甘蔗木质素生物合成基因的分离和靶向抑制

摘要

本发明涉及调节甘蔗植物中木质素生物合成的材料和方法。在一个实施方案中，下调了木质素生物合成。可被靶向从而实现甘蔗中木质素的下调的基因及其编码的蛋白质包括，例如4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)。在一个实施方案中，4CL基因是4CL-M，4CL-N，或4CL-L。本发明也涉及木质素生物合成已被调节(例如下调)的甘蔗植物、特定植物组织和植物细胞。本发明也涉及产生具有调节的(例如减少的或下调的)木质素生物合成的甘蔗植物的方法。

说明书

与相关申请的交叉引用

本申请要求享有在2009年6月5日提交的美国临时申请序列号 61/217,950的权益，在此以其整体引入作为参考，包括任意图、表、核酸 序列、氨基酸序列和附图。

政府支持

此申请的主题得到USDA-CSRRES研究基金(grant)的支持，基金号 00075788。因此，政府在此发明中具有一定权利。

发明背景

甘蔗是出产生物质最高的生产者。通常，农民通过露天燃烧减少甘蔗 采割期后的叶残留物，这对空气质量具有负面影响。在经酸水解预处理以 去除作为酶水解的物理屏障的木质素后，可从甘蔗叶残留物中制造燃料级 乙醇。因此，下调木质素生物合成途径的酶是提高从半纤维素甘蔗残留物 中生产生物乙醇的效率的有前景的策略。在木质素途径中，4-香豆酸-CoA 连接酶(4CL)是一种关键酶，其催化4-香豆酸和其他羟基肉桂酸的CoA 硫酯的形成。然而，甘蔗具有复杂的多倍体基因组，且这些基因属于一个 大基因家族。其广泛的底物特异性使鉴定特异性参与木质素生物合成的直 向同源物很困难。因此，在本领域中存在这样的需要，即抑制甘蔗中木质 素生物合成的手段。

发明概述

本发明涉及调节甘蔗植物中木质素生物合成的材料和方法。在一个方 面，下调了木质素生物合成。可被靶向从而实现在甘蔗中木质素的下调的 基因及其编码的蛋白质包括，例如4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)。在特定 的实施方案中，4CL基因是4CL-M，4CL-N，或4CL-L。在另一个实施方案中， 在甘蔗植物的茎组织中减少或下调木质素生物合成。使用本领域已知的标 准技术，可抑制或下调一种或多种靶基因的表达。在特定的实施方案中， 抑制或下调4CL-L基因的表达。

本发明也涉及木质素生物合成已被下调的甘蔗植物、植物组织和植物 细胞。在特定的实施方案中，在甘蔗植物中抑制或下调一种或多种4CL基 因的表达。

本发明也涉及产生具有减少的或下调的木质素生物合成的甘蔗植物的 方法。在一个实施方案中，在甘蔗植物的叶组织中减少或下调木质素生物 合成。在另一个实施方案中，在甘蔗植物的茎组织中减少或下调木质素生 物合成。在一个实施方案中，本发明的方法包括抑制或遏制一种或多种4CL 基因的表达。在一个实施方案中，使用反义核酸或RNA干扰抑制所述基因。

序列简述

SEQ ID NO：1是本发明的4CL-L基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是本发明的4CL-M基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3是本发明的4CL-N基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是本发明的Sc4CL-Li RNAi构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5是本发明的Sc4CL-Mi RNAi构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6是SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是SEQ ID NO：3编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是拟南芥(Arabidopsis thaliana)4CL1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10是拟南芥4CL2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是拟南芥4CL3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是拟南芥4CL4的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是白杨(Poplar)4CL1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14是白杨4CL2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15是白杨4CL3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16是白杨4CL4的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17是基于4CL-L的部分基因组DNA序列的基因特异性引物。

SEQ ID NO：18是基于4CL-L的部分基因组DNA序列的基因特异性引物。

SEQ ID NO：19是用于4CL-N的正向引物。

SEQ ID NO：20是用于4CL-N的反向引物。

SEQ ID NO：21是用于4CL-M和4CL-L RNAi构建体的正向引物。

SEQ ID NO：22是用于4CL-M和4CL-L RNAi构建体的反向引物。

SEQ ID NO：23是甜高粱(Sorghum bicolor)04g005210(XP_002451647) 的4CL多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24是甜高粱10g026130(XP_002438783)的4CL多肽的氨基 酸序列。

SEQ ID NO：25是甜高粱04g031010(XP_002452704)的4CL多肽的氨基 酸序列。

SEQ ID NO：26是玉蜀黍(Zea mays)LOC542166(NP_001105258)的4CL 多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：27是黑麦草(Lolium perenne)4CL3(AAF37734)的4CL 多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：28是黑麦草4CL2(AAF37733)的4CL多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：29是黑麦草4CL1(AAF37732)的4CL多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：30是稻(Oryza sativa)4CL3(NP_001046069)的4CL多 肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：31是稻4CL4(NP_001058252)的4CL多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：32是稻4CL1(NP_001061353)的4CL多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：33是稻4CL2(NP_001047819)的4CL多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：34显示了拟南芥4CL1的保守的AMP结合基序。

SEQ ID NO：35显示了拟南芥4CL2的保守的AMP结合基序。

SEQ ID NO：36显示了拟南芥4CL3的保守的AMP结合基序。

SEQ ID NO：37显示了拟南芥4CL4的保守的AMP结合基序。

SEQ ID NO：38显示了白杨4CL1的保守的AMP结合基序。

SEQ ID NO：39显示了白杨4CL2的保守的AMP结合基序。

SEQ ID NO：40显示了白杨4CL3的保守的AMP结合基序。

SEQ ID NO：41显示了白杨4CL4的保守的AMP结合基序。

SEQ ID NO：42显示了甘蔗4CL1的保守的AMP结合基序。

SEQ ID NO：43显示了甘蔗4CLM的保守的AMP结合基序。

SEQ ID NO：44显示了拟南芥4CL1的特征基序。

SEQ ID NO：45显示了拟南芥4CL2的特征基序。

SEQ ID NO：46显示了拟南芥4CL3的特征基序。

SEQ ID NO：47显示了拟南芥4CL4的特征基序。

SEQ ID NO：48显示了白杨4CL1的特征基序。

SEQ ID NO：49显示了白杨4CL2的特征基序。

SEQ ID NO：50显示了白杨4CL3的特征基序。

SEQ ID NO：51显示了白杨4CL4的特征基序。

SEQ ID NO：52显示了甘蔗4CL1的特征基序。

SEQ ID NO：53显示了甘蔗4CLM的特征基序。

SEQ ID NO：54显示了4CL基因的共同的特征基序。

发明详述

本发明涉及调节植物(特别是甘蔗植物)中木质素生物合成的材料和 方法。在一个实施方案中，在植物中下调了木质素生物合成。本发明设想 使用可用于抑制或降低基因表达(包括在转录、转录后和翻译水平上)和/ 或基因编码的蛋白质的功能或活性的任何方法。可被靶向从而实现甘蔗中 木质素生物合成的下调的基因及其编码的蛋白质包括，但不限于，4-香豆 酸-CoA连接酶(4CL)。在一个实施方案中，4CL基因编码包含AMP结合基 序序列(例如SEQ ID NO：34)和/或SEQ ID NO：54的特征基序序列的4CL 多肽。在一个实施方案中，4CL基因是4CL-M，4CL-L，或4CL-N。在一个 实施方案中，4CL-L基因编码具有SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列的多 肽，或其片段或变体。在另一个实施方案中，4CL-M基因编码具有SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列的多肽，或其片段或变体。在另一个实施方案中， 4CL-N基因编码具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的多肽，或其片段 或变体。在特定的实施方案中，4CL-L基因包含SEQ ID NO：1中所示的核 苷酸序列的全部或部分，和4CL-M基因包含SEQ ID NO：2中所示的核苷酸 序列的全部或部分。在特定的实施方案中，4CL-N基因包含SEQ ID NO：3 中所示的核苷酸序列的全部或部分。

使用本领域已知的标准技术，可抑制或下调甘蔗植物中一种或多种靶 基因的表达。在一个实施方案中，在叶细胞和/或组织中选择性下调木质素 生物合成。在特定的实施方案中，抑制或下调一种或多种4CL基因的表达 和/或4CL基因编码的蛋白质的翻译或功能。在一个实施方案中，4CL基因 编码包含AMP结合基序序列(例如SEQ ID NO：34)和/或SEQ ID NO：54的 特征基序序列的4CL多肽。在更特定的实施方案中，抑制或下调4CL-M， 4CL-L，和/或4CL-N基因的表达。在一个实施方案中，使用反义技术下调 靶基因的表达。在另一个实施方案中，可使用共抑制技术抑制或下调靶基 因的表达。在另一个实施方案中，使用RNA干扰(RNAi)技术下调靶基因 的表达，包括例如使用短干扰RNA(siRNA)。在另一个实施方案中，可在 本发明的甘蔗植物中提供靶基因的突变，例如“敲除”突变。也可抑制靶 基因编码的蛋白质的表达和/或活性(例如酶活性)，例如通过使蛋白质接 触结合蛋白质并阻碍其功能活性的抗体或适体。

