化合物1是口服可用 的。在这些研究中，口服给予化合物1在所有的三个测试的MM模型 中显示出了抗MM作用。与对照动物相比，使用口服化合物1的治疗 实现了显著的LAGκ-1A生长的减小以及类似的LAGκ-1B肿瘤生长的 减小。一种口服PI的潜在的可用性将大大地增强给予这一类药物的方 便性因为硼替佐米仅示出了每周两次静脉内给予时的疗效。

参考文献

1.Jemal A，Siegel R，Ward E等人.Cancer statistics，2008.CA  Cancer J Clin 2008；58：71-96。

2.Richardson PG，Sonneveld P，Schuster A等人.Bortezomib  demonstrates superior survival compared with high-dose dexamethasone  and higher response rates after extended follow-up in the APEX trial in  relapsed multiple myeloma.Presented at：11th Congress of the European  Hematology Association；June 15-18，2006；Amsterdam，the Netherlands. Abstract 224。

3.Chauhan D，Hideshima T，Anderson KC.Targeting proteasomes as  therapy in multiple myeloma.Adv Exp Med Biol 2008；615：251-60。

4.McConkey DJ，Zhu K.Mechanisms of proteasome inhibitor action  and resistance in cancer.Drug Resist Updat 2008；11：164-79。

5.Hideshima T，Richardson P，Chauhan D等人.The proteasome  inhibitor PS-341 inhibits growth，induces apoptosis，and overcomes drug  resistance in human multiple myeloma cells.Cancer Res 2001；61：3071-6。

6.Obeng EA，Carlson LM，Gutman DM，Harrington Jr WJ，Lee KP， Boise  LH.Proteasome inhibitors induce a terminal unfolded protein  response in multiple myeloma cells.Blood 2006；107：4907-16。

7.Chauhan D，Anderson KC.Mechanisms of cell death and survival  in multiple myeloma(MM)：Therapeutic implications.Apoptosis 2003；8：337-43。

8.Roccaro AM，Hideshima T，Raje N等人.Bortezomib mediates  antiangiogenesis in multiple myeloma via direct and indirect effects on  endothelial cells.Cancer Res 2006；66：184-91。

9.Richardson PG，Barlogie B，Berenson J等人.A phase 2 study of  bortezomib in relapsed，refractory myeloma.N Engl J Med 2003；348：2609-17。

10.Jagannath S，Barlogie B，Berenson J等人.A phase 2 study of two  doses of bortezomib in relapsed or refractory myeloma.Br J Haematol 2004；127：165-72。11.Ma MH，Yang HH，Parker K等人.The proteasome  inhibitor PS-341 markedly enhances sensitivity of multiple myeloma  tumor cells to chemotherapeutic agents.Clin Cancer Res 2003；9：1136-44。

12.Mitsiades N，Mitsiades CS，Richardson PG等人.The proteasome  inhibitor PS-341 potentiates sensitivity of multiple myeloma cells to  conventional chemotherapeutic agents：therapeutic applications.Blood 2003；101：2377-80。

13.Baumann P，Mandl-Weber S，Oduncu F，Schmidmaier R. Alkylating agents induce activation of NFkappaB in multiple myeloma  cells.Leuk Res 2008；32：1144-7。

14.Mitsiades N，Mitsiades CS，Poulaki V等人.Apoptotic signaling  induced by immunomodulatory thalidomide analogs in human multiple  myeloma cells：therapeutic implications.Blood 2002；99：4525-30。

15.Campbell RA，Sanchez E，Steinberg JA等人.Antimyeloma  effects of arsenic trioxide are enhanced by melphalan，bortezomib and  ascorbic acid.Br J Haematol 2007；138：467-78。

16.Podar K，Raab MS，Zhang J等人.Targeting PKC in multiple  myeloma：in vitro and in vivo effects of the novel，orally available  small-molecule inhibitor enzastaurin(LY317615.HCl).Blood 2007；109：1669-77。

17.Chauhan D，Singh A，Brahmandam M等人.Combination of  proteasome inhibitors bortezomib and NPI-0052 trigger in vivo synergistic  cytotoxicity in multiple myeloma.Blood 2008；111：1654-64。

18.Pei XY，Dai Y，Grant S.Synergistic induction of oxidative injury  and apoptosis in human multiple myeloma cells by the proteasome  inhibitor bortezomib and histone deacetylase inhibitors.Clin Cancer Res 2004；10：3839-52。

19.San Miguel JF，Schlag R，Khuageva NK等人.Updated follow-up  and results of subsequent therapy in the phase III VIS TA trial：bortezomib  plus melphalan-prednisone versus melphalan-prednisone in newly  diagnosed multiple myeloma.Blood(ASH Annual Meeting Abstracts) 2008；112：650。