可使用反义技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。在 反义方法中，在植物细胞中提供与靶基因的mRNA的核苷酸序列杂交的核 酸。可在甘蔗植物的基因组中掺入(例如稳定地)在表达时提供与mRNA 杂交的核酸的核酸构建体。反义核酸可与靶序列的整条编码链、或其部分、 或靶序列的非编码部分、或靶序列的编码和非编码两部分杂交。反义构建 体可与同反义核酸杂交的mRNA的部分具有例如至少约70％、至少约75％、 至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、97％、98％ 或99％的序列同一性，或高达100％的序列同一性。反义核酸可包含任意合 适的核苷酸数。例如，本发明的反义核酸构建体可包含至少5，6，7，8，9， 10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26， 27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40或更多个核 苷酸。在一个实施方案中，反义核酸包含至少约40、或至少约50、或至少 约60、或至少约70、或至少约80、或至少约90、或至少约100、或至少 约150、或至少约200、或至少约250、或至少约300、或至少约350、或 至少约400、或至少约450、或至少约500、或至少约550、或至少约600 或更多个核苷酸。在一个实施方案中，反义构建体在植物的叶细胞和/或组 织中选择性表达，例如通过使用叶特异性启动子。下调或抑制靶基因表达 的反义方法是本领域已知的。可从用核酸构建体转化的和/或掺入核酸构建 体的细胞培养包含和表达反义核酸构建体的植物。

也可使用共抑制或转录后基因沉默(PTGS)技术抑制参与甘蔗中木质 素生物合成的靶基因的表达。大体上，在植物细胞中以正向和在适于核酸 表达的构建体中(例如，包含与能够在植物细胞中驱动转录的启动子序列 有效连接的核酸的构建体)提供对应靶基因序列且与其具有序列同源性的 核酸序列。核酸可与靶基因序列具有例如至少约70％、至少约75％、至少约 80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、97％、98％或99％ 的序列同一性，或高达100％的序列同一性。在一个实施方案中，核酸构建 体在植物的叶细胞和/或组织中选择性表达，例如通过使用叶特异性启动 子。可从用核酸构建体转化的和/或掺入核酸构建体的细胞培养包含和表达 核酸构建体的植物。

也可使用RNA干扰(RNAi)技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶 基因的表达。在RNAi中，在植物细胞中提供与靶基因表达的mRNA的全部 或部分互补的双链RNA分子。双链RNA分子被加工为较小的RNA分子，其 然后被加工进沉默复合物，所述沉默复合物导致靶基因表达的抑制，例如 通过切割靶基因mRNA。大体上，RNAi分子具有100或更多个核苷酸，更典 型地具有200或更多个核苷酸。可通过在细胞中引入和表达导致RNAi分子 转录和产生的核酸构建体提供RNAi分子。在一个实施方案中，通过表达提 供微RNA(miRNA)的核酸的RNA干扰视为包含在本发明的范围内。miRNA 一般是已经从包含发夹结构的较长的前体RNA上被加工的19-23个核苷酸 的RNA。在另一个实施方案中，通过表达提供短干扰RNA(siRNA)的核酸 的RNA干扰视为包含在本发明的范围内。siRNA一般是已经从较长的前体 双链RNA上被加工的具有3’突出端的20-25个核苷酸的RNA。可从用提供 RNAi分子的多核苷酸分子转化的和/或掺入上述多核苷酸分子的细胞培养 包含和表达RNAi分子(包括miRNA和siRNA)的植物。在例如美国专利号 7,056,704；7,078,196；7,365,058；7,232,086；6,506,559；7,282,564； 和7,538,095中已描述了用于RNA干扰的方法和材料，并在Milhavet等 人(2003)；Agrawal等人(2003)；Kusaba(2004)；以及Doran和 Helliwell(2009)中综述。在一个实施方案中，本发明的用于抑制植物中 的4CL基因表达的RNAi构建体包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的核苷酸 序列的全部或部分。在特定的实施方案中，在植物的叶细胞和/或组织中选 择性表达RNAi分子，例如通过使用叶特异性启动子。

也可使用核酶技术抑制参与甘蔗中木质素生物合成的靶基因的表达。 核酶是一类RNA，其可被设计为以特异性的序列依赖性方式酶促切割和失 活其他RNA靶。通过切割靶RNA，核酶抑制翻译，因此阻止靶基因的表达。 使用本领域已知的方法可在实验室化学合成核酶并在结构上改造以提高其 稳定性和催化活性。通过本领域已知的基因递送机制，可将编码核酶的核 苷酸序列引入植物细胞并掺入植物基因组。可从用核酶编码序列转化的和/ 或掺入核酶编码序列的细胞培养包含和表达核酶编码序列的植物。具有对 4CL的特异性的核酶可包括与一种或多种4CL mRNA的至少一部分的核苷酸 序列互补的一种或多种序列，和具有已知的负责mRNA切割的催化序列的序 列(见美国专利号5,093,246或Haselhoff等人1988)。例如，可构建 四膜虫(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸 序列与将要在4CL mRNA中切割的核苷酸序列互补(见例如美国专利号 4,987,071；和美国专利号5,116,742)。可选地，可使用编码4CL蛋白质 的4CL mRNA从RNA分子库中选择具有特定核糖核酸酶活性的催化RNA(见 例如Bartel等人1993)。在一个实施方案中，在植物的叶细胞和/或组 织中选择性表达核酶，例如通过使用叶特异性启动子。

除了抑制参与甘蔗中的木质素生物合成的靶基因以外，本发明还设想 在靶基因中的突变，或其中可对植物细胞提供突变的基因，在所述植物细 胞中靶基因表达或基因产物水平或活性被降低或抑制。在一个实施方案中， 将突变的4CL基因掺入甘蔗植物的基因组，其中突变的4CL基因展示基因 转录物或其翻译的减少的或无表达。在一个实施方案中，在植物的4CL基 因中引入突变，所述突变导致4CL基因的转录减少，或mRNA的翻译减少， 和/或导致展示降低的酶活性的蛋白质。在特定的实施方案中，在4CL基因 的蛋白质编码区引入一种或多种突变。在另一个实施方案中，在4CL基因 转录起始位点的上游和/或转录起始位点的下游引入突变。在一个实施方案 中，在4CL基因调控序列中或附近，例如在启动子序列中引入突变。突变 可阻碍或抑制4CL基因序列的转录，例如通过阻碍或抑制转录因子或聚合 酶结合4CL核酸序列。在一个实施方案中，在植物的叶细胞和/或叶组织中 选择性引入4CL基因中的突变。突变也可包括抑制或降低4CL多肽的功能 活性(例如酶活性)的一种或多种核苷酸或氨基酸插入、缺失和/或取代。 创造和引入突变的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，在植物中的 一个或多个野生型4CL基因中引入突变。在另一个实施方案中，突变的4CL 基因替换植物中的一个或多个野生型4CL基因。在一个实施方案中，在植 物的叶细胞和/或组织中选择性表达突变的4CL基因。

除了抑制或遏制参与木质素生物合成的靶基因以外，也可抑制由本发 明的靶基因编码的蛋白质的活性(例如酶活性)。在一个实施方案中，可 在甘蔗植物的细胞中掺入和表达编码与蛋白质结合并抑制其活性(例如酶 活性)的抗体或其抗原结合片段的核酸。可从用所述核酸转化的和/或掺入 所述核酸的细胞培养包含和表达编码抗体或其抗原结合片段的核酸的植 物。制备结合和抑制特定靶蛋白的抗体的方法和获得编码抗体的核酸的方 法是本领域熟知的。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体，或其抗原结 合片段。抗原结合片段包括，但不限于F(ab′)₂，Fab′，Fab，和Fv，并可 使用本领域已知的标准方法制备。抗体可来源于能够产生针对靶蛋白表位 的抗体的任意动物，并包括例如人、灵长类、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、 猪和牛。在特定的实施方案中，抗体结合4CL蛋白。在一个实施方案中， 4CL基因编码包含AMP结合基序序列(例如SEQ ID NO：34)和/或SEQ ID NO：54的特征基序序列的4CL多肽。在更特定的实施方案中，4CL蛋白由 4CL-M基因、4CL-L基因或4CL-N基因编码。在特定的实施方案中，4CL-L 基因包含SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列的全部或部分，4CL-M基因包 含SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列的全部或部分，4CL-N基因包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中，4CL-M，4CL-L 和4CL-N基因分别编码具有SEQ ID NO：6、7和8中所示的氨基酸序列的多 肽，或其片段或变体。在一个实施方案中，抗体与包含SEQ ID NO：6、7 和8中的氨基酸序列的4CL蛋白，或其片段或表位结合。在特定的实施方 案中，在植物的叶组织中选择性表达编码抗体的核酸，例如通过使用叶特 异性启动子。

也可通过表达和/或使靶蛋白接触结合特定靶蛋白的适体抑制参与木 质素生物合成的靶基因编码的蛋白质的活性(例如酶活性)。适体是可被 选择用于结合靶分子的寡核苷酸或肽(见，例如，Ellington和Szostak (1990)以及Hoppe-Seyler和Butz(2000)和美国专利号5,582,981； 5,270,163；5,595,877；5,817,785；6,344,318；6,933,116；7,368,236； 和7,700,759)。在一个实施方案中，在植物细胞中掺入和表达编码与参 与木质素生物合成的蛋白结合的适体的核酸。可从用所述核酸转化的和/ 或掺入所述核酸的细胞培养包含和表达编码适体的核酸的植物。在一个实 施方案中，适体结合并抑制4CL蛋白。在一个实施方案中，4CL基因编码 包含AMP结合基序序列(例如SEQ ID NO：34)和/或SEQ ID NO：54的特征 基序序列的4CL多肽。在特定的实施方案中，4CL蛋白由本发明的4CL-L、 4CL-M或4CL-N基因编码。在特定的实施方案中，4CL-L基因包含SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列的全部或部分，4CL-M基因包含SEQ ID NO：2中 所示的核苷酸序列的全部或部分，4CL-N基因包含SEQ ID NO：3中所示的 核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中，4CL-M，4CL-L和4CL-N基 因分别编码具有SEQ ID NO：6、7和8中所示的氨基酸序列的多肽，或其片 段或变体。在一个实施方案中，适体与包含SEQ ID NO：6、7和8中的氨基 酸序列的4CL蛋白，或其片段或表位结合。在特定的实施方案中，在植物 的叶组织中选择性表达编码适体的核酸，例如通过使用叶特异性启动子。

本发明也涉及甘蔗植物，其中木质素生物合成已被调节(例如，下调)。 在一个实施方案中，在叶细胞和/或组织中选择性下调木质素生物合成。在 一个实施方案中，在甘蔗植物中抑制或下调一种或多种4CL基因的表达和/ 或由4CL基因编码的蛋白质的翻译或活性。在一个实施方案中，4CL基因 编码包含AMP结合基序序列(例如SEQ ID NO：34)和/或SEQ ID NO：54的 特征基序序列的4CL多肽。在一个实施方案中，被抑制的4CL基因是4CL-L， 4CL-M或4CL-N。在一个实施方案中，4CL-M，4CL-L和4CL-N基因分别编 码具有SEQ ID NO：6、7和8中所示的氨基酸序列的多肽，或其片段或变体。 在特定的实施方案中，4CL-L基因包含SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列 的全部或部分，4CL-M基因包含SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列的全部 或部分，4CL-N基因包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列的全部或部分。 本发明的甘蔗植物可具有掺入其基因组的靶向一种或多种4CL基因(例如 4CL-M，4CL-N和/或4CL-L)的反义、共抑制、RNAi或核酶核酸。本发明 的甘蔗植物可在其基因组中具有突变的4CL基因，其中4CL基因的表达被 抑制，和/或其中4CL多肽具有抑制或降低4CL多肽的功能活性(例如酶活 性)的突变。本发明的甘蔗植物也可具有掺入其基因组的核酸，所述核酸 编码结合4CL蛋白并抑制其酶活性的一种或多种抗体(或其抗原结合片段) 和/或适体。

任选地，本文公开的植物可还展示主要有利于种子公司、栽培者或粮 食加工者的一种或多种农艺性状，例如除草剂抗性、病毒抗性、细菌病原 体抗性、昆虫抗性、线虫抗性和真菌抗性。见，例如美国专利号5,569,823； 5,304,730；5,495,071；6,329,504；和6,337,431。这样的性状也可为提 高植物活力或产量的性状(包括允许植物在不同的温度、土壤条件和日光 和降水水平下生长的性状)，或允许鉴定展示目的性状的植物的性状(例 如，可选择的标记物基因，种皮颜色等等)。在例如美国专利号5,569,823； 5,304,730；5,495,071；6,329,504；6,337,431；5,767,366；5,928,937； 4,761,373；5,013,659；4,975,374；5,162,602；4,940,835；4,769,061； 5,554,798；5,879,903，5,276,268；5,561,236；4,810,648；和6,084,155； 欧洲申请号0242246；美国专利申请号20010016956和 www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/的万维网上描述了 多种目的性状，以及将这些性状引入植物的方法。

本发明也涉及甘蔗植物组织和植物部分，包括但不限于，来自本发明 的具有被调节(例如下调)的木质素生物合成的、可从其再生植物的甘蔗 植物的植物细胞、植物原生质体、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、 植物块(clump)和植物中完整的植物细胞，或植物的部分，例如枝、核、 穗、穗轴、果壳、根尖、花药、种子、根、胚、下胚轴、子叶、花粉、胚 珠、花药、幼苗、梗、茎、叶、果和花。在一个实施方案中，在植物组织 或植物细胞中抑制或下调一种或多种4CL基因或其基因产物的表达。在一 个实施方案中，被抑制的4CL基因是4CL-M，4CL-L或4CL-N。在一个实施 方案中，4CL-M，4CL-L和4CL-N基因分别编码具有SEQ ID NO：6、7和8 中所示的氨基酸序列的多肽，或其片段或变体。在特定的实施方案中，4CL-L 基因包含SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列的全部或部分，4CL-M基因包 含SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列的全部或部分，4CL-N基因包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列的全部或部分。

本发明也涉及具有被调节的或下调的木质素生物合成的甘蔗细胞或原 生质体。在一个实施方案中，在甘蔗细胞或原生质体中抑制或下调一种或 多种4CL基因的表达，或由4CL基因编码的蛋白质的翻译或活性。在一个 实施方案中，被抑制的4CL基因是4CL-M，4CL-L或4CL-N。在一个实施方 案中，4CL-M，4CL-L和4CL-N基因分别编码具有SEQ ID NO：6、7和8中 所示的氨基酸序列的多肽，或其片段或变体。在特定的实施方案中，4CL-L 基因包含SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列的全部或部分，4CL-M基因包 含SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列的全部或部分，4CL-N基因包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列的全部或部分。

本发明也涉及产生具有降低的或下调的木质素生物合成的甘蔗植物的 方法。在一个实施方案中，在甘蔗植物的叶细胞和/或组织中降低或下调木 质素生物合成。在另一个实施方案中，在甘蔗植物的茎组织中降低或下调 木质素生物合成。在一个实施方案中，本发明的方法包括抑制或遏制一种 或多种4CL基因的表达，或抑制由4CL基因编码的蛋白质的翻译或活性(例 如酶活性)。在一个实施方案中，4CL基因编码包含AMP结合基序序列(例 如SEQ ID NO：34)和/或SEQ ID NO：54的特征基序序列的4CL多肽。在一 个实施方案中，被抑制的4CL基因是4CL-M，4CL-L或4CL-N。在一个实施 方案中，4CL-M，4CL-L和4CL-N基因分别编码具有SEQ ID NO：6、7和8 中所示的氨基酸序列的多肽，或其片段或变体。在特定的实施方案中，4CL-L 基因包含SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列的全部或部分，4CL-M基因包 含SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列的全部或部分，4CL-N基因包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方案中，使用反义核 酸、共抑制、RNA干扰或核酶抑制靶基因的表达。在另一个实施方案中， 通过基因突变抑制靶基因的表达。在另一个实施方案中，通过表达与蛋白 质结合的抗体或其抗原结合片段，和/或适体，或通过在基因中提供抑制基 因的mRNA翻译为蛋白质的突变或破坏或抑制编码的蛋白质的功能的突变 (例如通过氨基酸序列中的改变)，在植物中抑制靶基因编码的蛋白质的 活性。可使用本领域已知的标准方法和材料将提供靶基因表达抑制的核酸 构建体引入植物基因组，并由此制备转化的和转基因的植物。

可在表达构建体中提供对本发明有用的多核苷酸。本发明的表达构建 体一般包括在将要表达表达构建体的预期的宿主细胞中有功能的调控元 件。因此，本领域普通技术人员可选择用于细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、 植物宿主细胞、昆虫宿主细胞、哺乳动物宿主细胞和人宿主细胞的调控元 件。调控元件包括启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子和多聚 腺苷酸化元件。如本文使用的，术语“表达构建体”指提供有效连接的核 酸序列的转录的核酸序列的组合。如本文使用的，术语“有效连接的”指 描述的组件的并置，其中所述组件处于允许其以其预期的方式发挥功能的 关系之中。大体上，有效连接的组件处于相邻关系。

本发明的表达构建体可包含与本发明的多核苷酸序列有效连接的启动 子序列。可使用本领域已知的标准技术将启动子掺入多核苷酸。可在本发 明的表达构建体中使用多拷贝启动子或多个启动子。在优选的实施方案中， 可将启动子置于这样的位置，即其相距表达构建体中的转录起始位点的距 离与其相距其天然遗传环境中的转录起始位点的距离相同。在此距离上允 许一些基本上不降低启动子活性的变化。在表达构建体中一般包含转录起 始位点。