20.Berenson JR，Yang HH，Vescio RA等人.Safety and efficacy of  bortezomib and melphalan combination in patients with relapsed or  refractory multiple myeloma：updated results of a phase 1/2 study after  longer follow-up.Ann Hematol 2008；87：623-31。

21.Pineda-Roman M，Zangari M，van Rhee F等人.VTD  combination therapy with bortezomib-thalidomide-dexamethasone is  highly effective in advanced and refractory multiple myeloma.Leukemia 2008；22：1419-27。

22.Bianchi G，Oliva L，Cascio P等人.The proteasome load versus  capacity balance determines apoptotic sensitivity of multiple myeloma  cells to proteasome inhibition.Blood 2009；113：3040-9。

23.Matsui W，Huff CA，Wang Q等人.Characterization of  clonogenic multiple myeloma cells.Blood 2004；103：2332-6。

24.Matsui W，Wang Q，Barber JP等人.Clonogenic multiple  myeloma progenitors，stem cell properties，and drug resistance.Cancer  Res 2008；68：190-7。25.Hamburger A，Salmon SE.Primary bioassay of  human myeloma stem cells.J Clin Invest 1977；60：846-54。

26.Pilarski LM，Seeberger K，Coupland RW等人.Leukemic B cells  clonally identical to myeloma plasma cells are myelomagenic in  NOD/SCID mice.Exp Hematol 2002；30：221-8。

27.Meister S，Schubert U，Neubert K等人.Extensive  immunoglobulin production sensitizes myeloma cells for proteasome  inhibition.Cancer Res 2007；67：1783-92。

28.Dorsey BD，Iqbal M，Chatterjee S等人.Discovery of a potent， selective，and orally active proteasome inhibitor for the treatment of cancer. J Med Chem 2008；51：1068-72。

29.Piva R，Ruggeri B，Williams M等人.CEP-18770：a novel  orally-active proteasome inhibitor with a tumor-selective pharmacological  profile competitive with bortezomib.Blood 2008；111：2765-75。

30.Chou TC，Talalay P.Quantitative analysis of dose-effect  relationships：the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 1984；22：27-55。

31.Chou TC.Theoretical basis，experimental design，and  computerized simulation of synergism and antagonism in drug  combination studies.Pharmacol Rev 2006；58：621-81。

32.Campbell RA，Berenson JR.Animal models of multiple myeloma  and their utility in drug discovery.In：Current Protocols in Pharmacology， vol.40，unit 49.Hoboken，NJ：John Wiley&Sons，Inc.；2008：14.9.1-22。

33.Berenson JR，Yang HH，Sadler K等人.Phase I/II trial assessing  bortezomib and melphalan combination therapy for the treatment of  patients with relapsed or refractory multiple myeloma.J Clin Oncol 2006；24：937-44。

34.Demo SD，Kirk CJ，Aujay MA等人.Antitumor activity of PR-171，a novel irreversible inhibitor of the proteasome.Cancer Res 2007；67：6383-91。

35.Crawford LJ，Walker B，Ovaa H等人.Comparative selectivity  and specificity of the proteasome inhibitors BzLLLCOCHO，PS-341，and MG-132.Cancer Res 2006；66：6379-86。

36.Sunters A，Springer CJ，Bagshawe KD，Souhami RL，Hartley JA. The cytotoxicity，DNA crosslinking ability and DNA sequence selectivity  of the aniline mustards melphalan，chlorambucil and  4-[bis(2-chloroethyl)amino]benzoic acid Biochem Pharmacol 1992；44：59-64。

37.Ahn KS，Sethi G，Chao TH等人.Salinosporamide A(NPI-0052) potentiates apoptosis，suppresses osteoclastogenesis，and inhibits invasion  through down-modulation of NF-kappaB regulated gene products.Blood 2007；110：2286-95。

38.Chen Q，Van der Sluis PC，Boulware D，Hazlehurst LA，Dalton  WS.The FA/BRCA pathway is involved in melphalan-induced DNA  interstrand cross-link repair and accounts for melphalan resistance in  multiple myeloma cells.Blood 2005；106：698-705。

39.Jacquemont C，Taniguchi T.Proteasome function is required for  DNA damage response and fanconi anemia pathway activation.Cancer  Res 2007；67：7395-405。

40.Zweegman S，Huijgens PC.Treatment of myeloma：recent  developments.Anticancer Drugs 2002；13：339-51。

41.Argyriou AA，Iconomou G，Kalofonos HP.Bortezomib-induced  peripheral neuropathy in multiple myeloma：a comprehensive review of the  literature.Blood 2008；112：1593-9。