如果将在植物细胞中提供表达构建体或将表达构建体引入植物细胞， 那么可使用植物病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S(包括增强 的CaMV 35S启动子(见，例如美国专利号5,106,739))，或CaMV 19S 启动子或木薯叶脉花叶(启动子)。可用于植物中的表达构建体的其他启 动子包括，例如prolifera启动子、Ap3启动子、热休克启动子、根癌农 杆菌(A.tumefaciens)的T-DNA 1′-或2′-启动子、多半乳糖醛酸酶启动 子、矮牵牛花的查耳酮合酶A(CHS-A)启动子、烟草PR-1a启动子、泛素启 动子、肌动蛋白启动子、alcA基因启动子、pin2启动子(Xu等人，1993)、 玉米WipI启动子、玉米trpA基因启动子(美国专利号5,625,136)、玉 米CDPK基因启动子，且也可使用RUBISCO SSU启动子(美国专利号 5,034,322)。在本发明中可使用组织特异性启动子，例如果特异性启动子， 如番茄的E8启动子(登记号：AF515784；Good等人(1994))。在本发明 的核酸构建体中可使用的叶特异性启动子包括Cab1启动子(Brusslan和 Tobin，1992)、Cab19启动子(Bassett等人，2007)、PPDK启动子(Matsuoka 等人，1993)和核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)启动子(Matsuoka等人(1994) 和美国专利号7,723,575)。可用于本发明的表达构建体的其它的植物叶特 异性启动子包括，但不限于，Act1启动子(美国公开的申请号 20090031441)、AS-1启动子(美国专利号5,256,558)、RBC-3A启动子(美 国专利号5,023,179)、CaMV 35S启动子(Odell等人，1985)、增强的CaMV 35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)启动子(Richins等人，1987)、甘露碱 合酶(mas)启动子、章鱼碱合酶(ocs)启动子等等，例如来自CaMV 19S (Lawton等人，1987)、nos(Ebert等人，1987)、Adh(Walker等人，1987)、 蔗糖合酶(Yang等人、1990)、α-微管蛋白、泛素、肌动蛋白(Wang等人、 1992)、cab(Sullivan等人、1989)、磷酸烯醇式丙酮酸羟化酶(PEPCase) (Hudspeth等人、1989)的启动子，或与R基因复合物有关的启动子 (Chandler等人、1989)。又见公开的美国申请2007/006346和Yamamoto等 人(1997)；Kwon等人(1994)；Yamamoto等人。果特异性启动子如花器 官特异性启动子可用于本发明的表达构建体，从而在植物的花器官中表达 本发明多核苷酸。花器官特异性启动子的实例包括在美国专利号 6,462,185；5,639,948；和5,589,610中描述的任意启动子序列。也可使用 种子特异性启动子如β-云扁豆蛋白基因(例如菜豆的)或大豆球蛋白基因 (例如大豆的)等等的启动子。根特异性启动子，如在美国专利号 6,455,760或美国专利号6,696,623，或在公开的美国专利申请号 20040078841；20040067506；20040019934；20030177536；20030084486； 或20040123349中描述的任意启动子序列可用于本发明的表达构建体。木 质部特异性启动子包括稻的肉桂酸-4-羟化酶(C4H)。也设想将组成型启 动子(如CaMV、泛素、肌动蛋白或NOS启动子)、发育调控型启动子和诱 导型启动子(如可被热、光、激素或化学品诱导的那些启动子)用于本发 明的多核苷酸表达构建体。

鉴定和表征植物基因组DNA中的启动子区的方法是本领域已知的，并 包括，例如在以下参考文献中描述的那些：Jordano等人(1989)；Bustos 等人(1989)；Green等人(1988)；Meier等人(1991)；和Zhang等人 (1996)。公开的美国申请2009/0199307也描述了使用差异显示鉴定组织特 异性启动子的方法(见，例如美国专利号5,599,672)。在差异显示中， 比较了来自不同组织类型的mRNA。通过鉴定仅在特定组织类型，或组织类 型集合中存在的mRNA种类，可鉴定出以组织特异性方式表达的相应基因。 可通过逆转录酶转录RNA以产生cDNA，并可使用cDNA分离含有全长基因 的克隆。也可使用cDNA从相应基因中分离部分同源或同源的启动子、增强 子或终止子，使用例如抑制PCR。又见美国专利号5,723,763。

本发明的表达构建体也可任选地包含转录终止序列，翻译终止序列， 编码信号肽的序列，和/或增强子元件。一般可从真核或病毒基因序列的3’ 非翻译区获得转录终止区。可将转录终止序列置于编码序列的下游以提供 有效的终止。信号肽序列是一般存在于蛋白质的氨基端的短氨基酸序列， 其负责有效连接的成熟多肽再定位到范围广泛的翻译后细胞目的地，所述 目的地的范围从特定细胞器区室到蛋白质作用位点和细胞外环境。通过使 用有效连接的信号肽序列，将基因产物靶向预期的细胞和/或细胞外目的 地，设想将此用于本发明的多肽。经典的增强子是提高基因转录的顺式作 用元件，并也可包含在表达构建体中。经典的增强子元件是本领域已知的， 包括但不限于CaMV 35S增强子元件、巨细胞病毒(CMV)早期启动子增强 子元件和SV40增强子元件。增强基因表达的内含子介导的增强子元件也是 本领域已知的。这些元件必须存在于转录区内且是方向依赖的。实例包括 玉米shrunken-1增强子元件(Clancy和Hannah，2002)。

在表达构建体中也可包含引导从表达构建体上转录的mRNA的多聚腺 苷酸化的DNA序列，并包括但不限于CaMV 35S、章鱼碱合酶或胭脂碱合酶 信号。本发明的表达构建体也可包含引导其他基因转座的多核苷酸序列， 即转座子。

表达构建体也可包含用于选择转化细胞的一种或多种显性可选择标记 物基因，包括例如编码抗生素抗性的基因。抗生素抗性基因可提供对一种 或多种以下抗生素的抗性：潮霉素、卡那霉素、博来霉素、G418、链霉素、 巴龙霉素、新霉素和壮观霉素。可通过新霉素磷酸转移酶(NPT II)提供卡 那霉素抗性。用于细胞转化筛选的其它标记物包括编码β-葡糖醛酸酶 (GUS)、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、胭脂碱合酶、氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)或增强的GFP(Yang等人(1996))的基因。

本发明也涉及包含编码预期蛋白质的本发明的多核苷酸的多核苷酸载 体，所述载体将提供给用本发明的生物反应器装置提供的细胞。在本发明 的表达构建体或多核苷酸的5’和3’端可包含独特的限制酶位点，以允许 其插入多核苷酸载体。如本文使用的，术语“载体”指任意遗传元件，包 括例如质粒、粘粒、染色体、噬菌体、病毒等等，当与合适的控制元件相 联系时其能够复制，且其可在细胞间转移多核苷酸序列。载体包含允许载 体在选定的宿主细胞中复制的核苷酸序列。用于表达和/或克隆的若干载体 是现有的，并包括但不限于，pBR322，pUC系列，M13系列，和pBLUESCRIPT 载体(Stratagene，La Jolla，CA)。

本发明的多核苷酸可由RNA或DNA组成。优选地，多核苷酸由DNA组 成。本发明也包含与本文公开的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

用基因转化植物细胞的技术是本领域已知的，并包括例如农杆菌 (Agrobacterium)感染、基因枪法、电穿孔、氯化钙处理、PEG介导的转 化等。见，例如美国专利号5,036,006；5,591,616；5,100,792；公开的 美国申请号2006/0260011；和公开的PCT申请号WO 93/07278和WO 93/21335。美国专利号5,661,017教导了用异源多核苷酸转化藻类细胞的 方法和材料。使用本领域已知的标准方法可选择、重新分化和培养转化细 胞为包含和表达本发明的多核苷酸的植物。在本发明的范围内也包含任意 转化的或转基因的本发明的植物细胞或植物的种子和其他植物组织和后 代。

也可根据与本文示例的这些序列的更具体的同一性和/或相似性范围 定义本发明的多核苷酸和多肽。序列同一性将一般地大于60％，优选地大 于75％，更优选地大于80％，甚至更优选地大于90％，和可大于95％。与本 文示例的序列相比，序列的同一性和/或相似性可为49，50，51，52，53， 54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70， 71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87， 88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，或99％。除非另外指定， 可使用如在Karlin和Altschul(1993)中修改的Karlin和Altschul(1990) 算法测定如本文使用的2个序列的百分比序列同一性和/或相似性。这样的 算法包含在Altschul等人(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可使用 NBLAST程序，分数＝100，字长＝12进行BLAST搜索，以得到具有预期百分 比序列同一性的序列。为了比较目的获得有缺口的比对，可使用如 Altschul等人(1997)描述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST 程序，可使用各个程序(NBLAST和XBLAST)的默认参数。见NCBI/NIH网站。

本发明也设想与编码本发明的多肽的多核苷酸序列具有足够同源的序 列，从而在标准的严格条件和标准方法下允许与该序列杂交(Maniatis，T. 等人，1982)的那些本发明的多核苷酸分子(和编码本发明的多肽的那些多 核苷酸分子)。如本文使用的，用于杂交的“严格的”条件指这样的条件， 其中一般在6x SSPE，5x Denhardt溶液，0.1％SDS，0.1mg/ml变性DNA 中在低于DNA杂合体的解链温度(Tm)的20-25C下过夜进行杂交。解链 温度有以下公式(Beltz，G.A.等人，1983)描述：

Tm＝81.5C+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/双链体的 长度(以碱基对为单位)。

一般如下进行洗涤：

a)在1x SSPE，0.1％SDS中在室温进行15分钟，2次(低严格度的洗 涤)。

b)在0.2x SSPE，0.1％SDS中在Tm-20C下进行15分钟，1次(中严 格度的洗涤)。

如本文使用的，术语“核酸”和“多核苷酸序列”指单链或双链形式 的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另外限制，其包含可与天然 存在的核苷酸类似的方式发挥功能的天然核苷酸的已知类似物。多核苷酸 序列包括被转录为RNA的DNA链序列和被翻译为蛋白质的RNA序列二者。 多核苷酸序列包括全长序列以及来源于全长序列的较短序列二者。应当理 解，特定多核苷酸序列包含天然序列的简并密码子，或可被引入以在特定 宿主细胞中提供密码子偏好的序列。在本发明范围内的多核苷酸序列还包 含与编码本发明的多肽的序列特异性杂交的序列。多核苷酸包含作为单独 的链的或在双链体中的正义和反义链二者。

在本发明的范围内也视为包含具有除了在本发明的多肽中特别示例的 氨基酸取代以外的氨基酸取代的多肽。例如，可用非天然氨基酸取代本发 明的多肽的氨基酸，只要具有取代的氨基酸的多肽基本上保留与氨基酸未 被取代的多肽相同的活性。非天然氨基酸的实例包括，但不限于，鸟氨酸、 瓜氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸、苯甘氨酸、牛磺酸、碘化酪氨酸、2，4- 二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、 ε-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、正亮氨酸、正缬 氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、τ-丁基甘氨酸、τ-丁基丙氨酸、 苯甘氨酸、丙氨酸环己酯、β-丙氨酸、氟代氨基酸，专门设计的氨基酸如 β-甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸，和一般的氨基酸类似物。 非天然氨基酸也包括具有衍生化的侧基的氨基酸。此外，蛋白质中的任意 氨基酸可为D(右旋)型或L(左旋)型。

氨基酸可一般被分为以下种类：非极性、无电荷极性、碱性和酸性。 在本发明的范围内包括保守取代，其中具有一类氨基酸的多肽被同类的另 一种氨基酸替换，只要具有取代的多肽仍基本上保留与没有取代的多肽相 同的生物学活性。非极性氨基酸包括Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Met，Phe， 和Trp。无电荷极性氨基酸包括Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn，和Gln。 酸性氨基酸包括Asp和Glu。碱性氨基酸包括Lys，Arg，和His。

一旦在表达系统中掺入本发明的核酸序列，就可将其转化进植物细胞。 词语“植物”指任意植物，特别是种子植物，“植物细胞”是植物的结构 和生理学单位，其包含细胞壁，但也可指原生质体。植物细胞可为分离的 单个细胞或培养细胞的形式，或作为更高等的有机体单位例如植物组织或 植物器官的一部分。术语“转化”指导致在遗传上被稳定继承的核酸片段 至宿主细胞基因组的转移。包含转化的核酸片段的宿主细胞被称为“转基 因”细胞，和包含转基因细胞的生物被称为“转基因生物”。

转化植物和植物细胞的方法的实例包括农杆菌介导的转化(Deblaere 等人(1987))和微粒轰击技术(Klein等人(1987)；美国专利号 4,945,050)。通过技术人员熟知的方法可从转基因细胞再生全植物(见， 例如Fromm等人(1990))。

可以多种本领域公认的方式将本发明的表达构建体引入植物细胞。术 语“引入”在多核苷酸(例如编码本文公开的酶的核苷酸)的情况下，旨 在表示以这样的方式将多核苷酸呈递给植物，即，使多核苷酸能进入植物 细胞内部。当要引入多于一种多核苷酸时，这些多核苷酸可被组装为单个 核苷酸构建体的一部分，或作为单独的核苷酸构建体，并可位于相同或不 同的转化载体上。

因此，可在单个转化事件中，在单独的多个转化事件中，或例如在植 物中将这些多核苷酸引入目的宿主细胞，作为育种方案的一部分。本发明 的方法不依赖于特定的将一种或多种多核苷酸引入植物的方法，只要多核 苷酸能进入植物的至少一个细胞的内部。将多核苷酸引入植物的方法是本 领域已知的，并包括但不限于，瞬时转化法、稳定转化法和病毒介导法。

“瞬时转化”在多核苷酸的情况下旨在表示，多核苷酸被引入植物但 不整合进植物的基因组。

在将多核苷酸引入植物的情况下，“稳定引入”或“稳定引入的”旨 在表示，引入的多核苷酸被稳定掺入植物基因组，因此植物被多核苷酸稳 定地转化。

“稳定转化”或“稳定转化的”旨在表示，引入植物的多核苷酸(例 如，本文描述的核苷酸构建体)整合进植物的基因组，并能够被其后代继 承，更特别地，被多个连续世代的后代继承。

可用于植物转化的多种转化载体是在植物转化领域的普通技术人员已 知的，且与本发明有关的基因可与任意这些载体共同使用。载体的选择将 取决于优选的转化技术和用于转化的靶物种。对某些靶物种，可优选不同 的抗生素或除草剂选择标记物。

再生转化植物的方法是本领域熟知的。例如，Ti质粒载体已被用于外 源DNA的递送，以及直接的DNA摄取、脂质体、电穿孔、显微注射和微粒。 另外，来自农杆菌属的细菌可被用于转化植物细胞。下面描述了转化双子 叶和单子叶植物的代表性技术，以及代表性质体转化技术。

许多载体可用于使用根癌农杆菌的转化。其一般携带至少一种T-DNA 边界序列，并包括如pBIN19(Bevan(1984))的载体。为了构建用于农杆 菌转化的载体，见，例如美国专利申请公开号2006/0260011。

不使用根癌农杆菌的转化规避了在选择的转化载体中对T-DNA序列的 需要，因此也可使用缺乏这些序列的载体。不依赖农杆菌的转化技术包括， 但不限于，通过颗粒轰击、原生质体摄取(例如PEG和电穿孔)和显微注 射。载体的选择大部分取决于用于转化的物种的优选的选择。有关这些载 体的构建，见例如美国公开的申请号2006/0260011。

用于双子叶植物的转化技术是本领域熟知的，并包括基于农杆菌的技 术和不需要农杆菌的技术。非农杆菌的技术包括通过原生质体或细胞直接 摄取外源遗传物质，并可例如通过PEG或电穿孔介导的摄取、颗粒轰击介 导的递送或显微注射实现。Paszkowski等人(1984)，Potrykus等人 (1985)，Reich等人(1986)，和Klein等人(1987)描述了这些技术的实 例。在每种情况下，使用本领域已知的标准技术将转化细胞再生为整株植 物。

农杆菌介导的转化是转化双子叶植物的优选技术，因为其高转化效率 及其对许多不同物种的广泛实用性。农杆菌转化一般包括将携带目的外源 DNA的二元载体转移至合适的农杆菌菌株，这可能依赖于宿主农杆菌菌株 在共驻留的Ti质粒或染色体上携带的vir基因的补足(complement)(Uknes 等人(1993))。通过使用携带重组二元载体的大肠杆菌、携带能够将重组 二元载体移动至靶农杆菌菌株的质粒的辅助大肠杆菌菌株的三亲株交配程 序实现重组二元载体至农杆菌的转移。可选地，可通过DNA转化将重组二 元载体转移至农杆菌(Hofgen和Willmitzer(1988))。

重组农杆菌对靶植物物种的转化通常包括共培养农杆菌与来自植物的 外植体，并遵照本领域熟知的方案。在携带存在于二元质粒T-DNA边界之 间的抗生素或除草剂抗性标记物的选择培养基上再生转化的组织。

用基因转化植物细胞的另一种方法包括在植物组织和细胞上推进 (propel)惰性或生物活性颗粒。在美国专利号4,945,050，5,036,006， 和5,100,792中公开了此技术。大体上，此技术包括在能够有效穿透细胞 的外表面的条件下在细胞上推进惰性或生物活性颗粒，并在其内部提供掺 入。当使用惰性颗粒时，可通过用包含预期基因的载体覆盖颗粒将载体引 入细胞。可选地，可用载体包围细胞，从而通过颗粒将载体携带进细胞。 也可将生物活性颗粒(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，其分别含有 试图引入的DNA)推进植物细胞组织。

大多数单子叶物种的转化现在也已变为常规技术。优选的技术包括使 用PEG或电穿孔技术将基因直接转移进原生质体，和颗粒轰击进愈伤组织。 可使用单个DNA种类或多个DNA种类(即共转化)进行转化，且这些技术 都适用于本发明。共转化可具有以下优势：避免构建完整载体，和产生具 有不连锁的目的基因和可选择标记物的基因座的转基因植物，这使得能够 在以后的世代中去除可选择的标记物，这应当被认为是理想的。

专利申请EP 0292435，EP 0392225，和WO 93/07278描述了从玉米的 原种自交系制备愈伤组织和原生质体，使用PEG或电穿孔转化原生质体， 和从转化的原生质体再生玉米植物的技术。Gordon-Kamm等人(1990)和 Fromm等人(1990)公开了使用颗粒轰击转化A188来源的玉米系的技术。 此外，WO 93/07278和Koziel等人(1993)描述了通过颗粒轰击转化玉米 的原种自交系的技术。此技术使用从授粉后14-15天的玉米穗上切除的 1.5-2.5mm长的未成熟的玉米胚和PDS-1000He基因枪装置用于轰击。

通过用本发明的核酸序列转化得到的植物可为任意的品种广泛的植物 物种，包括单子叶和双子叶植物物种。可通过育种将本发明的基因表达与 其他对生产和质量的重要特征组合掺入植物系。也可通过育种或通过普通 的基因工程技术将本文公开的本发明的多核苷酸掺入植物系或维持在植物 系中。育种方法和技术是本领域已知的。见，例如Welsh(1981)；Wood (1983)；Mayo(1987)；Singh(1986)；以及Wricke和Weber(1986)。

通过有性生殖或营养生长传递改造进上述转基因种子和植物的遗传特 性，并可因此在后代植物中维持和传播所述遗传特性。一般地，维持和繁 殖利用为了适合特定目的如耕种、播种或收割而开发的已知农业方法。

相关技术是本领域熟知的，并包括但不限于，杂交、近交、回交育种、 多系育种(multi-line breeding)、双单倍体近交、品种混合、种间杂交、 非整倍体技术，等等。杂交技术也包括通过机械、遗传(包括转基因)、 化学或生物化学手段使植物不育以产生雄性或雌性不育的植物。