42.VELCADEFull Prescribing Information

43.ALKERANTablets Prescribing Information；ALKERANfor  Injection Prescribing Information

44.Bissery M-C，Guenard D，Gueritte-Voegelein F，Lavelle F.(1991) Experimental antitumor activity of Taxotere(RP 56976，NSC 628503)，a  taxol Analogue.Cancer Research，51，4845-4852。

本发明的优选实施方案：

实施方案1：一种治疗受试者的多发性骨髓瘤的方法，包括对该受 试者给予化合物1与硼替佐米的组合的步骤。

实施方案2：如实施方案1所述的方法，其中该硼替佐米作为药物 前体来进行给药。

实施方案3：如实施方案1或2所述的方法，其中该硼替佐米是静 脉内给药的。

实施方案4：如实施方案1或2所述的方法，其中该硼替佐米是口 服给药的。

实施方案5：如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中该硼替 佐米给药的剂量是在约0.5mg/m²至约2mg/m²的范围内。

实施方案6：如实施方案5所述的方法，其中该硼替佐米给药的剂 量是在约0.7mg/m²至约1.3mg/m²的范围内。

实施方案7：如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中该硼替 佐米按照给药方案周期进行给药，其中该硼替佐米的给药是每3至7 天持续2至4周，接着是约7至21天的休止期，在这个休止期过程中 不给予硼替佐米。

实施方案8：如实施方案7所述的方法，其中该硼替佐米按照给药 方案周期进行给药，其中硼替佐米是在21天周期的第1、4、8以及11 天给予的。

实施方案9：如实施方案7所述的方法，其中该硼替佐米按照给药 方案周期进行给药，其中硼替佐米是在28天周期的第1、4、8以及11 天给予的。

实施方案10：如实施方案7至9中任一项所述的方法，其中使该 计划的周期重复至少一次。

实施方案11：一种治疗受试者的多发性骨髓瘤的方法，包括对该 受试者给予化合物1与美法仑的组合的步骤。

实施方案12：如实施方案11所述的方法，其中该美法仑作为药物 前体来进行给药。

实施方案13：如实施方案11或12所述的方法，其中该美法仑是 口服给药的。

实施方案14：如实施方案11或12所述的方法，其中该美法仑是 静脉内给药的。

实施方案15：如实施方案11至14中任一项所述的方法，其中该 美法仑给药的剂量是在约0.025mg/kg至约0.5mg/kg的范围内。

实施方案16：如实施方案15所述的方法，其中该美法仑给药的剂 量是在约0.025mg/kg至约0.3mg/kg的范围内。

实施方案17：如实施方案11至16中任一项所述的方法，其中该 美法仑按照给药方案周期进行给药，其中该美法仑的给药是每3至7 天持续1至2周，接着是约4-6周的休止期，在这个休止期过程中不给 予美法仑。

实施方案18：如实施方案17所述的方法，其中该美法仑按照给药 方案周期进行给药，其中该美法仑的给药是每天一次持续约4至约7 天，接着是约4-6周的休止期。

实施方案19：如实施方案17所述的方法，其中该美法仑按照给药 方案周期进行给药，其中该美法仑的给药是每天一次持续约4至约5 天，接着是约4-6周的休止期。

实施方案20：如实施方案17至19中任一项所述的方法，其中使 该计划的周期重复至少一次。

实施方案21：如实施方案1至20中任一项所述的方法，其中化合 物1作为药物前体来进行给药。

实施方案22：如实施方案21所述的方法，其中该化合物1药物前 体是化合物1的药学上可接受的酯的形式。

实施方案23：如实施方案1至22中任一项所述的方法，其中该化 合物1是静脉内给药的。

实施方案24：如实施方案1至22中任一项所述的方法，其中该化 合物1是口服给药的。

实施方案25：如实施方案1至24中任一项所述的方法，其中该化 合物1给药的剂量是在约0.5mg/m²至约5mg/m²的范围内。

实施方案26：如实施方案25所述的方法，其中该化合物1给药的 剂量是在约1mg/m²至约3mg/m²的范围内。

实施方案27：如实施方案26所述的方法，其中该化合物1给药的 剂量是约1.1mg/m²。

实施方案28：如实施方案26所述的方法，其中该化合物1给药的 剂量是约1.5mg/m²。

实施方案29：如实施方案26所述的方法，其中该化合物1给药的 剂量是约1.8mg/m²。

实施方案30：如实施方案26所述的方法，其中该化合物1给药的 剂量是约2.1mg/m²。

实施方案31：如实施方案26所述的方法，其中该化合物1给药的 剂量是约2.4mg/m²。

实施方案32：如实施方案1至31中任一项所述的方法，其中该化 合物1按照给药方案周期进行给药，其中该化合物1的给药是每3至 14天持续2至4周，接着是约7至21天的休止期，在这个休止期过程 中不给予化合物1。