用于本发明的目的，“甘蔗”指任意甘蔗属植物或杂种。在本发明的 范围内的甘蔗植物包括，例如斑茅(Saccharum arundinaceum)、Saccharum bengalense、肉质花穗野生种(Saccharum edule)、白甘蔗(Saccharum officinarum)、狭叶斑茅(Saccharum procerum)、沙生蔗茅(Saccharum ravennae)、大茎野生种(Saccharum robustum)、竹蔗(Saccharum sinense) 和割手密(Saccharum spontaneum)。本发明的甘蔗植物可为近交系或杂 种。杂种植物包括通过组成目前所有的商业甘蔗和energycane种质的白甘 蔗杂交材料由传统的割手密生成的杂种，和通过用近亲或远亲物种杂交甘 蔗产生的任意其他杂种。可与甘蔗杂交以产生杂种植物或新的甘蔗品种的 其他物种的实例包括芒属(Miscanthus)、蔗茅属(Erianthus)和甜高粱 属(Sorghum)。

“分离的”表示“通过人工操作”从其自然状态改变的，即，如果其 出现在自然界，其已从其本来的环境中被改变或移动，或被改变和移动。 例如，在活动物中以天然状态天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”， 但如本文使用的术语，从其天然状态的共同存在的材料中分开的相同的多 核苷酸或多肽是“分离的”。例如，就多核苷酸而言，术语分离的表示， 从其天然存在的染色体和细胞中分开的。如果序列从其天然存在的染色体 和细胞中分开，但被插入其不天然存在的染色体或细胞的基因环境中，则 其也是分离的。

如本文使用的，术语“转基因的”指包含外源多核苷酸(即基因)的 植物，所述外源多核苷酸在转化的植物中被稳定维持并在连续世代中通过 后代稳定继承。术语“转基因植物”可指最初转化的植物或最初转化的植 物的后代。用于转化植物、植物细胞或植物组织的技术可包括，但不限于， 使用根癌农杆菌或发根农杆菌(A.rhizogenes)作为转化剂用DNA转化， 电穿孔、DNA注射、微粒轰击和颗粒加速。见，例如EP 295959和EP 138341。 如本文使用的，术语“植物材料”或“植物部分”包括植物细胞、植物原 生质体、可从其再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块 和植物中完整的植物细胞，或植物的部分，如胚、花粉、胚珠、种子、叶、 花、枝、果、核、穗、穗轴、果壳、梗、根、根尖、花药、块茎、根茎等 等。

材料和方法

植物材料。在表达分析中使用野外培养的成熟甘蔗(甘蔗属杂交种) 变种CP88-1762和温室培养的未成熟的CP88-1762和L 79-1002。

RNA提取、基因分离和RT-PCR。使用TRIzol试剂(Invitrogen)从叶、 茎、节和根分离总RNA。使用cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)从1ug总RNA合 成第一链cDNA。

甘蔗4CL的分离

Sc4CL-L

通过RACE(cDNA末端的快速扩增)技术得到部分4CL-L。使用SMART RACE试剂盒(Clontech)根据制造商的说明书进行RACE。从2ug总RNA合成 5’-和3’-RACE预备cDNA库，并使用这些库作为PCR模板。基于4CL-L 的部分基因组DNA序列设计初级(LPF：5’-CGTTGCCTGTGAAGTCCGGCGC-3’ (SEQ ID NO：17))和巢式(LNF：5’-CCACGGCGAAGACCATCGACTCG-3’(SEQ ID NO：18))基因特异性引物。使用LPF和制造商提供的通用引物混合物(UPM) 进行初级PCR。PCR条件由25个循环的94℃30秒，68℃60秒和72℃180 秒组成。将初级PCR产物从1稀释到50并用作次级PCR的模板，次级PCR 使用LNF和制造商提供的巢式通用引物(NUP)。第二个PCR在与第一个 PCR相同的条件的20个循环下进行。将3’-RACE PCR产物克隆进pCR2.1 TOPO载体(Invitrogen)并测序。

Sc4CL-M

通过DNA文库筛选分离4CL-M。从野外培养的植物(Belle Grade和 Citra，FL)收获甘蔗(甘蔗属杂交种)变种CP88-1762的叶、节间、节和 未成熟的卷叶。从水培溶液培养的植物中收集根和新生幼苗。使用Trizol (Invitrogen)从每种组织中提取总RNA，并以相同的比例混合来自每种样 品的总RNA。使用Oligotex mRNA Mini试剂盒(Qiagen)从混合的总RNA提 纯mRNA。从5.9ug mRNA合成cDNA并使用cDNA合成试剂盒和ZAP-cDNA 合成试剂盒(Stratagene)连接至Uni-ZAP XR载体。使用ZAP-cDNA Gigapack III Gold克隆试剂盒根据制造商的说明书(Stratagene)进行包装和扩增。 用于筛选，使用随机引物试剂盒(Promega)通过PCR生成447bp的部分4CLM 特异性探针并用³²P-dCTP标记。筛选了约2.0x 10⁵的重组噬菌体，并分离 了1个阳性噬菌体。为了得到包含cDNA的pBluscript噬菌粒，进行了体 内切除并对分离物测序。

Sc4CL-N

使用从甘蔗EST序列推断的基因特异性引物从cDNA上PCR扩增4CL-N。 在DFCI白甘蔗基因索引(SoGI； http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/gireport.pl？gudb＝s_o fficinarum)中使用“4-香豆酸辅酶A连接酶”作为关键词检索的主题。检 测出具有完整的开放阅读框的假设的共有(TC)序列TC88322，并用于引 物设计。分别从起始和终止密码子区设计了正向引物(4CL1F：5’ -ATGGGTTCCGTGGACACGGCGGTCGCG-3’(SEQ ID NO：19))和反向引物(4CL1R： 5’-TCAGTGAACACCGGCGGCGAGCCTGG-3’(SEQ ID NO：20))。使用Trizol 根据制造商的说明书(Invitrogen)从叶、节间、节和幼苗分离总RNA，并 使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-rad)进行cDNA合成。使用200ng来 自每个组织的cDNA混合物作为PCR模板。使用TaKaRa LA taq聚合酶 (Takara BIO Inc.)进行PCR，且PCR条件由35个循环的95℃45秒，56 ℃45秒和72℃120秒组成。将2次独立扩增的PCR产物克隆进pCR2.1 TOPO载体(Invitrogen)并测序。

Sc4CL RNAi抑制构建体的构建

基于Sc4CL-L(SEQ ID NO：1)和Sc4CL-M(SEQ ID NO：2)的测序信息， 设计了特异性引物以分别扩增名为外显子2和外显子1的200bp区域。将 对应2个限制酶EcoRI和XbaI的序列加入正向引物，对反向引物加入特异 性对应EcoRV限制酶的序列，以便于亚克隆。使用由通过Bg4CL天然内含 子分隔开的2个反向重复和转录终止子CaMV35SpolyA组成的质粒pWF BgH4CL_RNAi构建Sc4CL干扰构建体。在2个单独和相继的亚克隆步骤中， 用Sc4CL特异性序列替换质粒pWF BgH4CL_RNAi中的反向重复。然后亚克 隆稻C4H启动子并产生2个构建体Sc4CL-Li和Sc4CL-Mi(SEQ ID NO：4和 SEQ ID NO：5)。

4CLi甘蔗系的产生

使用甘蔗(甘蔗属杂交种)变种CP88-1762的未成熟的卷叶的横切面 在补充了20g/L蔗糖和13.6uM 2，4-D，pH调节为5.8的改良的MS基础 培养基(CI-3)(Chengalrayan和Gallo-Meagher，2001)上诱导愈伤组织。 在诱导了愈伤组织后，使用如以前描述的PDS-1000/He基因枪颗粒递送系 统(Bio-Rad)(James等人，2008)进行基因枪基因转移。如描述的使用遗传 霉素进行选择(Chengalrayan和Gallo-Meagher，2001)，但略加修改，其 中对再生的植物进行了进一步的选择，即将其在生根阶段在含有巴龙霉素 (30mg/L)的MS基础培养基中亚培养，进行4次两周一次的亚培养。将发 育出健康的根的选定的植物转移至土壤并转移至温室。

转基因系的表征

在选择和再生植物以后，通过NPTII-ELISA和PCR确认转基因甘蔗植 物。使用Pathoscreen nptII ELISA试剂盒(Agdia)根据制造商的说明书进 行总蛋白质提取和NPTII-ELISA。使用DNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen) 从每株再生的植物的展开的叶中提取基因组DNA。使用75ng基因组DNA 作为PCR模板。为了检测每种表达构建体，从每个基因和启动子区设计引 物如下：用于Sc4CL-Mi和Sc4CL-Li RNAi构建体，4CL SF(5’ -CATCAAGGGTACGGGATGAC-3’(SEQ ID NO：21))和OSPRO SR(5’ -GTAGCCTGCTAGTCTTCTCTCTCATT-3’(SEQ ID NO：22))。使用iTaq聚合酶 (Bio-Rad)按如下条件进行PCR：35个循环的95℃30秒，58℃30秒和72 ℃60秒。用于Northern印迹分析，从植物的第三片叶(用于4CL-Li系) 和约25cm长的侧分蘖(用于4CL-Mi系)中提取总RNA(Sambrook et at.， 1989)。在相同的发育阶段从在与转基因植物相同的条件下培养的野生型植 物中收集样品。在电泳和转移了20ug总RNA后，使用来自靶向的4CL基因 的开放阅读框的放射性标记的探针进行Northern杂交。

如Browning(1967)描述的分别从4CL-Li系和4CL-Mi系的衰老的叶 和节间中使用Klason程序在转基因甘蔗和非转基因(野生型)甘蔗植物中 定量总木质素，但略加修改(Yoshihara等人，1984)。简单地说，在研磨 干样品(0.5-1mm筛选)后，用50％的温热乙醇提取样品以去除可溶性糖， 并干燥。然后，使用12M H₂SO₄水解0.1g干细胞壁样品，在30℃进行2 小时。用蒸馏水稀释内含物并高压灭菌1小时。高压灭菌后，通过过滤收 集不溶的材料(木质素和灰分)并称重。然后在500℃燃烧木质素5小时。 在此步骤后，称重灰分并通过燃烧前和后的重量差异计算木质素。

本文提及和引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物以其整体 引入作为参考，包括所有的图和表，只要其不与本说明书的明确教导不一 致。

以下是说明用于实践本发明的程序的实施例。这些实施例不应被视为 限制性的。除非另外指出，所有百分比是以重量计的，且所有溶剂混合物 比例是以体积计的。

实施例1——Sc4CL基因的分离

在本研究中分离和表征了2个全长的和1个部分的甘蔗4CL基因的序 列。Sc4CL-N和Sc4CL-M的cDNA序列具有1665和1728核苷酸的开放阅读 框，分别编码555和576氨基酸的蛋白质。部分的Sc4CL-L cDNA序列长 616bp，其包含3’UTR，和141氨基酸残基的开放阅读框。Sc4CL-N和Sc4CL-M 之间的配对比较显示59％的相似性。Sc4CL-N与以前鉴定的4CL关联最紧密， 分别显示了与甜高粱的Sb4CL样1和稻的Os4CL3的96％和86％的相似性， 而Sc4CL-M与Sb4CL样1和Os4CL3共有较低的相似性，但其显示了与Sb4CL 样2和Os4CL3(分别为96％和83％)的较高的相似性。Sc4CL与拟南芥At4CL 的推断的氨基酸序列的比较显示了范围从60％-63％的相似性(表2)。

Sc4CL和已功能表征的其他4CL、白杨Ptd4CL和拟南芥At4CL之间的 比对(通过 CLUSTALW(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/ NPSA/npsa_clustalw.html)使用默认参数进行)显示了保守的AMP结合基 序(见，例如SEQ ID NO：34，35，36，37，38，39，40，41，42，和43) 和特征基序“GEICIRG”(SEQ ID NO：54)，其被认为是底物识别位点(Ehlting 等人2001)。系统发生分析显示，在禾本科中的4CL基因家族成员可被分 为2个主要的在系统发生上有联系的群组，组I和组II。Sc4CL-N和Sc4CL-M 分别被归为植物4CL组I和组II。组I包括玉蜀黍4CL2、稻4CL1、拟南 芥4CL1、黑麦草4CL2、白杨4CL3、白杨4CL1、白杨4CL2、拟南芥4CL2、 甜高粱04g005210、玉蜀黍LOC542166和玉蜀黍ACF84437。组II包括稻 4CL2、甜高粱04g031010、拟南芥4CL3、黑麦草4CL1、白杨4CL4、拟南芥 4CL4、稻4CL3、稻4CL5、甜高粱10g026130、黑麦草4CL3和稻4CL4。

表2.4CL氨基酸序列之间的百分比相似性

Sc：甘蔗，Sb：甜高粱，Os：稻，At：拟南芥

实施例2——4CL基因的表达谱

甘蔗4CL-M主要在茎中表达，而Sc4CL-L主要在叶中表达(表3)。 这提示，可以组织特异性方式调控不同4CL基因的表达，并提供了在特定 组织中抑制木质素的机会。

表3.Sc4CL基因的组织和栽培品种特异性表达

-L、S和N分别表示叶、茎和节。

实施例3——4CL下调的甘蔗的生成

RNAi是用于作物改良和研究基因功能的有力工具。因此，为了研究每 个4CL基因产物在木质素生物合成中的生理作用，利用Sc4CL的序列信息 生成了4CL下调的甘蔗，生成了2个靶向Sc4CL-L和Sc4CL-M基因的不同 区域的、处于木质部特异性启动子、稻香豆酸-4-羟化酶(C4H)启动子(Fouad 和Altpeter，尚未发表)和CaMV 35S多聚腺苷酸信号控制下的RNA抑制构 建体(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)。使用基因枪基因转移，将生成的具有 处于具有第一内含子、35S 3’UTR的强组成型玉米泛素启动子(pUbi)调控 下的可选择的nptII基因的抑制盒各自或同时共同引入胚发生甘蔗愈伤组 织。当生成若干转基因系时，使用nptII/遗传霉素和巴龙霉素选择系统进 行转基因事件的选择。

利用2个生成的抑制盒进行了共88次轰击，并在愈伤组织选择后再生 了160株植物。使用Pathoscreen nptII ELISA试剂盒(表4)，152株独 立的植物显示了NPTII表达。使用PCR确认了在转基因植物的基因组DNA 中4CL-RNAi抑制盒的存在(表4)。

在转基因甘蔗植物中的甘蔗4CL的表达分析指示了相比非转基因(WT) 甘蔗，在若干转基因甘蔗植物中Sc4CL-L(表5)和Sc4CL-M基因(表6)的 抑制。

表4.转基因4CLi甘蔗的总结

NA＝未分析的

表5.在甘蔗4CL-Li转基因植物的衰老的叶中的4CL-L基因表达水平 和木质素含量

1-相对WT表达(100％)的基于RNA印迹分析的表达

2-2-3次生物学重复的平均值，通过分析相同基因型的2-3株个体植 物生成。

表6.在甘蔗4CL-Mi转基因植物的未成熟的节间中的4CL-M基因表达 水平和木质素含量

1-基于相对WT表达(100％)的RNA印迹分析的表达

2-2次生物学重复的平均值，通过分析相同基因型的2株个体植物生 成。

实施例4-具有减少的木质素的甘蔗的生成

根据标准方案在品系中使用Klason程序在4CL-Li转基因植物和非转 基因甘蔗的衰老的叶中定量总木质素。如在表5中所示，Klason木质素在 非转基因甘蔗植物的衰老的叶中为约23.6％。相对而言，具有4CL-L基因 抑制的转基因系14-2A在衰老的叶中具有平均21％的Klason木质素(表5)， 表明通过4CL-L抑制总木质素减少了11％。也在4CL-Mi系(表6)和野生 型植物中的未成熟的节间中分析了木质素。品系4a展示了相比野生型植物 的约8％的总木质素的减少。品系5b-A1也显示了类似水平的木质素减少(表 6)。预期在成熟的节间中在这些转基因4CL-Mi植物中的更高的木质素减 少，在成熟的节间中非转基因植物的木质素含量增加至超过20％。

实施例5——4CLM表达的定量PCR分析

定量实时RT-PCR分析确认了在若干转基因系中的4CLM抑制。表7显 示了4CLM基因相对参考基因(甘蔗GAPDH)的相对表达比例。表7显示了 在包括品系4A和5BA1的转基因甘蔗系中的4CLM转录物的强抑制。收获发 育匹配的侧分蘖并从第一节间提取总RNA。从3’UTR设计4CLM基因特异 性引物。平行进行所有反应，且一式三份进行每个反应。使用Q-基因软件 计算标准误。

表7.4CLM表达的定量PCR分析

实施例6——植物4CL基因间的进化趋异的估计

在表8中显示了甘蔗4CL和其他植物4CL间的分析中的每个位点上的 氨基酸取代数。所有结果基于氨基酸序列的配对分析。使用MEGA4 (Zuckerkandl和Pauling(1965)；Tamura等人(2007))中的泊松校正法 进行分析。从数据集中去除含有缺口和缺失数据的所有位置(完全缺失选 项)。在最终的数据集中共有513个位置。

表8.植物4CL间的进化趋异的估计

Sc：甘蔗，Sb：甜高粱，Zm：玉蜀黍，At：拟南芥，Lp：黑麦草，Os：稻， Po：白杨杂种(毛果杨(Populus trichocarpa)x美洲黑杨(Populus deltoids))

表8继续

Sc：甘蔗，Sb：甜高粱，Zm：玉蜀黍，At：拟南芥，Lp：黑麦草，Os：稻， Po：白杨杂种(毛果杨(Populus trichocarpa)x美洲黑杨(Populus deltoids))

表8继续

Sc：甘蔗，Sb：甜高粱，Zm：玉蜀黍，At：拟南芥，Lp：黑麦草，Os：稻， Po：白杨杂种(毛果杨(Populus trichocaroa)x美洲黑杨(Populus deltoids))

应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅是为了说明的目的，对本 领域技术人员建议根据其的多种修改或变化，且这些修改和变化将被包括 在本申请的精神和范围内和随附的权利要求书的范围内。另外，本文公开 的任意发明或其实施方案的任意元素或限制可与本文公开的任意其他发明 或其实施方案的任意和/或所有其他元素或限制(分别地或以任意组合)组 合，且所有这些组合视为在本发明的范围内，而不加限制。