实施方案33：如实施方案32所述的方法，其中该化合物1按照给 药方案周期进行给药，其中化合物1是在21天周期的第1、4、8以及 11天给予的。

实施方案34：如实施方案32所述的方法，其中该化合物1按照给 药方案周期进行给药，其中化合物1是在28天周期的第1、4、8以及 11天给予的。

实施方案35：如实施方案32所述的方法，其中该化合物1按照给 药方案周期进行给药，其中化合物1是在21天周期的第1以及15天 给予的。

实施方案36：如实施方案32所述的方法，其中该化合物1按照给 药方案周期进行给药，其中化合物1是在28天周期的第1以及15天 给予的。

实施方案37：如实施方案32所述的方法，其中该化合物1按照给 药方案周期进行给药，其中化合物1是在28天周期的第1、8以及15 天给予的。

实施方案38：如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中该硼 替佐米可以在21天周期的第1、5以及9天给药，而化合物1可以在 该21天周期的第3、8以及12天给药。

实施方案39：如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中该硼 替佐米可以在28天周期的第1、5以及9天给药，而化合物1可以在 该28天周期的第3、8以及12天给药。

实施方案40：如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中该硼 替佐米可以在28天周期的第1、5以及9天给药，而化合物1可以在 该28天周期的第1、8以及15天给药。

实施方案41：如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中该硼 替佐米可以在21天周期的第1、4、8以及11天给药，而化合物1可 以在该21天周期的第1以及8天给药。

实施方案42：如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中该硼 替佐米可以在28天周期的第1、4、8以及11天给药，而化合物1可 以在该28天周期的第1、8以及15天给药。

实施方案43：如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中该硼 替佐米可以在21天周期的第1以及8天给药，而化合物1可以在该21 天周期的第1以及8天给药。

实施方案44：如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中该硼 替佐米可以在28天周期的第1以及8天给药，而化合物1可以在该28 天周期的第1、8以及15天给药。

实施方案45：如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中该硼 替佐米可以在28天周期的第1、8以及15天给药，而化合物1可以在 该28天周期的第1、8以及15天给药。

实施方案46：如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中该化 合物1在21天周期的第1、5以及9天给药，而硼替佐米在该21天周 期的第3、8以及12天给药。

实施方案47：如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中该化 合物1在28天周期的第1、5以及9天给药，而硼替佐米在该28天周 期的第3、8以及12天给药。

实施方案48：如实施方案1至6中任一项所述的方法，其中该化 合物1在28天周期的第1、8以及15天给药，而硼替佐米在该28天 周期的第3、8以及12天给药。

实施方案49：如实施方案38至48中任一项所述的方法，其中该 化合物1作为药物前体来进行给药。

实施方案50：如实施方案49所述的方法，其中该化合物1药物前 体是化合物1的药学上可接受的酯的形式。

实施方案51：如实施方案38至50中任一项所述的方法，其中该 化合物1是静脉内给药的。

实施方案52：如实施方案38至50中任一项所述的方法，其中该 化合物1是口服给药的。

实施方案53：如实施方案38至52中任一项所述的方法，其中该 化合物1给药的剂量是在约0.5mg/m²至约5mg/m²的范围内。

实施方案54：如实施方案53所述的方法，其中该化合物1给药的 剂量是在约1mg/m²至约3mg/m²的范围内。

实施方案55：如实施方案54所述的方法，其中该化合物1给药的 剂量是约1.1mg/m²。

实施方案56：如实施方案54所述的方法，其中该化合物1给药的 剂量是约1.5mg/m²。

实施方案57：如实施方案54所述的方法，其中该化合物1给药的 剂量是约1.8mg/m²。

实施方案58：如实施方案54所述的方法，其中该化合物1给药的 剂量是约2.1mg/m²。

实施方案59：如实施方案54所述的方法，其中该化合物1给药的 剂量是约2.4mg/m²。

实施方案60：如实施方案32至59中任一项所述的方法，其中使 该计划的周期重复至少一次。

如本领域的普通技术人员将理解到的，鉴于以上的传授内容，本 发明的多种改变和变化是可能的。因此，应当理解的是，在权利要求 书的范围之内，本发明可以如除在此确切说明之外的其他方式来进行， 并且本发明的范围旨在涵盖所有此类变化。

出于所有目的，在此所引用的所有公开文件均通过引用以其整体 结合在此。