参考文献

美国专利号4,761,373

美国专利号4,769,061

美国专利号4,810,648

美国专利号4,940,835

美国专利号4,945,050

美国专利号4,975,374

美国专利号4,987,071

美国专利号5,013,659

美国专利号5,023,179

美国专利号5,034,322

美国专利号5,036,006

美国专利号5,093,246

美国专利号5,100,792

美国专利号5,106,739

美国专利号5,116,742

美国专利号5,162,602

美国专利号5,256,558

美国专利号5,270,163

美国专利号5,276,268

美国专利号5,304,730

美国专利号5,495,071

美国专利号5,554,798

美国专利号5,561,236

美国专利号5,569,823

美国专利号5,582,981

美国专利号5,589,610

美国专利号5,591,616

美国专利号5,595,877

美国专利号5,599,672

美国专利号5,625,136

美国专利号5,639,948

美国专利号5,661,017

美国专利号5,723,763

美国专利号5,767,366

美国专利号5,817,785

美国专利号5,879,903

美国专利号5,928,937

美国专利号6,084,155

美国专利号6,329,504

美国专利号6,337,431

美国专利号6,344,318

美国专利号6,455,760

美国专利号6,462,185

美国专利号6,506,559

美国专利号6,696,623

美国专利号6,933,116

美国专利号7,056,704

美国专利号7,078,196

美国专利号7,232,086

美国专利号7,282,564

美国专利号7,365,058

美国专利号7,368,236

美国专利号7,538,095

美国专利号7,700,759

美国专利号7,723,575

美国公开的申请号20010016956

美国公开的申请号20030084486

美国公开的申请号20030177536

美国公开的申请号20040019934

美国公开的申请号20040067506

美国公开的申请号20040078841

美国公开的申请号20040123349

美国公开的申请号20060260011

美国公开的申请号2007006346

美国公开的申请号20090031441

美国公开的申请号20090199307

PCT公开的申请号WO 93/07278

PCT公开的申请号WO 93/21335

EP 0242246

EP 0292435

EP 0392225

EP 138341

EP 295959

Agrawal等人(2003)Microbiology and Molecular Biology Reviews， 67(4)：657-685.

Altschul，S.F.等人(1990)“Basic Local Alignment Search Tool” J.Mol.Biol.215：403-410.

Altschul，S.F.等人(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST：A New Generation of Protein Database Search Programs”Nucl.Acids Res.25：3389-3402.

Bartel，D.和Szostak，J.W.Science 261：1411-1418(1993).

Bassett，C.L.，Callahan，A.，Artlip，T.，Scorza，R.Srinivasan，C. (2007)“A minimal peach type II chlorophyll a/b-binding protein promoter retains tissue-specificity and light regulation in tomato”BMC Biotechnol.，7：47.

Beltz，G.A.，Jacobs，K.A.，Eickbush，T.H.，Cherbas，P.T.，Kafatos， F.C.(1983)“Isolation of multigene families and determination of homologies by filter hybridization methods”Methods of Enzymology，R.Wu，L.Grossman和K.Moldave[eds.]Academic Press，New York 100：266-285.

Bevan，M.(1984)“Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”Nucl.Acids Res.，12(22)：8711-21.

Browning，B.L.1967.Methods of wood chemistry.Wiley-Interscience， New York.

Brusslan，J.A.和Tobin，E.M.(1992)“Light-independent developmental regulation of cab gene expression in Arabidopsis thaliana seedlings”Proc Natl Acad Sci USA，89(16)：7791-5.

Bustos等人(1989)Plant Cell，1：839-854.

Chandler等人(1989)“Two Regulatory Genes of the Maize Anthocyanin Pathway Are Homologous：Isolation of B Utilizing R Genomic Sequences”The Plant Cell，1：1175-1183.

Chengalrayan，K.和Gallo-Meagher，M.(2001)“Effect of various growth regulators on shoot regeneration of sugarcane”In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant，37：434 439.

Clancy，M.和Hannah，L.C.(2002)“Splicing of the maize Sh1 first intron is essential for enhancement of gene expression，and a T-rich motif increases expression without affecting splicing” Plant Physiol.130(2)：918-29.

Deblaere，R.，Reynaerts，A.，Hofte，H.，Hernalsteens，J.-P.，Leemans， J.，和Van Montagu，M.(1987)“Vectors for cloning in plant cells”Methods Enzymol.，153：77-292.

Doran，T.和Helliwell，C.(2009)RNA interference：Methods for plants and animals；Publisher：CABI，Wallingford，UK. Ebert等人(1987)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA.84：5745-5749.

Ehlting，J.，Buttner，D.，Wang，Q.，Douglas，C.J.，Somssich，I.， 和Kombrink，E.(1999).Three 4-coumarate：coenzyme A ligases in Arabidopsis thaliana represent two evolutionarily divergent classes in angiosperms.Plant J.19，920.

Ellington，A.D.和Szostak，J.W.(1990)“In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands”Nature， 346(6287)：818-822.

Fromm等人Biotechnology 8：833-839(1990).

Good，X.等人(1994)“Reduced ethylene synthesis by transgenic tomatoes expressing S-adenosylmethionine hydrolase”Plant Molec.Biol.26：781-790.

Gordon-Kamm等人PlANt Cell 2：603-618(1990).

Green等人，EMBO J.，7：4035-4044(1988).

Haselhoff和Gerlach Nature 334：585-591(1988).

Hofgen&Willmitzer，Nucl.Acids Res.16：9877(1988).

Hoppe-Seyler，F.和Butz，K.(2000)“Peptide aptamers：powerful new tools for molecular medicine”J.Mol.Med.，78(8)：426-430.

Hudspeth等人(1989)Plant Mol.Biol.，12：579-589.

James VA，Neibaur I，Altpeter F：Stress inducible expression of the DREB1A transcription factor from xeric，Hordeum spontaneum L. in turf and forage grass(Paspalum notatum Flugge)enhances abiotic stress tolerance.Transgenic Res 2008，17：93-104.

Jordano等人，Plant Cell，1：855-866(1989).

Karlin S.，Altschul，S.F.(1990)“Methods for Assessing the Statistical Significance of Molecular Sequence Features by Using General Scoring Schemes”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268.

Karlin S.，Altschul，S.F.(1993)“Applications and Statistics for Multiple High-Scoring Segments in Molecular Sequences”Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877.

Klein等人(1987)Nature 327：70-73.

Koziel等人(1993)Biotechnology 11：194-200.

Kusaba(2004)Current Opinion in Biotechnology，15：139-143.

Kwon等人(1994)Plant Physiol.105：357-67.

Lawton等人(1987)Plant Mol.Biol.9：315-324.

Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.(1982)Molecular Cloning： A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.

Matsuoka等人(1993)“Tissue-specific light regulated expression directed by the promoter of a C4 gene，maize pyruvate， orthophosphate dikinase，in a C3 plant，rice”PNAS USA， 90(20)：9586-90.

Matsuoka等人(1994)Plant J.6：311-319.

Mayo，O.(1987)The Theory of Plant Breeding，Second Edition， Clarendon Press，Oxford.

Meier等人(1991)Plant Cell，3：309-316.

Milhavet等人(2003)Pharmacological Reviews，55(4)：629-648.

Odell等人(1985)Nature 313：810-812.

Paszkowski等人(1984)EMBO J.3：2717-2722.

Potrykus等人(1985)Mol.Gen.Genet.199：169-177.

Reich等人(1986)Biotechnology 4：1001-1004.

Richins等人(1987)Nucleic Acids Res.20：8451.

Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.(1989)Molecular Cloning： A Laboratory Manual.卷1和3.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.

Singh，D.P.(1986)Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests，Springer-Verlag，NY.

Sullivan等人(1989)“Isolation and characterization of a maize chlorophyll a/b binding protein gene that produces high levels of mRNA in the dark”Mol.Gen.Genet.，215(3)：431-440.

Tamura K.，Dudley J.，Nei M.，和Kumar S(2007)MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24：1596-1599.

Theander，O.，和E.A.Westerlund(1986).Studies on dietary fiber. 3.Improved procedures for analysis of dietary fiber.J.Agric. Food Chem.34：330 336

Uknes等人(1993)Plant Cell 5：159-169.

Walker等人(1987)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，84：6624-6628.

Wang等人(1992)“Characterization of cis-Acting Elements Regulating Transcription from the Promoter of a Constitutively Active Rice Actin Gene”Molecular and Cellular Biology， 12(8)：3399-3406.

Welsh J.R.(1981)Fundamentals of Plant Genetics and Breeding，John Wiley&Sons，NY.

Wood D.R.(1983)(Ed.)Crop Breeding，American Society of Agronomy Madison，Wis.

Wricke和Weber(1986)Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding，Walter de Gruyter and Co.，Berlin.

www.lifesci.sus sex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/

Xu，D.，McElroy，D.，Thornburg，R.W.，Wu，R.等人(1993)“Systemic induction of a potato pin2 promoter by wounding，methyl jasmonate，and abscisicacid in transgenicrice plants”Plant Molecular Biology 22：573-588.

Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35：773-778.

Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265.

Yang等人(1990)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，87：4144-4148.

Yang，T.T.等人(1996)“Optimized Codon Usage and Chromophore Mutations Provide Enhanced Sensitivity with the Green Fluorescent Protein”Nucleic Acid Research 24(22)：4592-4593.

Yoshihara，K.，T.Kobayashi，T.Fujii，和I.Akamatsu(1984).A novel modification of Klason lignin quantitative method.J.Japan Tappi 38：86 95.

Zhang等人(1996)Plant Physiology，110：1069-1079.

Zubieta，C，Kota，P，Ferrer，J.L.，Dixon，R.A.，Noel，J.P.(2002) “Structural basis for the modulation of lignin monomer methylation by caffeic acid/5-hydroxyferulic acid 3/5-O-methyltransferase”Plant Cell.，14(6)：1265-77.

Zuckerkandl E&Paul ing L(1965)Evolutionary divergence and convergence in proteins，pp.97-166 in Evolving Genes and Proteins，edited by V.Bryson和H.J.Vogel.Academic Press，New York.